שיטה יעילה עבור הבידוד של רנ"א מאוד מטוהר מזרעים לשימוש ב כמוני transcriptome ניתוח

המטרה הכוללת של הליך זה היא לחלץ RNA בטוהר גבוה מזרעי צמחים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של הדגנים, כגון הבנת פרופילי גנים, המכילים את התעתיקים המקוריים בזרעים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהחוקרים מסוגלים להכין RNA מטוהר גבוה עם שינוי קל בשיטה המבוססת על עמודת ספין.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהכמות הגבוהה של שמנים, חלבונים, פחמימות ופוליפנולים במסננת הקדמית מקשה על בידוד RNA מטוהר מאוד; מי שידגים את ההליך יהיה קאזומי היקינו, טכנאי מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל בניסוי, הוסף אחוז אחד של משקל לנפח PVP בדרגת ביולוגיה מולקולרית למאגר ליזה של תאים למיצוי RNA, ומערבל את התערובת במרץ. דגרו את ה-PVP למשך 20 דקות בחום של 25 מעלות צלזיוס כדי להמיס אותו לחלוטין.

לאחר 20 דקות של דגירה, מערבבים את המאגר בעדינות על ידי הפיכת הצינור כדי למנוע היווצרות בועות. קצרו פירות מצמחי Arabidopsis thaliana והניחו אותם בשני צינורות פוליפרופילן בגודל 1.5 מילימטר על קרח, ואז הניחו את הפירות על לוחות אלומיניום שנשמרו בארבע מעלות צלזיוס ובודדו זרעים מהפירות תחת מיקרוסקופ סטריאו. לאחר מכן, הניחו כ -200 זרעים מבודדים בצינורות פוליפרופילן של 1.5 מיליליטר שאוחסנו בעבר במתלה אלומיניום על קרח, והניחו מיד את הצינורות בחנקן נוזלי.

הסר את הצינורות מהחנקן הנוזלי והחזיר אותם לרשת האלומיניום על קרח. הוסף 100 מיקרוליטר של מאגר PVP באחוז אחד לכל צינור וצנטריפוגה את הצינורות למשך דקה אחת ב-1000 פעמים G, בארבע מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, הומוגניזציה של הדגימה עם עלי נירוסטה באמצעות מטחנת מנוע למשך 60 שניות תוך שמירה על הצינור במתלה האלומיניום על קרח; לאחר מכן, הוסף 550 מיקרוליטר של מאגר 100% PVP והפוך בעדינות את הצינור כדי לערבב ולדגור את הצינור.

לאחר הדגירה, צנטריפוגה את התמיסה ואז העבירה 550 מיקרוליטר של הסופרנטנט לצינור פוליפרופילן חדש של 1.5 מילימטר וצנטריפוגה את הסופרנטנט. העבירו 450 מיקרוליטר של הסופרנטנט לצינור פוליפרופילן חדש בגודל 1.5 מילימטר. השתמש בסופרנטנט כליזאט התא למיצוי RNA באמצעות ערכה זמינה מסחרית.

הכינו מתלה אלומיניום על קרח, והפשירו את תערובת ה-RNA הכוללת על ידי הקשה עדינה, ואז הניחו את הצינור על המתלה. מדוד את ריכוז ה-RNA באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו-נפח. לאחר מכן יש לדלל את ה-RNA הכולל במים נטולי RNase.

הפשירו את סך ה-RNA וערכות החיץ מהערכה המסחרית, שמרו את האנזימים מהערכה על קרח לאחר הקשה עדינה. הכן צינורות פוליפרופילן מעוקרים ללא נוקלאז 0.2 מיליליטר לניתוח שלאחר מכן. על קרח, שלב חמישה מיקרוליטר של RNA כולל, מיקרוליטר אחד או 50 מיקרומולר של פריימר DT אוליגו ומיקרוליטר אחד, או 50 מיקרו-מולרי אקראי שש מר בצינור פוליפרופילן של 0.2 מיליליטר.

דגרו את התערובת למשך 15 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס, ואז הניחו את הצינור על קרח. התאם את ריכוזי הפלסמיד עבור תבניות DNA עבור העקומות הסטנדרטיות. לאחר מכן, יש לדלל את תמיסות ה-CDNA ב-1 עד 100 במים מזוקקים, ולאחר מכן להוסיף שני מיקרוליטרים של תמיסות ה-CDNA המדוללות והפלסמידים שהוכנו בעבר עבור העקומות הסטנדרטיות לתערובת המאסטר מערכת ה-PCR הכמותית בזמן אמת.

לבסוף, הגדר את ה-PCR בזמן אמת והכנס את הדגימות. סך ה-RNA בודד מכ-1,000 זרעים באמצעות ריכוזים משתנים של מאגר ליזה תאים, PVP. הכמויות והטוהר של הרנ"א המבודד מדגימים כי 1.0% PVP הוא הריכוז היעיל ביותר לבידוד כמויות גדולות של רנ"א מטוהר מזרעים.

הריכוזים, יחסי A260 ו-A280, ויחסי A260 A230 של RNA שבודדו מ-200 זרעים הראו כי שיטה זו הייתה הטובה ביותר בבידוד RNA מטוהר מאוד משמונה ו-12 ימים לאחר הפריחה, או זרעי DAF. למרות שכמויות התעתיק המקומט והאחד התלוי בסוכר נמוכות יחסית בזרעים המתפתחים, ניתן היה לזהות שינויים בביטוי בין זרעים בשלבי התפתחות שונים באמצעות PCR בזמן אמת; שיטה זו מתאימה גם לזרעי שמן אחרים, כפי שמודגם בטבלה זו. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של הצמח לחקור פרופילי ביטוי גנים בריכוז גבוה של עתודות מאוחסנות, כגון זרעים ופירות.