Name: שיטת שבב exo: זיהוי אינטראקציות חלבון-דנא עם Precision סמוך לבסיס זוג (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: למד את שיטת ChIP-exo לזיהוי מדויק של אינטראקציות חלבון-דנ"א ברזולוציה של כמעט זוג בסיסים. טכניקה זו משלבת ניקוי כרומטין עם טיפול אקסונוקלאז וריצוף גבוה-תפוקה לחקר רגולציה גנית ואפיגנטיקה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למעבדת ונטרס ולחברי המחלקה לפיזיולוגיה מולקולרית וביופיזיקה על דיונים מועילים. תודה מיוחדת לפרנק פיו על ההדרכה, ההדרכה והדיונים הרבים ומלאי התובנות על הניואנסים של ChIP-exo בזמן שהייתי פוסט-דוקטורנט במעבדה שלו.

<ol><li>Venters, B. J., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+eukaryotic+genes+are+transcribed%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">How eukaryotic genes are transcribed.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 44, 117-141 (2009).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genome-wide+protein-DNA+interactions+detected+at+single-nucleotide+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution.</a> Cell. 147, 1408-1419 (2011).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+dynamics+of+enhanceosome+assembly+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule dynamics of enhanceosome assembly in embryonic stem cells.</a> Cell. 156, 1274-1285 (2014).</li>
<li>Wales, S., Hashemi, S., Blais, A., McDermott, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+MEF2+target+gene+analysis+in+cardiac+and+skeletal+muscle+reveals+novel+regulation+of+DUSP6+by+p38MAPK-MEF2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Global MEF2 target gene analysis in cardiac and skeletal muscle reveals novel regulation of DUSP6 by p38MAPK-MEF2 signaling.</a> Nucleic acids research. 42, 11349-11362 (2014).</li>
<li>Cho, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+ArgR-DNA+complexes+at+the+genome-scale+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The architecture of ArgR-DNA complexes at the genome-scale in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 43, 3079-3088 (2015).</li>
<li>Katainen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF%2Fcohesin-binding+sites+are+frequently+mutated+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">CTCF/cohesin-binding sites are frequently mutated in cancer.</a> Nat Genet. 47, 818-821 (2015).</li>
<li>Murphy, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ancient+protein-DNA+interaction+underlying+metazoan+sex+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An ancient protein-DNA interaction underlying metazoan sex determination.</a> Nat Struct Mol Biol. 22, 442-451 (2015).</li>
<li>Zere, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Targets+and+Features+of+BarA-UvrY+%28-SirA%29+Signal+Transduction+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic Targets and Features of BarA-UvrY (-SirA) Signal Transduction Systems.</a> PLoS One. 10, e0145035(2015).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+structure+and+organization+of+eukaryotic+pre-initiation+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes.</a> Nature. 483, 295-301 (2012).</li>
<li>Rhee, H. S., Bataille, A. R., Zhang, L., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subnucleosomal+structures+and+nucleosome+asymmetry+across+a+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Subnucleosomal structures and nucleosome asymmetry across a genome.</a> Cell. , 1377-1388 (2014).</li>
<li>Pugh, B. F., Venters, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+Organization+of+Human+Transcription+Initiation+Complexes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic Organization of Human Transcription Initiation Complexes.</a> PLoS One. 11, e0149339(2016).</li>
<li>Albert, I., Wachi, S., Jiang, C., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GeneTrack--a+genomic+data+processing+and+visualization+framework%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">GeneTrack--a genomic data processing and visualization framework.</a> Bioinformatics. 24, 1305-1306 (2008).</li>
<li>Guo, Y., Mahony, S., Gifford, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+genome+wide+binding+event+finding+and+motif+discovery+reveals+transcription+factor+spatial+binding+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+computational+biology%22%5BJournal%5D)">High resolution genome wide binding event finding and motif discovery reveals transcription factor spatial binding constraints.</a> PLoS computational biology. 8, e1002638(2012).</li>
<li>Bardet, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+transcription+factor+binding+sites+from+ChIP-seq+data+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Identification of transcription factor binding sites from ChIP-seq data at high resolution.</a> Bioinformatics. 29, 2705-2713 (2013).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MACE%3A+model+based+analysis+of+ChIP-exo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MACE: model based analysis of ChIP-exo.</a> Nucleic Acids Res. 42, e156(2014).</li>
<li>Bentley, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+whole+human+genome+sequencing+using+reversible+terminator+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry.</a> Nature. 456, 53-59 (2008).</li>
<li>Rhee, H. S., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-exo+method+for+identifying+genomic+location+of+DNA-binding+proteins+with+near-single-nucleotide+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ChIP-exo method for identifying genomic location of DNA-binding proteins with near-single-nucleotide accuracy.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter 21, Unit 21.24(2012).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22, 1813-1831 (2012).</li>
<li>Serandour, A. A., Brown, G. D., Cohen, J. D., Carroll, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Illumina-based+ChIP-exonuclease+method+provides+insight+into+FoxA1-DNA+binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of an Illumina-based ChIP-exonuclease method provides insight into FoxA1-DNA binding properties.</a> Genome Biol. 14, R147(2013).</li>
<li>He, Q., Johnston, J., Zeitlinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-nexus+enables+improved+detection+of+in+vivo+transcription+factor+binding+footprints%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">ChIP-nexus enables improved detection of in vivo transcription factor binding footprints.</a> Nat Biotechnol. 33, 395-401 (2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

<html> אנו מציגים פרוטוקול גנומית תפקודי כדי לקבוע את המיקום המחייב המדויק עבור הכרומטין אינטראקצית חלבוני משוא פנים, רחב-הגנום ברזולוצית זוג הבסיס קרובה. השלב הקריטי ביותר להשיג ברזולוצית מיפוי זוג ליד הבסיס הוא טיפול exonuclease של ה- DNA השבב מועשר בעוד immunoprecipitate נשאר על השרף המגנטי. לכאורה, קומפלקסי חלבונים עלולים לחסום in vivo footprinting של כל תת-יחידה מסוימת (למשל, מתחמי שיפוץ הכרומטין או חלקיק הליבה הנוקלאוזום). עם זאת, כפי שדווח בעבר 10,</su...

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) היא שיטה רבת עוצמה כדי לחקור מנגנונים של ויסות הגנים על ידי העשרת סלקטיבי עבור שברי דנ&quot;א אינטראקציה עם חלבון נתון בתאים חיים. שיטות איתור של קטעי DNA מועשר שבב התפתחו ככל שהטכנולוגיה משתפרת, מן הגילוי של מוקד יחיד (תקן שבב qPCR) הכלאה על microarrays oligonucleotide (שבב שבב) כדי רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך) 1. למרות-seq השבב רואה יישום נרחב, ההטרוגניות הכרומטין אינטראקציות DNA ספציפיות יש הכבד איכות נתונים המוביל תוצאות חיוביות שגויות ומיפוי מדויק. כדי לעקוף מגבלות אלו, ד&quot;ר פרנק Pugh פיתח את שיטת שבב exo 2. התכונה הבולטת של-exo השבב היא שזה משלב 5 &#39;ל 3&#39; exonuclease, footprinting ביעילות גורם שעתוק מחייבים מקומות. כתוצאה מכך, המתודולוגיה השבב exo משיגה רזולוציה גבוהה יותר, טווח דינמי גדול יותר של detection, ורעש רקע תחתון. למרות שבב exo הוא יותר מאתגר מבחינה טכנית כדי להתמחות מ שבב seq, בחודשים האחרונים הוא לאימוץ נרחב כמו מחקרים שואפים לקבל תובנה ברזולוציה גבוהה אולטרה ייחודיות באמצעות מערכות ביולוגיות מגוונות 3-8. ואכן,-exo השבב יושם בהצלחה חיידקים, שמרים, עכבר, חולדה, ומערכות תאים אנושיות. כהוכחה עקרונית,-exo השבב שמש במקור כדי לזהות את מוטיב המחייב המדויק בעבור חופן שעתוק שמרים גורם 2. הטכניקה שימש גם בשמרים ללמוד את הארגון של המתחם מראש ייזום שעתוק, וכדי לפענח מבנה subnucleosomal של היסטונים שונים 9,10. לאחרונה, אנו ממונפים-exo השבב לפתור TFIIB הסמוך Pol II מחייב אירועי יזמים אנושיים, והראינו כי שעתוק מסתעף נרחב נובע ייזום ברור קומפלקסי 11. זרימת העבודה המוצגת כאן היא מותאמת ו- streamlined עבור שבב exo היונק (איור 1). ראשית, התרבות תאים ראשוניים או רקמות חיות מטופלות עם פורמלדהיד לשמר באינטראקציות חלבון-דנ&quot;א vivo באמצעות crosslink קוולנטיים. התאים lysed ו הכרומטין טעון ~ 100 - 500 שברי גודל בסיס זוג. שבב אז מעשיר באופן סלקטיבי עבור קטעי DNA crosslinked לחלבון של עניין. בשלב זה, ספריות-seq שבב ערוכים בדרך כלל, אשר מטבעו מגביל את הרזולוציה זיהוי לגודל שבר הממוצע של כמה מאות זוגות בסיסים. עם זאת, שבב exo מתגבר על מגבלה זו על ידי זמירה משמאל ומימין 5 גבולות DNA של האתר crosslink חלבון-דנ&quot;א עם exonuclease למבדה. ספריות רצף בנויות אז מ- DNA מתעכל exonuclease כמפורט להלן. הגבולות המקוננים 5 &#39;וכתוצאה מכך מייצגים טביעת in vivo של אינטראקצית החלבון-דנ&quot;א (איור 1, שלב 14), והם מזוהים על ידי רצף קצב העברת נתונים גבוה. Altיו המתודולוגיה שבב exo הוא מעורב יותר מאשר שבב seq, מעברים בין רוב השלבים דורש כביסה חרוז פשוט, אשר ממזערת אובדן מדגם ולהבדלים ניסיוני. יודגש, כי בגלל-exo השבב היא גרסה מעודנת של-seq שבב, כל מדגם כי הוא מוצלח עם-seq שבב צריכה גם להצליח עם-exo שבב. תפקידו של המוסד vivo footprinting של אינטראקציות חלבון-דנ&quot;א עם תוצאות שבב exo במבנה נתונים ברורים במהותו מן-seq שבב. למרות המתקשר שבב seq משותף ניתן להחיל נתוני שבב exo, כדי לקבל את שיחות שיא המדויקות ביותר אנו ממליצים כלי ביואינפורמטיקה שתוכננו במיוחד עם המבנה הייחודי של נתוני שבב exo בראש. אלה כוללים Genetrack, GEM, MACE, Peakzilla, ו ExoProfiler 12-15.

<table><tbody><tr><td>37% פורמלדהיד, ללא מתנול, 10 x 10 מ"ל אמפולות</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td><td>סעיף 3</td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז שלם (CPI)</td><td>Roche Life Science</td><td>11873580001</td><td>סעיפים 4, 8</td></tr><tr><td>סוניקטור ביורופטור</td><td>דיאגנוד</td><td>UCD200</td><td>סעיף 5</td></tr><tr><td>שפופרות פוליסטירן 15 מ"ל</td><td>BD Falcon</td><td></td><td>352095 סעיף 5</td></tr><tr><td>חרוזי חלבון MagSepharose G Xtra</td> GE <td>Healthcare</td><td>28-9670-66</td><td>סעיף 6</td></tr><tr><td>DynaMag-1.5 מ"ל מתלה מגנטי צדדי</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td>סעיפים 6-17, 22</td></tr><tr><td>מיני צינור מסובב</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>05-450-127</td><td>סעיפים 7, 22</td></tr><tr><td>T4 DNA פולימראז</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>M0203</td><td>סעיף 9</td></tr><tr><td>DNA פולימראז I, Klenow</td><td>New England BioLabs</td><td>M0210</td><td>סעיף 9</td></tr><tr><td>10x NEBuffer 2 (10x מאגר תגובה 2)</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>B7002</td><td>סעיפים 9-11, 13, 15, 20</td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382</td><td>סעיפים 9-16</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Roche Life Science</td><td>010419979001</td><td>סעיפים 9, 11, 13</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447</td><td>סעיפים 9, 12, 19, 23</td></tr><tr><td>T4 Polynucleotide Kinase</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>M0201</td><td>סעיפים 9, 13</td></tr><tr><td>dATP</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>N0440</td><td>סעיפים 10, 20</td></tr><tr><td>Klenow 3'-5' Exo מינוס</td><td>New England BioLabs</td><td>M0212</td><td>סעיפים 10, 20</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase&nbsp;</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>M0202</td><td>סעיפים 11, 21</td></tr><tr><td>&Phi;-29 DNA פולימראז</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>M0269</td><td>סעיפים 12, 19</td></tr><tr><td>10x &Phi;-29 מאגר</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>B0269</td><td>סעיפים 12, 19</td></tr><tr><td>למבדה אקסונוקלאז</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>M0262</td><td>סעיף 14</td></tr><tr><td>10x מאגר למבדה</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>B0262</td><td>סעיף 14</td></tr><tr><td>RecJf Exonuclease</td><td>New England BioLabs</td><td>M0264</td><td>סעיף 15</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Roche Life Science</td><td>03115828001</td><td>סעיף 16</td></tr><tr><td>גליקוגן</td><td>רוש מדעי החיים</td><td>010901393001</td><td>סעיף 18</td></tr><tr><td>10x T4 Ligase Buffer</td><td>New England BioLabs</td><td>B0202</td><td>סעיף 21</td></tr><tr><td>AMPure XP (ניקוי) חרוזים&nbsp;</td><td>בקמן קולטר</td><td>A63881</td><td>סעיף 22</td></tr><tr><td>Q5 התחלה חמה DNA פולימראז&nbsp;</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>M0493</td><td>סעיף 23</td></tr><tr><td>5x Q5 מאגר (5x PCR Buffer)</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>B9027</td><td>סעיף 23</td></tr><tr><td>QIAquick ערכת מיצוי ג'ל</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>סעיף 25</td></tr><tr><td>קיוביט פלואורומטר</td><td>Invitrogen</td><td>Q33216</td><td>סעיף 26</td></tr><tr><td>צינורות קיוביט אופטיים שקופים&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td>סעיף 26</td></tr><tr><td>ערכת בדיקת רגישות גבוהה של Qubit dsDNA</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td>סעיף 26</td></tr></tbody></table>

שיטת שבב exo: זיהוי אינטראקציות חלבון-דנ&quot;א עם precision סמוך לבסיס זוג

The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision

הכרומטין immunoprecipitation (שבב) הוא כלי הכרחי בתחומי אפיגנטיקה ויסות הגנים המבודדת אינטראקציות חלבון-דנ&quot;א ספציפי. שבב מצמידים את רצף תפוקה גבוהה (שבב ואילך) משמש בדרך כלל כדי לקבוע את המיקום הגנומי של חלבונים אינטראקציה עם הכרומטין. עם זאת, שבב seq הקשה על ידי ברזולוצית מיפוי נמוכה היחסי של כמה מאה זוגות בסיסים ו אות רקע גבוהה. שיטת השבב exo היא גרסה מעודנת של שבב seq המשפר באופן משמעותי את שני ברזולוציה ורעש. ההבחנה המפתח של המתודולוגיה שבב exo הוא שילוב של עיכול exonuclease למבדה בתהליך העבודה הכנת הספרייה כדי טביעת רגל שמאל ביעילות וימין 5 גבולות DNA של האתר crosslink חלבון-דנ&quot;א. הספריות-exo שבב חשופים מכן רצף קצב העברת נתונים גבוה. כתוצאת הנתונים ניתן למנף לספק תובנה ברזולוציה ייחודיות ועל עליון לתוך o הארגון הפונקציונליf הגנום. כאן אנו מתארים את שיטת השבב exo כי לנו אופטימיזציה וייעלו למערכות יונקות הדור הבא רצף-ידי-סינתזת פלטפורמה.

התמונות הבאות ממחישות תוצאות נציג מן פרוטוקול השבב exo שהוצג כאן. בניגוד מתודולוגיות שבב seq מסורתיים עם כמה צעדים אנזימטית, שבב exo דורש עשר תגובות אנזימטיות תלויות ברצף (איור 1). לפיכך, יש לנקוט זהירות בכל שלב על מנת להבטיח כי כל רכיב תגובה מתווסף תערובת מאסטר התגובה שלו בהתאמה. אנו ממליצים ליצור גיליון אלקטרוני נוסחה המבוססת על שולחנות התגובה לבצע את החישובים תמהיל מאסטר התגובה באופן אוטומטי, הדפסת לוחות וכתוצאה מכך, ולאחר מכן ב...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשגת רזולוציה קרובה לזוג הבסיס של אינטראקציות חלבון-DNA. זה מתקבל על ידי טיפול אקסונוקלאז בשברי DNA המועשרים באופן סלקטיבי על ידי משקעים חיסוניים של כרומטין (ChIP-exo) ואחריו ריצוף תפוקה גבוה.

שיטת שבב exo: זיהוי אינטראקציות חלבון-דנ&quot;א עם Precision סמוך לבסיס זוג

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA ...

המטרה הכוללת של טכנולוגיה גנומית פונקציונלית זו היא לזהות את המיקומים הגנומיים המדויקים שחלבון נתון תופס בתאים חיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי ויסות גנים ואפיגנטיקה כגון כיצד מנגנון השעתוק מורכב ופועל בהקשר של כרומטין. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא חושפת את המיקום הגנומי המדויק לאינטראקציות DNA של חלבונים ברזולוציה מוקדמת של כמעט בסיס עם רקע נמוך במיוחד.בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהפרוטוקול מורכב ודורש תשומת לב לפרטים לאורך כל הדרך. כדי לסוניקציה של ליזטים גרעיניים, התחל בהנחת מתאמי שרף בצינורות פוליסטירן של 15 מיליליטר המכילים תמציות גרעיניות. סוניקטיבי את הליזטים באמבט מים קרים כקרח בעוצמה בינונית למשך 30 שניות הפעלה ו-30 שניות כיבוי בסך הכל שני מפגשים של 15 דקות.כדי לבדוק את תוצאות הסוניקציה, העבירו שתי דגימות של 10 מיקרוליטר מכל צינור לצינורות של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן קישורים צולבים הפוכים על ידי שילוב הדגימה הראשונה של 10 מיקרוליטר עם 10 מיקרוליטר של TE-RNase A ו-0.2 מיקרוליטר של פרוטאינאז K. דגירה של הצינור ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן הוסף ארבעה מיקרוליטרים של צבע DNA 6X קסילן.לדגימה השנייה של 10 מיקרוליטר, שמור על קישורים צולבים על ידי הוספת שני מיקרוליטרים של צבע DNA 6X קסילן. יש להריץ את שתי הדגימות על ג'ל אגרוז של 1.5% ב-140 וולט למשך כ-30 עד 45 דקות עד שצבע הברומופנול באחרון נמצא בשלושת רבעי הדרך במורד הג'ל. אם הסוניקציה הצליחה, העבירו ליזטים סוניקטיביים לשני צינורות מיליליטר המכילים 150 מיקרוליטר של 10% טריטון X-100 ומערבולת לערבוב.גלולה את הכרומטין והפסולת הבלתי מסיסים על ידי סיבוב הליזטים הסוניקטיביים ב-20,000 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן העבירו את הסופרנטנטים לצינורות חדשים של שני מיליליטר. אחסן את הדגימות בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס ללא הגבלת זמן.עבור כל משקע חיסוני של כרומטין או תגובת ChIP, שלב 1.5 מיליליטר של תמציות סוניקציה עם צימודי חרוזי נוגדנים בצינורות של 1.5 מיליליטר. דגרו את הצינורות על מסובב צינור מיני במהירות של תשע בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. בדוק לאחר מספר דקות כדי לוודא שהדגימות אינן דולפות ומתערבבות כראוי.למחרת, סובב לזמן קצר מאוד את הצינורות כדי לאסוף את הנוזל במכסים והנח את הצינורות על מתלה מגנטי למשך דקה אחת. לאחר מכן שאפו את התמצית. הוסף 0.75 מיליליטר של מאגר RIPA לכל צינור.לאחר מכן הסר את הצינורות מהמתלה המגנטי והפוך אותם מספר פעמים לערבוב. לאחר סיבוב קצר, הנח את הצינורות בחזרה על המגנט ושאף את הסופרנטנט. לאחר הכביסה האחרונה, הוסף 0.75 מיליליטר של 10 מילי-מולרי Tris HCL לכל צינור.הסר את הצינורות מהמתלה המגנטי והפוך את הדגימות מספר פעמים לערבוב. לאחר סיבוב קצר, הנח את הצינורות בחזרה על המדף ושאף את הסופרנטנט. לאחר ביצוע תגובות הליטוש ופירוט בהתאם לפרוטוקול הטקסט, מלא את חישובי תערובת מאסטר הקשירה.לאחר מכן הכינו את תערובת הקשירה בצינור של 1.5 מיליליטר על קרח ופיפטה כדי לערבב את התמיסה. עם צינורות הדגימה על המדף המגנטי, הוסף 48 מיקרוליטר של תערובת מאסטר קשירה P7 ושני מיקרוליטר של אינדקס מתאם שונה לכל אחד משרפי הדגימה. דגרו את הדגימות ב-ThermoMixer ב-3 פעמים גרם ב-25 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.לאחר שטיפת הדגימות וביצוע תיקון ה-Phy 29 ותגובות הקינאז על פי פרוטוקול הטקסט, מלא את חישובי התערובת הראשית של למבדה אקסונוקלאז והכין את תערובת הלמבדה אקסונוקלאז בצינור של 1.5 מיליליטר על קרח. הוסף 50 מיקרוליטר של תערובת אקסונוקלאז למבדה לכל שרף דגימה בעודו על המדף המגנטי. לאחר מכן דגרו את הדגימות ב-ThermoMixer ב-37 מעלות צלזיוס ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.לאחר שאיבת השטיפה האחרונה כמתואר בפרוטוקול הטקסט, בצע תגובת נוקלאז RecJf על ידי מילוי חישובי תערובת המאסטר של RecJf והכנת תערובת RecJf על קרח. הוסף 50 מיקרוליטר מתערובת RecJf לכל שרף דגימה על המדף המגנטי. לאחר מכן דגרו את הדגימות ב-ThermoMixer ב-37 מעלות צלזיוס ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.לאחר שאיבת הכביסה האחרונה, הכינו את מאגר הפליטה ChIP ותערובת המאסטר של פרוטאינאז K והוסיפו 200 מיקרוליטר מהתמיסה לכל שרף דגימה. דגרו את הדגימות ב-ThermoMixer בטמפרטורה של שלוש פעמים גרם ב-65 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם מכסה מחומם למניעת עיבוי. למחרת, סובב לזמן קצר את הדגימות והנח את הצינורות על המדף המגנטי למשך דקה אחת.לאחר מכן העבירו 200 מיקרוליטר של סופרנטנט לצינור חדש של 1.5 מיליליטר המכיל 200 מיקרוליטר של מאגר TE. לאחר מיצוי DNA, הארכה ראשונית של P7 ותגובות ATL, מלא את חישובי תערובת המאסטר של טבלת הקשירה של מתאם P5 והפוך את תערובת המאסטר של הקשירה על קרח. הוסף 20 מיקרוליטר מתערובת הקשירה לכל דגימה ופיפטה לערבב.לאחר מכן דגרו את הדגימות במחזור תרמי בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. בצע טיהור וכימות DNA על פי פרוטוקול הטקסט. כפי שמוצג כאן, כדאי להקדיש זמן לייעל את תנאי הסוניקציה כדי להשיג תמציות כרומטין איכותיות המניבות שברי DNA בין 100 ל-500 זוגות בסיסים.ובדיקת שינוי ניידות אלקטרופורטית משמשת כדי לוודא שהתמציות הסוניקטיביות מכילות קישורים צולבים שלמים של DNA חלבוני, הניכרים כשינוי סופר של שברי DNA. כדי להעריך את אות הרקע, ChIP מדומה מבוצע באופן שגרתי ללא נוגדנים בתגובה. ספריית ChIP חיצונית איכותית תניב מעט מאוד רקע במדגם המדומה בהשוואה להכנת ספריית ChIP-seq.מוצגת כאן הערכת ביו-אנלייזר של ספריית ChIP-exo. הניתוח מבטיח במדויק את התפלגות גודל הספרייה ומזהה דימרים מזהמים של מתאמים הפועלים ב-125 זוגות בסיסים. פאנל זה ממחיש את ההתפלגות החלקה של תג ChIP-exo המופרד בגדיל חמישה Ns ראשוניים עבור פולימראז II, TFIIB ו-TBP בגן RPS12 האנושי בתאי K562 מתרבים.באיור זה מוצגים דפוסי ChIP-exo ממוצעים ביחס לאתרי התחלת השעתוק של גנים מקודדי חלבון. מיקומי השיא העיקריים של TBP, TFIIB ופולימראז II בחלקה המרוכבת משקפים את הארגון הגנומי של מתחמי התחלת שעתוק אנושיים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבעה ימים אם היא מבוצעת כראוי.לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הבקרה הגנטית לחקור פרטים מולקולריים של מבנה תת-גרעיני באסימטריה בשמרים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו פרופיל ביטוי RNase כדי לענות על שאלות כגון האם גורם נתון משפיע על ביטוי של גן סמוך. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור למלא בזהירות טבלאות מיקס מאסטר עבור כל השלבים האנזימטיים.אל תשכח, עבודה עם חומרים מסרטנים וחומרים קאוסטיים אחרים עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי בעת ביצוע הליך זה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין ספריית ChIP-exo איכותית.

the-chip-exo-method-identifying-protein-dna-interactions-with-near

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ניתוח הכרומטין אינטראקציה ידי מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) היא...

הכרומטין ניתוח אינטראקציה עם מנבא סוף תג הרצף (Chia-PET) עבור מיפוי אינטראקציות הכרומטין הבנת תקנה תמלול

בסרטון זה, אנו מדגימים את טכניקת המשקעים החיסוניים של הכרומטין כדי לזהות אתרי קישור חלבונים באזורים ספציפיים של הדנ"א הגנומי של תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים באמצעות משקעים חיסוניים סלקטיביים של מקטעי כרומטין הקשורים לחלבון. שיטה זו מסייעת לחקור את האינטראקציה של מספר חלבונים רגולטוריים, כולל גורמי שעתוק המעורבים בבקרת גנים.

משקעים חיסוניים של כרומטין לזיהוי אתרי קישור חלבוני מטרה בדנ"א גנומי

על ידי שילוב של ילידים וcrosslinking immunoprecipitation הכרומטין עם רזולוציה גבוהה ספקטרומטריית מסה, גישת ChroP מאפשרת לנתח את ארכיטקטורת proteomic המורכבת של שינויי היסטון, וריאנטים וחלבונים שאינם histonic synergizing בתחומי הכרומטין תפקודי מובהקים.

גישת ChroP משלבת שבב וספקטרומטריית המסה לנתח נופי proteomic לוקוס ספציפיים של הכרומטין

מאמר וידאו זה מתאר שיטת microarray מבוסס במבחנה כדי לקבוע את מטרות הגן ואתרי קישור לשני רגולטורים תגובת מערכת רכיב.

שיטת צ&#39;יפ (DAP-שבב) מטוהרת-DNA-זיקה לקביעת מטרות גן לחיידקית שתי מערכות רגולטוריות רכיב

הפקת מלח רציפים של חלבוני כרומטין מאוגד הוא כלי שימושי לקביעת מאפייני האיגוד של מתחמי חלבון גדולה. שיטה זו יכולה להיות מועסק כדי להעריך את התפקיד של subunits בודדים או קבוצות מחשבים הנמצאות בזיקה הכוללת של חלבון מורכב בכמות גדולה כרומטין.

עקירות מלח רציפים לניתוח של כרומטין בצובר מחייב מאפיינים של כרומטין שינוי מתחמי

אנו מתארים את המחשוף אנדוגני הכרומטית יחד עם רצף תפוקה גבוהה (ChEC-seq), chromatin immunoprecipitation (שבב) שיטה horogonal עבור מיפוי חלבון מחייב אתרים גנום רחב עם חלבונים היתוך microococcal nuclease (MNase).

מיפוי רחב של הגנום של אינטראקציות DNA-חלבון עם CHEC-Seq ב<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

קביעה מדויקת של מיקומים מחייבי חלבון ברחבי הגנום חשובה להבנת ויסות הגנים. כאן אנו מתארים שיטת מיפוי גנומית המטפלת בדנ"א כרומטין-אימונו-חיסוני עם עיכול exonuclease (ChIP-exo) ואחריו רצף תפוקה גבוהה. שיטה זו מזהה אינטראקציות בין חלבון לדנ"א עם רזולוציית מיפוי קרובה של זוג בסיס ויחס אות לרעש גבוה בנוירונים של יונקים.

מיפוי ברזולוציה גבוהה של אינטראקציות חלבון-DNA בתאי גזע עכבר נוירונים באמצעות כרומטין Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo)

מאמר זה מציג שלבים חיוניים של חיסונים ואימונופרציפיטציה של כרומטין. פרוטוקולים אלה משמשים בדרך כלל כדי לחקור תהליכים תאיים הקשורים נזק DNA כדי לדמיין ולכומת את הגיוס של חלבונים מעורבים בתיקון DNA.

הדמיה וכימות נזק DNA ספציפי לאתר מבוסס אנדונוקלאז

האינטראקציה של שיפוץ כרומטין תלוי ATP עם ליגנד DNA מתוארת באמצעות ספקטרוסקופיה CD. ניתן להשתמש בשינויים הקונפורמציה המושרים על מקדם גנים שניתח על ידי הפסגות שנוצרו כדי להבין את מנגנון הרגולציה התמלולית.

ספקטרוסקופיה של תקליטור לחקר אינטראקציות בין DNA לחלבון

CUT&amp;RUN והוריאנטים שלה יכולים לשמש לקביעת תפוסת החלבון בכרומטין. פרוטוקול זה מתאר כיצד לקבוע לוקליזציה של חלבון על כרומטין באמצעות uliCUT&amp;RUN של תא יחיד.

לוקליזציה של גורם תא יחיד בכרומטין באמצעות מחשוף קלט אולטרה-נמוך תחת יעדים ושחרור באמצעות נוקלאז

שיטת ChIRP מבוססת UV לזיהוי אינטראקציות ישירות בין lncRNA לחלבון.

שיטת ChIRP מבוססת UV לזיהוי ניתן לאימות חלבונים המקיימים אינטראקציה ישירה עם LncRNA: מתאים מתורבתים לאשך עכבר

למד את שיטת ChIP-exo לזיהוי מדויק של אינטראקציות חלבון-דנ"א ברזולוציה של כמעט זוג בסיסים. טכניקה זו משלבת ניקוי כרומטין עם טיפול אקסונוקלאז וריצוף גבוה-תפוקה לחקר רגולציה גנית ואפיגנטיקה.

שיטת שבב exo: זיהוי אינטראקציות חלבון-דנ"א עם Precision סמוך לבסיס זוג

גלה סרטונים נוספים