שיטת שבב exo: זיהוי אינטראקציות חלבון-דנ"א עם Precision סמוך לבסיס זוג

המטרה הכוללת של טכנולוגיה גנומית פונקציונלית זו היא לזהות את המיקומים הגנומיים המדויקים שחלבון נתון תופס בתאים חיים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי ויסות גנים ואפיגנטיקה כגון כיצד מנגנון השעתוק מורכב ופועל בהקשר של כרומטין. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא חושפת את המיקום הגנומי המדויק לאינטראקציות DNA של חלבונים ברזולוציה מוקדמת של כמעט בסיס עם רקע נמוך במיוחד.

בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהפרוטוקול מורכב ודורש תשומת לב לפרטים לאורך כל הדרך. כדי לסוניקציה של ליזטים גרעיניים, התחל בהנחת מתאמי שרף בצינורות פוליסטירן של 15 מיליליטר המכילים תמציות גרעיניות. סוניקטיבי את הליזטים באמבט מים קרים כקרח בעוצמה בינונית למשך 30 שניות הפעלה ו-30 שניות כיבוי בסך הכל שני מפגשים של 15 דקות.

כדי לבדוק את תוצאות הסוניקציה, העבירו שתי דגימות של 10 מיקרוליטר מכל צינור לצינורות של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן קישורים צולבים הפוכים על ידי שילוב הדגימה הראשונה של 10 מיקרוליטר עם 10 מיקרוליטר של TE-RNase A ו-0.2 מיקרוליטר של פרוטאינאז K. דגירה של הצינור ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן הוסף ארבעה מיקרוליטרים של צבע DNA 6X קסילן.

לדגימה השנייה של 10 מיקרוליטר, שמור על קישורים צולבים על ידי הוספת שני מיקרוליטרים של צבע DNA 6X קסילן. יש להריץ את שתי הדגימות על ג'ל אגרוז של 1.5% ב-140 וולט למשך כ-30 עד 45 דקות עד שצבע הברומופנול באחרון נמצא בשלושת רבעי הדרך במורד הג'ל. אם הסוניקציה הצליחה, העבירו ליזטים סוניקטיביים לשני צינורות מיליליטר המכילים 150 מיקרוליטר של 10% טריטון X-100 ומערבולת לערבוב.

גלולה את הכרומטין והפסולת הבלתי מסיסים על ידי סיבוב הליזטים הסוניקטיביים ב-20,000 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר מכן העבירו את הסופרנטנטים לצינורות חדשים של שני מיליליטר. אחסן את הדגימות בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס ללא הגבלת זמן.

עבור כל משקע חיסוני של כרומטין או תגובת ChIP, שלב 1.5 מיליליטר של תמציות סוניקציה עם צימודי חרוזי נוגדנים בצינורות של 1.5 מיליליטר. דגרו את הצינורות על מסובב צינור מיני במהירות של תשע בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. בדוק לאחר מספר דקות כדי לוודא שהדגימות אינן דולפות ומתערבבות כראוי.

למחרת, סובב לזמן קצר מאוד את הצינורות כדי לאסוף את הנוזל במכסים והנח את הצינורות על מתלה מגנטי למשך דקה אחת. לאחר מכן שאפו את התמצית. הוסף 0.75 מיליליטר של מאגר RIPA לכל צינור.

לאחר מכן הסר את הצינורות מהמתלה המגנטי והפוך אותם מספר פעמים לערבוב. לאחר סיבוב קצר, הנח את הצינורות בחזרה על המגנט ושאף את הסופרנטנט. לאחר הכביסה האחרונה, הוסף 0.75 מיליליטר של 10 מילי-מולרי Tris HCL לכל צינור.

הסר את הצינורות מהמתלה המגנטי והפוך את הדגימות מספר פעמים לערבוב. לאחר סיבוב קצר, הנח את הצינורות בחזרה על המדף ושאף את הסופרנטנט. לאחר ביצוע תגובות הליטוש ופירוט בהתאם לפרוטוקול הטקסט, מלא את חישובי תערובת מאסטר הקשירה.

לאחר מכן הכינו את תערובת הקשירה בצינור של 1.5 מיליליטר על קרח ופיפטה כדי לערבב את התמיסה. עם צינורות הדגימה על המדף המגנטי, הוסף 48 מיקרוליטר של תערובת מאסטר קשירה P7 ושני מיקרוליטר של אינדקס מתאם שונה לכל אחד משרפי הדגימה. דגרו את הדגימות ב-ThermoMixer ב-3 פעמים גרם ב-25 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.

לאחר שטיפת הדגימות וביצוע תיקון ה-Phy 29 ותגובות הקינאז על פי פרוטוקול הטקסט, מלא את חישובי התערובת הראשית של למבדה אקסונוקלאז והכין את תערובת הלמבדה אקסונוקלאז בצינור של 1.5 מיליליטר על קרח. הוסף 50 מיקרוליטר של תערובת אקסונוקלאז למבדה לכל שרף דגימה בעודו על המדף המגנטי. לאחר מכן דגרו את הדגימות ב-ThermoMixer ב-37 מעלות צלזיוס ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

לאחר שאיבת השטיפה האחרונה כמתואר בפרוטוקול הטקסט, בצע תגובת נוקלאז RecJf על ידי מילוי חישובי תערובת המאסטר של RecJf והכנת תערובת RecJf על קרח. הוסף 50 מיקרוליטר מתערובת RecJf לכל שרף דגימה על המדף המגנטי. לאחר מכן דגרו את הדגימות ב-ThermoMixer ב-37 מעלות צלזיוס ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.

לאחר שאיבת הכביסה האחרונה, הכינו את מאגר הפליטה ChIP ותערובת המאסטר של פרוטאינאז K והוסיפו 200 מיקרוליטר מהתמיסה לכל שרף דגימה. דגרו את הדגימות ב-ThermoMixer בטמפרטורה של שלוש פעמים גרם ב-65 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם מכסה מחומם למניעת עיבוי. למחרת, סובב לזמן קצר את הדגימות והנח את הצינורות על המדף המגנטי למשך דקה אחת.

לאחר מכן העבירו 200 מיקרוליטר של סופרנטנט לצינור חדש של 1.5 מיליליטר המכיל 200 מיקרוליטר של מאגר TE. לאחר מיצוי DNA, הארכה ראשונית של P7 ותגובות ATL, מלא את חישובי תערובת המאסטר של טבלת הקשירה של מתאם P5 והפוך את תערובת המאסטר של הקשירה על קרח. הוסף 20 מיקרוליטר מתערובת הקשירה לכל דגימה ופיפטה לערבב.

לאחר מכן דגרו את הדגימות במחזור תרמי בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. בצע טיהור וכימות DNA על פי פרוטוקול הטקסט. כפי שמוצג כאן, כדאי להקדיש זמן לייעל את תנאי הסוניקציה כדי להשיג תמציות כרומטין איכותיות המניבות שברי DNA בין 100 ל-500 זוגות בסיסים.

ובדיקת שינוי ניידות אלקטרופורטית משמשת כדי לוודא שהתמציות הסוניקטיביות מכילות קישורים צולבים שלמים של DNA חלבוני, הניכרים כשינוי סופר של שברי DNA. כדי להעריך את אות הרקע, ChIP מדומה מבוצע באופן שגרתי ללא נוגדנים בתגובה. ספריית ChIP חיצונית איכותית תניב מעט מאוד רקע במדגם המדומה בהשוואה להכנת ספריית ChIP-seq.

מוצגת כאן הערכת ביו-אנלייזר של ספריית ChIP-exo. הניתוח מבטיח במדויק את התפלגות גודל הספרייה ומזהה דימרים מזהמים של מתאמים הפועלים ב-125 זוגות בסיסים. פאנל זה ממחיש את ההתפלגות החלקה של תג ChIP-exo המופרד בגדיל חמישה Ns ראשוניים עבור פולימראז II, TFIIB ו-TBP בגן RPS12 האנושי בתאי K562 מתרבים.

באיור זה מוצגים דפוסי ChIP-exo ממוצעים ביחס לאתרי התחלת השעתוק של גנים מקודדי חלבון. מיקומי השיא העיקריים של TBP, TFIIB ופולימראז II בחלקה המרוכבת משקפים את הארגון הגנומי של מתחמי התחלת שעתוק אנושיים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך ארבעה ימים אם היא מבוצעת כראוי.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הבקרה הגנטית לחקור פרטים מולקולריים של מבנה תת-גרעיני באסימטריה בשמרים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו פרופיל ביטוי RNase כדי לענות על שאלות כגון האם גורם נתון משפיע על ביטוי של גן סמוך. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור למלא בזהירות טבלאות מיקס מאסטר עבור כל השלבים האנזימטיים.

אל תשכח, עבודה עם חומרים מסרטנים וחומרים קאוסטיים אחרים עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי בעת ביצוע הליך זה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להכין ספריית ChIP-exo איכותית.