זרימה Virometry לנתח אנטיגני ספקטרה של virions ואת תאי שלפוחית

וירוסים או שלפוחיות חוץ-תאיות נלכדו חיסונית עם ננו-חלקיקים מגנטיים של 15 ננומטר יחד עם נוגדנים המזהים אנטיגנים על פני השטח. הנגיפים או השלפוחיות שנתפסו סומנו בנוגדנים פלואורסצנטיים כנגד אנטיגנים אחרים על פני השטח. הקומפלקסים שהתקבלו הופרדו בשדה מגנטי גבוה ונותחו באמצעות ציטומטרים זרימה קונבנציונליים המופעלים על פלואורסצנטיות.

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בחלקיקים מגנטיים או MNPs כדי לזהות אנטיגנים מרובים על פני השטח של נגיפים בודדים או שלפוחיות חוץ-תאיות בודדות עם ציטומטר זרימה קונבנציונאלי. שיטה זו יכולה לעזור לנו כאופי הקשר בין הפנוטיפ לתפקוד של שלפוחיות ווירוסים במחלות אנושיות, בפרט בזיהום ויראלי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת ניתוח של נגיפים בודדים או שלפוחיות חוץ-תאיות בודדות במקום ניתוח בתפזורת בו הולכים לאיבוד המאפיינים האישיים של חלקיקים אלה.

שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הבדיקה הנכונה של חלקיקים נגיפיים, אך ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות בתנאי שיש נוגדנים מתאימים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שיש לאמת ולבדוק את כל השלבים לפני הניתוח כולל ההגדרה הנכונה של ציטומטר הזרימה. התחל בשילוב של 60 מיקרוליטר של MNPs לכל מצב, וחמישה מיקרוליטרים של שברי FAB מסומנים ספציפיים לאיזוטיפ של נוגדן הלכידה המעניין בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.

דוגרים את התמיסה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בערבוב רציף. לאחר מכן הרטיבו מראש רכז 100K עם 300 מיקרוליטר PBS וסובבו את הרכז במיקרו-צנטריפוגה. בתום הצנטריפוגה, יש לטהר את הקומפלקסים המסומנים על עמודה של 100K ואחריה מיקרו-צנטריפוגה נוספת המשהה את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של PBS טרי.

כדי ללכוד את החלקיקים המעניינים, דגרו את הנוגדן המסומן MNPs עם החלקיק המעניין לתקופת הדגירה והטמפרטורה המתאימים. לאחר מכן, חסמו כל קשירת FC לא ספציפית עם הזן המתאים של נוגדן IGG, מערבלו בעדינות ודגרו את תמיסת החלקיקים למשך שלוש עד חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הוסף את הריכוז המומלץ של היצרן של כל נוגדן זיהוי לחלקיקים או נוגדנים לבקרת איזוטיפ לדגימת בקרת האיזוטיפ למשך 20 דקות דגירה נוספות בטמפרטורת החדר.

כדי להפריד את החלקיקים שנלכדו ב-MNP מהנוגדן הלא קשור, הנח תחילה עמודת הפרדה מגנטית במגנט מפריד והרטיב מראש את העמודה עם 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה. אפשר למאגר הכביסה לזרום דרך העמודה, ולאחר מכן הוסף את מתחמי חלקיקי ה-MNP לעמודה שאוספת את הזרימה במיכל פסולת. כאשר כל התמיסה המורכבת עברה דרך העמודה, יש לשטוף את העמוד שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר מאגר כביסה.

לאחר מכן העבירו את העמודה לצינור בגודל 12 על 75 מילימטר. לאחר שלוש דקות, הוסף 200 מיקרוליטר PBS, מה שמאפשר לחרוזים לחמוק על ידי כוח הכבידה. כאשר כל ה-PBS עבר דרך העמודה, הוסף 200 מיקרוליטר PBS טרי לצינור ותקן את החלקיקים ב-200 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד.

לאחר מכן, טען PBS מסונן של 0.22 מיקרון על ציטומטר זרימה והתאם את מתח ה-PMT על הציטומטר עד שה-PBS המסונן יראה אפס עד מעט מאוד אירועים. לאחר מכן הפעל את החלקיקים שנלכדו ב-MNP באמצעות זרימה נמוכה עם מסנן מקוון של 0.04 מיקרון לנוזל נדן הממוקם בסדרה מאחורי מסנן המעטפת הסטנדרטי של 0.2 מיקרון כדי למנוע עוד יותר אירועי שווא. בעזרת וירומטריית זרימה, ניתן כעת לדמיין אנטיגנים תאיים על חלקיקים נגיפיים בודדים.

לדוגמה, בניסוי זה נצפתה הטרוגניות גבוהה של נגיפים של HIV-1 לנוכחות LFA-1 ו-HLA-DR עם לכידת חלקיקים נגיפיים שהייתה תלויה בתאים ששיכפלו את הנגיף. התבגרות נגיף הדנגי קשורה לביטוי של חלבוני ממברנה קודמים על הוויריונים שניתן להבחין בהם באמצעות וירומטריית זרימה כפי שהודגם זה עתה. בניסוי מייצג זה, שלפוחיות חוץ-תאיות נלכדו מפלזמה דלה בטסיות באמצעות נוגדנים פלואורסצנטיים שונים בשילוב MNP כדי לחקור תת-קבוצות שונות של נגיפים חוץ-תאיים בחולים עם תסמונת כלילית חריפה.

ניתוח וירומטריית זרימה קבע כי בעוד שמספרי השלפוחית החוץ-תאית הכוללים גדלו בעיקר בחולי תסמונת כלילית חריפה בהשוואה לביקורת תורם בריא, גודל העלייה השתנה בין תת-אוכלוסיות השלפוחית החוץ-תאיות השונות. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שעתיים אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להגדיר כראוי את ציטומטר הזרימה שלך לפני תחילת הניתוח.

פיתוח טכניקה זו פתח דרך לחוקרים בתחום הווירולוגיה והביולוגיה החוץ-תאית לחקור את תפקידם של חלקיקים אלה בתהליכים נורמליים ופתולוגיים במערכת החוץ גופית ובדגימות של בני אדם ובעלי חיים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו PCR או ספקטרומטריית מסה כדי לענות על שאלות נוספות כמו אילו חלבונים או מולקולות RNA או DNA נושאים EVs או וירוסים שנלכדו במיוחד. אני מקווה שלאחר צפייה בסרטון זה יש לך הבנה טובה כיצד לנתח את ההרכב האנטיגני של נגיפים בודדים או שלפוחיות חוץ-תאיות בודדות.