Name: זרימה Virometry לנתח אנטיגני ספקטרה של virions ואת תאי שלפוחית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: חקור שיטת זרימה וירומטרית לניתוח אנטיגנים בנגיפים בודדים ובשלפוחיות חוץ-תאיות באמצעות ננו-חלקים מגנטיים וציטומטריית זרימה סטנדרטית. שיטה זו מאפשרת פרופיל אנטיגני ברמת חלקיק יחיד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו של AA, SZ, WF, J-C. G ו-LM נתמך על ידי התוכנית הפנימית של NICHD. עבודתו של MV נתמכה על ידי מענק ממשלת הפדרציה הרוסית #14.B25.31.0016.

1. עגינת חלקיקים מגנטיים (MNPs) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בהליך צימוד מסחרי ריאגנטים הזוג MNPs עם נוגדנים (ABS) (בדרך כלל 1 מ&quot;ג). חלקיקי תחמוצת ברזל עם חומצה קרבוקסילית קבוצות תגובתי כמו משמשים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם נוגדנים נמצאים בהיקף גדול מסך 0.5 מ&quot;ל, להתרכז באמצעות concentrator 100K. ספין XG ב 2000 במשך 3-5 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף ההליך, לאחר הוספת 10 μl של חיץ מרווה, להעביר MNPs לצינור 12 מ&quot;מ x 75 מ&quot;מ ולהוסיף 3 מ&quot;ל לשטוף / אחסון חיץ. מניחים את הצינור לתוך החור במרכז מפריד מגנטי ולהשאיר למשך הלילה ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא MNPs יש כל שנאספו על הצד של הצינור, ואז בזהירות pipet את כל נוזלי. הוסף 3 מ&quot;ל של חיץ לשטוף / אחסון טריים, ומכניסים המגנט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כמה שעות, לבדוק אם MNPs נאספים אל הצד של הצינור ואז pipet את הנוזל. השתמש 2 מ&quot;ל של לשטוף / אחסון חיץresuspend את MNPs ולאחסן על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי שרירי הבטן הם מצמידים את MNPs ידי תיוגם עם נוגדן Fab פלורסנט רלוונטי (למשל עיזים ועכבר אנטי אם באמצעות monoclonal העכבר Ab עבור לכידת כמפורט בסעיף 2) ולהפעיל על cytometer זרימה. </li></ol> 2. נוגדנים תיוג מצמידים את MNPs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב 60 μl (3.9 x 10 12 חלקיקים) של MNPs (לכל מצב) ו -5 μl (של פתרון מסחרי 200 מיקרוגרם / מ&quot;ל) שכותרתו שברי Fab, ספציפית עבור אלוטיפ של לכידת Ab צינור 1.5 מ&quot;ל microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בטמפרטורת החדר (RT) במשך 30 דקות עם ערבוב מתמיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום להרטיב concentrator 100K עם 300 μl של בופר פוספט (PBS) ספין microcentrifuge בבית 1500 XG במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר מתחמי שכותרתו על 100K טור. ספין את התערובת משלב 2.2 microcentrifuge בבית 1500 XG במשך 5 דקות, לשטוף עם 200 μl PBS, להתאוששנפח ראשוני. </li></ol> 3. שימוש של מכלולי Ab-MNP תווית ללכוד חלקיקים של ריבית (וירוסים או EVS) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה μl 60 מראש שכותרתו MNPs (3.9 x 10 12 חלקיקים) עם HIV (60 μl) או הכנה EV (100 μl). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן הכנות EV בשיטות שונות. הנה, לטהר כלי רכב חשמליים על הדרגתיים סוכרוז, לאסוף אותם מפלזמה עניה טסיות באמצעות ריאגנטים ממטרי exosome או לבודד ישירות פלזמה 8. הערה: יחסים אופטימליים צריכים להיקבע עבור כל ניסוי ותלויים ריכוז של הווירוס / EV בהכנה. MNP-Ab חלק צריך להיות ~ 10 6 העולה לעומת ריכוז של שבריר וירוס / EV. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 40 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין לאיתור וירוסים, או שעה 1 ב 4 מעלות צלזיוס במשך EVS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 2.5% העכבר IgG / IgG האדם לחסום Fc מחייב, בעדינות מערבולת, דגירה 3-5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">הוסף מומלץ יצרן או titered ריכוזים של כל שרירי בטן זיהוי דגירה נוספות 20 דקות ב RT. </li></ol> הפרדת 4. של virions MNP שנתפס (או EVS) מ נוגדנים מאוגדים באמצעות עמודות מגנטיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן טור הפרדה מגנטי לשימוש על ידי הצבת אותו מגנט מפריד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום להרטיב את העמודה עם 500 μl של חיץ לשטוף (2 חומצה מ&quot;מ Ethylenediaminetetraacetic (EDTA), 0.5% בסרום שור אלבומין (BSA) ב- PBS). אפשר לשטוף חיץ לזרום דרך העמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את מתחמי MNP-וירוס / MNP-EV לעמודה ולאפשר לכל נוזל לזרום דרך. הוסף 500 μl של חיץ לשטוף לעמודה, המאפשר נפח כולו לעבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור כביסה עם פי 2 חיץ לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העמודה מגנט ומניחים 12 מ&quot;מ x 75 מ&quot;מ צינור לאיסוף מתחמי MNP-וירוס / MNP-EV העודפים. בואו בעמודה לעמוד בצינור את המגנט במשך 3 דקות. הוסף 200 μl של PBS ולתתהחרוזים לזרום למטה על ידי כוח הכבידה, להוסיף עוד 200 μl של PBS, ולתקן עם 200 μl paraformaldehyde 4% לאחר elution. הערה: Paraformaldehyde הוא קרצינוגן חשד יש לטפל במנדף מאוורר יש ללבוש כפפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכמת virions יחיד / כלי רכב חשמליים להשתמש בהגדרות נפחית על סמפלר תפוקה גבוהה (HTS) או רק לפני רכישת להוסיף זרימת מוּרבָּך cytometry חרוזים הספירה. </li></ol> 5. ניתוח של וירוסים MNPs שנתפסו / מכוניות חשמליות עם Cytometer זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחמם cytometer זרימה למשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חרוזי בקרת איכות לרוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסף נקבע על הקרינה של כל אחד MNPs או וירוסים שכותרתו / EVS. השתמש 0.22 מיקרומטר מסוננים PBS עבור סף כדי להקטין את הרקע &quot;רעש&quot;. הגדר את הסף ידי התאמת מתח PMT ברמה שבה PBS המסונן נותן שום, או מעט מאוד, אירועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעילו דגימות על נמוך. (להשתמש במסנן מוטבעות נוסף 0.04 מיקרומטר עבור נוזל נדן להציב סדרה מאחורי0.2 מיקרומטר נדן מסנן סטנדרטי להמשיך לחסל אירועי שווא). </li></ol> הערכת 6. של היעילות הלכידה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכידת fluorescently כלי רכב חשמליים שכותרתו או HIV עם MNP-Abs כמתואר 3.1, 3.2. (EVS ניתן מסווג עם צבע קרום או דרך המטען שלהם 15; HIV יכול להיות מתויג אם באמצעות צבע בקידוד גנים 16, או עם צבע קרום 12, 17). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן טור הפרדה מגנטי כמתואר (4.1-4.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את מתחמי MNP-וירוס / MNP-EV לעמודה ולאפשר לכל נוזל לזרום דרך (לזרום חלק). אסוף את הזרימה דרך שבריר בצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך עם שבריר שמור על העמודה כמתוארת (4.4-4.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הליך ללכוד חזור על הזרימה דרך שבריר מ -6.3 עם הפרדה שלאחר מכן (4.1-4.5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את שברי שימור ca הראשוןpture ולכידה שני על ידי הפעלת אותם על cytometer זה מוגדרים על מפעיל על התווית ניאון של EVS או HIV. כדי להעריך את היעילות, השווה את מספר האירועים בשני שברים. </li></ol> 7. הסתגלות לפרוטוקול עבור משימות ספציפיות הערה: בעוד הפרוטוקול יכול להיות מיושם על ניתוח של HIV כלי רכב חשמלי כמתואר לעיל, ניתוח רכב DENV בשינויים הבאים צריכים להיות הציגו: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה virions עם 1 מיקרומטר DiI בחושך במשך 30 דקות ב RT. לאחר דגירה לטהר וירוס מוכתם על ידי צנטריפוגה במדיום שיפוע צפיפות (10%, 20%, 25% ו -35%) ב 240,000 XG עבור 1.5 שעות ב 4 ° C ללא בלם. אסוף חלק בין 20% ו -25% שיפוע צפיפות שכבות בינוניות 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה DiI שכותרתו DENV 1 x 10 7 (60 μl) עם ריכוזים היצרן מומלץ או titered של זיהוי Ab בנוכחות IgG עכבר 2.5% למשך 20 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Incubאכלו תערובת עם 60 מראש שכותרתו μl (3.9 x 10 12 חלקיקים) מתחמי MNP ללכוד Ab במשך 40 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם ערבוב עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחמי כתוצאה נפרדים מ ABS מאוגד על עמודות מגנטיות כמתואר לעיל ולנתח על cytometer זרימה. </li></ol>

<ol><li>Tremblay, M. J., Fortin, J. F., Cantin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acquisition+of+host-encoded+proteins+by+nascent+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Today%22%5BJournal%5D)">The acquisition of host-encoded proteins by nascent HIV-1.</a> Immunol Today. 19 (8), 346-351 (1998).</li>
<li>Santos, S., Obukhov, Y., Nekhai, S., Bukrinsky, M., Iordanskiy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-producing+cells+determine+the+host+protein+profiles+of+HIV-1+virion+cores%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Virus-producing cells determine the host protein profiles of HIV-1 virion cores.</a> Retrovirology. 9, 65(2012).</li>
<li>Wolf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nature+and+significance+of+platelet+products+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">The nature and significance of platelet products in human plasma.</a> Br J Haematol. 13 (3), 269-288 (1967).</li>
<li>Piccin, A., Murphy, W. G., Smith, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microparticles%3A+pathophysiology+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Circulating microparticles: pathophysiology and clinical implications.</a> Blood Rev. 21 (3), 157-171 (2007).</li>
<li>Bernal-Mizrachi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+circulating+endothelial+microparticles+in+patients+with+acute+coronary+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Heart+J%22%5BJournal%5D)">High levels of circulating endothelial microparticles in patients with acute coronary syndromes.</a> Am Heart J. 145 (6), 962-970 (2003).</li>
<li>Rozmyslowicz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-+and+megakaryocyte-derived+microparticles+transfer+CXCR4+receptor+to+CXCR4-null+cells+and+make+them+susceptible+to+infection+by+X4-HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">Platelet- and megakaryocyte-derived microparticles transfer CXCR4 receptor to CXCR4-null cells and make them susceptible to infection by X4-HIV.</a> Aids. 17 (1), 33-42 (2003).</li>
<li>Bhattarai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GB+virus+C+particles+inhibit+T+cell+activation+via+envelope+E2+protein-mediated+inhibition+of+TCR+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">GB virus C particles inhibit T cell activation via envelope E2 protein-mediated inhibition of TCR signaling.</a> J Immunol. 190 (12), 6351-6359 (2013).</li>
<li>Arakelyan, A., Ivanova, O., Vasilieva, E., Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+composition+of+single+nano-sized+extracellular+blood+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Antigenic composition of single nano-sized extracellular blood vesicles.</a> Nanomedicine. 11 (3), 489-498 (2015).</li>
<li>Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Margolis, L., Grivel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle-based+flow+virometry+for+the+analysis+of+individual+virions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle-based flow virometry for the analysis of individual virions.</a> J Clin Invest. 123 (9), 3716-3727 (2013).</li>
<li>Yang, H., Liang, W., He, N., Deng, Y., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemiluminescent+labels+released+from+long+spacer+arm-functionalized+magnetic+particles%3A+a+novel+strategy+for+ultrasensitive+and+highly+selective+detection+of+pathogen+infections%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Chemiluminescent labels released from long spacer arm-functionalized magnetic particles: a novel strategy for ultrasensitive and highly selective detection of pathogen infections.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 7 (1), 774-781 (2015).</li>
<li>Tang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+and+rapid+detection+of+Pseudomonas+aeruginosa+based+on+magnetic+enrichment+and+magnetic+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive and rapid detection of Pseudomonas aeruginosa based on magnetic enrichment and magnetic separation.</a> Theranostics. 3 (2), 85-92 (2013).</li>
<li>Borlido, L., Azevedo, A. M., Roque, A. C., Aires-Barros, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+separations+in+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Magnetic separations in biotechnology.</a> Biotechnol Adv. 31 (8), 1374-1385 (2013).</li>
<li>Xi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+HBsAg-Specific+DNA+Aptamers+Based+on+Carboxylated+Magnetic+Nanoparticles+and+Their+Application+in+the+Rapid+and+Simple+Detection+of+Hepatitis+B+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Selection of HBsAg-Specific DNA Aptamers Based on Carboxylated Magnetic Nanoparticles and Their Application in the Rapid and Simple Detection of Hepatitis B Virus Infection.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 7 (21), 11215-11223 (2015).</li>
<li>Zicari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+maturation+of+individual+Dengue+virions+with+flow+virometry%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the maturation of individual Dengue virions with flow virometry.</a> Virology. 488, 20-27 (2016).</li>
<li>Lai, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nat Commun. 6, 7029(2015).</li>
<li>McDonald, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+intracellular+behavior+of+HIV+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells.</a> J Cell Biol. 159 (3), 441-452 (2002).</li>
<li>Morcock, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+retroviral+infectivity+by+N-ethylmaleimide+with+preservation+of+functional+envelope+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Elimination of retroviral infectivity by N-ethylmaleimide with preservation of functional envelope glycoproteins.</a> J Virol. 79 (3), 1533-1542 (2005).</li>
<li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShapiro%2C+HM+%22Practical+Flow+Cytometry%22">Practical Flow Cytometry</a>. , John Wiley & Sons, Inc. 101-223 (2005).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

Cytometers תזרים קונבנציונלי להישאר הכלי העיקרי לניתוח תאים בהתבסס על מאפיינים פיזיים וכימיים שלהם ברמת הפרט 18. העקרונות הבסיסיים של זרימת cytometry לא שונו מאז הפיתוח שלה: תא שעובר דרך קרן הליזר ומפזר אור מהווה אירוע שמפעיל את ההקלטה של ​​ספקטרום הניאון הנפלטת נוגדני ניאון כלוא. קטנים חלקיקים מתחת ל -300 ננומטר לא ניתן לאתר על ידי פיזור צד של cytometer כפי שהן מפזרות יותר אור תחת זוויות גדולות שבו רוב לזרום cytometer לא אוספים אור 18. הטכניקה המתוארת כאן, מאפשרת זיהוי והניתוח של אנטיגנים מרובים על וירוסים או מכוניות חשמליות אישיים רבים על ידי cytometers תזרים הקונבנציונלי עם קרינה מפעיל. השלבים הקריטיים בתוך הפרוטוקול הם הצימוד של נוגדני MNPs. הניסויים שלנו היו perforMed באמצעות 15 חלקיקי תחמוצת ברזל ננומטר עם חומצה קרבוקסילית כקבוצה תגובתי כפי שתואר לעיל 9. לדברי היצרן, כל 15 MNP ננומטר יכול להיקשר לכל היותר 20 נוגדנים; אנו לאגד כ 10 נוגדנים לכל 15 ננומטר MNP. הערכה זו מבוססת על כמות הנוגדנים לפני ואחרי צימוד ומספר חרוזים / מ&quot;ל, כפי שהיא נמדדת על ידי אפיון nanoparticle ומכשור אומדת. באופן עקרוני, צימוד עלול לגרום צבירה של חלקיקים ואף אינו רצוי. כדי לבדוק צבירה זה לא קורית עם הפרוטוקול שלנו, אנו מאמתים את זה עם אפיון nanoparticle ומכשור אומד. מכשיר זה מודד את הקוטר הידרודינמית עבור החלקיקים, הכולל את שכבות ציפוי נוגדנים ולא ליבת 15 ננומטר בלבד. מצאנו כי הרוב המכריע של חרוזים בשילוב נמצאים בשיאם יחיד (ממוצע השיא ב 64.7 ± 4.2 ננומטר עם 90% מכלל האירועים להלן 73 ± 7.3 ננומטר). הערבוב של שיתוף Ab-MNPmplexes עם virions או מכוניות חשמליות בפרופורציה הנכונה חשוב, כך MNPs נמצא הריכוז של כמה הזמנות גבוהות יותר מאשר כלי הרכב חשמלי / virions. דבר זה הוא קריטי על מנת להבטיח כי יחיד כלי רכב חשמליים / virions מנותחים. הימנע צירופי מקרים של אירועים על ידי הפעלת cytometer ב זרימה נמוכה. ודא כדי לעורר את הרכישה על קרינה ולהשתמש שולטת נפח למדוד את הריכוז של הגופים שנתפסו. עם זאת, MNPs יכול לצבור כלי רכב חשמליים או virions ידי crosslinking או על ידי קשירה של שניים או יותר virions לאותו ננו-חלקיקים. כדי לבדוק זאת, מבחן עבור צבירה כמתואר באיור 4 צריך להתבצע. אפילו ברמת הפרט נתפס virions או מכוניות חשמליות רשאי להיכנס קרן הלייזר בו זמנית של זרימת cytometer. בכך ייווצר-חיוביות כוזבות עבור שני אנטיגנים שונים. כדי להימנע מכך, cytometer הזרימה צריך להיות מוגדר כמתואר וההכנות צריכות להיות מדוללות. אפשר לבדוק אם זה מקרה שקורה באמצעות אותוהאסטרטגיה כמתואר לנקודה הקודמת. כמו כן, חוסר מקרה יכול להיות מאומת על ידי ניתוח דילולים סדרתי של הכנה להוכיח כי מספר האירועים פוחתת באופן ליניארי עם דילול בעוד עוצמת הקרינה הממוצעת של אנטיגן fluorescently מוכתם נשאר קבוע בכל דילולים (איור 5). בעיה נוספת היא שמעט מדי וירוסים / כלי רכב חשמליים יכולים להיות בשבי. זה יכול להיות בגלל המחסור האמיתי של וירוסים / כלי רכב חשמליים שנושאים אנטיגנים שדרכו הם נלכדים על ידי ספציפי MNPs. לחלופין, את היעילות של לכידה נמוכה בשל סיבות שונות (למשל, צימוד יעיל של נוגדני MNPs, הסטייה היחסית של MNPs כדי virions / כלי רכב חשמליים שפותח עבור פרוטוקול זה, וכו &#39;). כדי למנוע את האפשרות האחרונה, את היעילות של לכידה יש ​​להעריך במיוחד. בדרך כלל, את היעילות צריכה להיות בערך 90% כמו באיור 6. נוגדנים שונים יכולים להתערב בשלהפרעה סטרית אחד עם השני או עם הנוגדנים מצמידים את MNPs. כדי לוודא שזה לא קרה פרוטוקול ללכוד הפוך חייב להיבדק (כמתואר בסעיף 7. בקצרה, virions או מכוניות חשמליות צריכים להיות מוכתם ראשון עם ABS איתור פלורסנט ואז נתפס על ידי מתחמי Ab-MNP עם פרדה עוקבת משב&quot;א שתרחף על עמודות מגנטיות. יש זרימה virometry יתרונות משמעותיים ביחס לשיטות הקיימות של ניתוח הרכב אנטיגני של virions או מכוניות חשמליות. בשיטות ביוכימיות שיגרתיות לדווח על הנוכחות הכללית של חלבונים מסוימים בהכנות, אבל מספקות שום מידע על ההטרוגניות של virions או מכוניות חשמליות. זה כולל immunocapture של virions או מכוניות חשמליות על חלקיקים גדולים זמינים מסחרית. חלקיקים כאלה הם בדרך כלל של כמה מיקרונים בקוטר וכל אחד מהם יכול ללכוד מאות או אלפי virions או מכוניות חשמליות. לכן, כל ממוצעים לניתוח שלאחר מכן את המאפיינים של virions / כלי רכב חשמלייםנתפס על ידי חלקיק אחד. לעומת זאת, תזרים virometry משתמשת MNPs של 10-15 ננומטר בקוטר עם פרוטוקול המתואר לפחות 90% של אירועים מייצגים virion בודד או EV יחיד. המגבלה העיקרית היא כי אוכלוסיית virions או מכוניות חשמליות בהכנה אולי לא להיות מנותחת, אבל רק אלה נלכדים. לכן, הבחירה של אנטיגן שדרכו virions או מכוניות חשמליות נלכדים הופכת להיות קריטית. כמו כן, תזרים בניגוד cytometry מספר אנטיגנים שונים (מספר נוגדני ניאון נגד אנטיגנים שונים) הוא מוגבל על ידי המשטח הקטן של virions או מכוניות חשמליות. לבסוף, נוגדנים שונים עשויים sterically להפריע זה לזה שוב בשל קטן (לעומת התאים) משטח. הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות מותאם עבור ניתוח של כל וירוס או EV ממקור כלשהו, ​​ובלבד נוגדנים ספציפיים שבאמצעותם הם יכולים ליפול בפח זמינים. ניתוח של אנטיגנים על יתר virions פרטחוקרים של להתייחס בפתוגנזה של שברים שונים של אוכלוסיות ויראלי. יתר על כן, זיהוי של כלי רכב חשמליים פרט בפלזמה עשוי לאפשר להתחקות אחר מקורו של EVS תאים מסוימים ולדווח על תנאים נורמלים או פתולוגי של תאים אלה ואת האיברים שבם הם מתגוררים.

תאים באורגניזמים רבים-תאיים יש הרבה תכונות בודדות שעשויה להיות או ייחודי עבור תא מסוים או לפחות שייכות לקבוצות ייחודיות של תאים. גם תאים משובטים בתרבית להראות מאפיינים אישיים כפי שמעידים המורפולוגיה המגוונת שלהם. כמו כן, האינדיבידואליות של תא משתקפת המוצרים שהיא מפרישה. במקרה של זיהום ויראלי, חלקיקים נגיפיים יכולים לשאת חלבונים מהתאיים שיצר אותם. לדוגמא, ל- HIV רבי חלבוני תא מארח מוטבעי המעטפת הנגיפית וירוסים המופקים על ידי תאים שונים עשויים לשאת חלבונים האופייניים אלה 1, 2 או &quot;חתימות תא&quot;. גם בלי זיהום, תאים לשחרר לתוך שלפוחית ​​תאיים הקטנה המקיפה תקשורת (EVS). Biogenesis של שלפוחית ​​אלה והמבנה שלהם במקרים רבים דומה לזו של וירוסים, במיוחד רטרווירוסים. בשנים האחרונות זה הפך להיות ברורמכוניות חשמליות כי, אשר נחשבו בתחילה להיות &quot;אבק טסיות&quot; 3, מהוות מערכת פיזיולוגית חשובה של תקשורת בין תאים. יחד עם שתי מערכות אחרות של תקשורת בין תאית, כלומר אינטראקציות מגע תאי תאים ומולקולות מסיסות שוחררו, EVS לתאם פיזיולוגיה נורמלית משתנית שונות פתולוגיות 4, 5 כולל זיהומים נגיפיים 6, 7. למרות ששני חלקיקים נגיפיים שוחרר שלפוחית ​​תאיים הם מאוד מגוונים, הם מאופיינים בעיקר על ידי ניתוח בתפזורת שבו המאפיינים האישיים שלהם הם איבדו. שיטה דומה cytometry זרימה, אשר פנוטיפים תאים בהתבסס על אנטיגנים השונים על פני השטח שלהם, יש צורך לאפיין חלקיקים נגיפיים פרט ויראלי דמוי. למרבה הצער, EVS או virions קטן לא ניתן לנתח באמצעות ציטומגלווירוס זרימת תקןשיטות מטריה כי הם קטנים מדי כדי ליצור את האות-פיזור אור על אשר רוב cytometers להסתמך מפעילה. כדי לעקוף מגבלה זו, קרינה ניתן ליישם מפעילה. עם זאת, אם כלי רכב חשמליים או virions מגואלות נוגדני ניאון קשה להבדיל ביניהם לבין נוגדנים בחינם אגרגטים שלהם בגלל הקרינה שלהם הדומה וגדלים דומים. לאחרונה, פיתחנו שיטה תפוקה גבוהה המבוסס על ננוטכנולוגיה המאפשרת אפיון של אנטיגנים על חלקיקים קטנים בודדים באמצעות cytometers תזרים קבוע 8, 9. אנו מעסיקים MNPs לחלקיקי immunocapture של עניין, כפי שתואר על ידי קבוצות אחרות ליישומים מגוונים 10, 11, 12, 13; עם זאת, השיטה החדשנית שלנו מאפשרת בתמורה ללכידתו של במפרט פרטמטרות FIC ואחריו phenotyping של שנתפסו חלקיקים אלה על ידי cytometry זרימה באמצעות קרינה מפעילה ולא פיזור אור, בלי התערבות נוגדנים צפו חינם. לשיטה זו יש יישומים רחבים וניתן להשתמש בו כדי לאפיין את הרכב אנטיגני של כל חלקיק קטן viral- והלא-ויראלי שנוצר על ידי תאי in vivo ו במבחנה ספקה את הזמינות של נוגדני ניאון ספציפיים נגד אנטיגנים פני שטח. כבר יש לנו ליישם את הטכניקה הזו כדי ללמוד כמה בעיות ביולוגיות. בפרט, אנו הערכנו את חלוקת תא סמנים מארחים חלקיקי HIV-1 אדם 9, חקרנו את ההבשלה של וירוסים דנגי פרט (DENV) בהתבסס על ניתוח של חלבוני פני השטח שלהם 14 וחקרתי כלי רכב חשמליים משתחררים לתוך מחזור הדם של מתנדבים בריאים וחולה עם תסמונת כלילית חריפה (ACS). למרות מבוסס על עיקרון דומה,יישום של הטכניקה החדשה חייב פיתוח פרוטוקולים ספציפיים המתוארות להלן.

<table><tbody><tr><td><חזק>חומרים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>קרבוקסיל מגנטי תחמוצת ברזל ננו-חלקיקים ערכות צימוד</td><td>Ocean Nanotech</td><td>ICK-15-005</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 יחידת מסנן צנטריפוגלי עם קרום Ultracel-100</td><td>Millipore</td><td>UFC810024</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל מבחנה PP תחתונה עגולה, ללא כובע</td><td>פלקון</td><td>352002</td><td></td></tr><tr><td>DEPC מטופל איכות מים</td><td>ביולוגית&nbsp;</td><td>351-068-131</td><td></td></tr><tr><td>מפריד מגנטי SuperMAG-01&nbsp;</td><td>Ocean Nanotech</td><td>SuperMAG-01</td><td></td></tr><tr><td>Zenon R-Phycoerythrin עכבר IgG1&nbsp; ערכת תיוג</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Z25055</td><td></td></tr><tr><td>Nanosep מכשירים צנטריפוגליים עם ממברנת אומגה 100k</td><td>Pall Corp</td><td>OD100C34</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M</td><td>Corning Cellgro</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת אלבומין סרום בקר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9576-50ML</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-23</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, EM Grade, </td><td>EMS</td><td>מטוהר 15710</td><td></td></tr><tr><td>123 יחידות חרוזים&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>01-1234-42</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי CytoCount</td><td>Dako</td><td>S2366</td><td></td></tr><tr><td>AccuCheck ספירת חרוזים</td><td>Invitrogen</td><td>PCB100</td><td></td></tr><tr><td>הגדרת ציטומטר & ערכת חרוזי מעקב (CST)</td><td>BD Bioscience</td><td>642412</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiI פתרון תיוג תאים</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>V22885</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק</td></tr><tr><td>><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ומיקרו; טור MACS&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-701</td><td></td></tr><tr><td>מגנט מפריד OctoMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-108</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher</td><td>none</td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NS300</td><td>Malvern</td><td>none</td><td></td></tr><tr><td>BD LSRII זרימה ציטומטר</td><td>BD Bioscience</td><td>none</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flowjo software</td><td>Flowjo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva software</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

זרימה virometry לנתח אנטיגני ספקטרה של virions ואת תאי שלפוחית

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

תאים משחררים שלפוחיות חוץ-תאיות קטנות (EVs) לתוך המדיה שמסביב. עם זיהום הנגיף תאים משחררים גם נגיפים בעלי אותו גודל של חלק מה-EVs. גם ויריונים וגם EVs נושאים חלבונים של התאים שיצרו אותם והם הטרוגניים מבחינה אנטיגנית. למרות הגיוון שלהם, גם וירוסים וגם EVs אופיינו בעיקר על ידי ניתוח בכמויות גדולות. כאן, אנו מתארים שיטה מקורית מבוססת ננוטכנולוגיה בתפוקה גבוהה המאפשרת אפיון של אנטיגנים על חלקיקים קטנים בודדים באמצעות ציטומטרים של זרימה רגילה. וירוסים או שלפוחיות חוץ-תאיות נלכדו חיסונית עם ננו-חלקיקים מגנטיים (MNPs) של 15 ננומטר יחד עם נוגדנים המזהים את אחד האנטיגנים שעל פני השטח. הנגיפים או השלפוחיות שנתפסו הודגרו עם נוגדנים פלואורסצנטיים כנגד אנטיגנים אחרים על פני השטח. הקומפלקסים שנוצרו הופרדו על עמודות מגנטיות מנוגדנים לא קשורים ונותחו באמצעות ציטומטרי זרימה קונבנציונליים המופעלים על הקרינה. לשיטה זו יש יישומים רחבים וניתן להשתמש בה כדי לאפיין את ההרכב האנטיגני של כל חלקיקים קטנים נגיפיים ולא נגיפיים הנוצרים על ידי תאים in vivo ו-in vitro. כאן, אנו מספקים דוגמאות לשימוש בשיטה זו כדי להעריך את התפלגות סמני התא המארח על חלקיקי HIV-1 בודדים, לחקור את ההתבגרות של נגיפים בודדים של דנגי (DENV), ולחקור שלפוחיות חוץ-תאיות המשתחררות לזרם הדם.

לכידת סלקטיבי של אנטיגנים הסלולר על ידי virions HIV-1 עם &quot;זרימה virometry&quot; ניתן כיום לדמיין אנטיגנים הסלולר על חלקיקים נגיפיים בודדים. כדוגמה, התמקדנו שני אנטיגנים הסלולר נישא על ידי HIV-1, LFA-1 ו- HLA-DR. מוקדם יותר שני האנטיגנים האלה זוהו בהכנות HIV-1 נתחו בתפזורת 1. הכנו MNPs בשילוב עם אחד של נוגדנים נגד חלבון ה- HIV מעטפה, VRC01, וכבש עם אלה MNPs HIV-1 virions (HIV-1 LAI.04 או HIV-1 SF162 המיוצר בתאי דם היקפיים mononuclear (PBMCs)). בנוסף, אנו מוכתמים virions אלה עם 2G12, אחר נוגדן אנטי מעטפה. virometry הזרימה הראה ההטרוגניות גבוהה של virions HIV-1 לגבי הנוכחות של LFA-1 ו- HLA-DR. בממוצע 16.7 ± 2.0% (n = 6) ו -8.6 ± 0.3% (n = 3) של HIV-1 LAI.04 virions נשאו LFA-1 ו- HLA-DR,בהתאמה. רק 4.8 ± 0.6% (n = 3) של כל virions נמצאו חיוביות הן אנטיגנים. על זן HIV-1 האחר, HIV-1 SF162, אנטיגנים אלה נכחו 20.0 ± 4.4% (n = 6) ו -10.8 ± 1.3% (n = 6) של virions, בהתאמה, ואילו הן אנטיגנים בוצעו ב -6.5 ± 0.4% (איור 1). ההתפלגות של החלבונים התאיים הייתה תלויה התאים משוכפלים וירוס. חיים עם HIV תאי Jurkat מיוצרים virions השונה antigenically לבין תוצרת PBMCs הנגוע. Virions של HIV-1 LAI 0.4 המיוצר על ידי תאי Jurkat נשא 1.6 ± 1.4% (n = 3) ו -1.6 ± 0.7% (n = 4) LFA-1 ו- HLA-DR בהתאמה. עבור HIV-1 SF162 virions המיוצר בתאי Jurkat, פרמטרים אלה היו 7.2 ± 2.5% (n = 3) ו -5.6 ± 2.7% של (n = 4). לכן, איפור אנטיגני (לפחות עבור HLA-DR ו LFA-1) היה שונה ל- HIV-1 LAI.04 הנוצר על ידי שני תאים שוניםסוגים (p &lt;0.02). זרימת virometry כפי שהוחל על הערכה של וירוס דנגה התבגרות DENV קשורה הביטוי של חלבון PRM על virions. יישמנו זרימת virometry להעריך איזה חלק של DENV מיוצר BHK-1 ו בתאי LoVo מהווה וירוסים בוגרים. Virions הוכתמו לצבוע lipidic DiI. ניתוח של virions שנתפס פרט חשף PRM על 48.2 ± 5.3% (n = 8) של DENVs. לעומת זאת, 84.5 ± 3.4% (n = 4) של DENV המיוצר בתאי LoVo נשאו PRM. שאר virions, בהתאמה 51.8 ± 5.3% (n = 8) ו -15.5 ± 3.4% (n = 4) היו PRM שלילית (איור 2). לפיכך, זרימת virometry יכול לשמש כדי להבדיל בין DENV פרט לבגרות מלאה מ בשלה (או חלקי המבוגר) virions DENV. שלפוחית ​​תאיים שוחררה למחזור הדם של בריאהמתנדבים חולים עם תסמונת כלילית חריפה (ACS) על מנת לחקור תת EV שונה בחולים עם ACS ובקרות בריאות, אנו שבויים כלי רכב חשמליים מפלזמה העניה טסיות (PPP) על ידי MNPs מצמיד פלורסנט עם נוגדנים נגד CD31, CD41a, או CD63. מכוניות חשמליות בשבי CD31-MNPs היו מוכתמים עבור CD41a ו CD63, EVS בשבי CD41a-MNPs היו מוכתמים עבור CD31 ו CD63, ו כלי רכב חשמליים בשבי CD63-MNPs היו מוכתמים עבור CD31 ו CD41a (איור 3). הסכום של EVS בשבי CD31-MNPs וחיובית עבור אחד או שניים של נוגדני זיהוי בחולי ACS היה 3,359 [2,328; 5472] כלי רכב חשמליים / μl בהשוואה 1,272 [714; 2,157] מכוניות חשמליות / μl במתנדבים בריאים (p = 0.001). הסכום הכולל של כלי רכב חשמלי בשבי CD63 בחולי ACS בהשוואה מתנדבת בריאים היה 3,541 [1,318; 5173] כלי רכב חשמליים / μl לעומת 806 [488; 2,112] מכוניות חשמליות / μl (p = 0.007). היו 4,752 [3,238; 7173] כלי רכב חשמליים / μl בפלסמה של חולים עם ACS בשבי CD41a-MNPs, ואילו בפלסמה של מתנדבים בריאים המספר הזה היה נמוך משמעותית, 2,623 [1,927; 4188] כלי רכב חשמליים / μl (p = 0.015). באופן כללי, התוצאות שלנו מצביעות על כך, ואילו סכומי EV הוגדלו בעיקר בחולי ACS, סדר הגודל של הגידול היה שונה תת-אוכלוסיות שונות של כלי רכב חשמליים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55020/55020fig1.jpg" /> איור 1: שילוב סלקטיבי של אנטיגנים הסלולר ב- HIV-1 virions שכפול תאים מסוגים שונים. HIV (HIV-1 LAI.04 או HIV-1 SF162) virions שפורסמו על ידי PBMCs או תאים Jurkat נתפסו עם VRC01-MNPs ומוכתמת עם נוגדן אנטי gp120 השני 2G12 ועם נוגדנים ספציפיים כנגד HLA-DR ו LFA-1. ההכנות המוכתמות היו נתוני ניתוח תזרים עבור HLA-DR (פסים לבנים) ו LFA-1 (ba השחורRS). אמצעי ± SEM של שלושה עד שישה ניסויים 9. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55020/55020fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55020/55020fig2.jpg" /> איור 2: מדינת הבשלה של virions DENV. DENV מיוצר BHK-21 תאים (A, B) או בתאי LoVo (C, D) תויגו עם צבע lipidic DiI, ואחרי ultracentrifugation במדיום שיפוע צפיפות, מוכתם עבור חלבון PRM עם 2H2 נוגדנים (A, C) או עם IgG2a אלוטיפ (B, D). Virions שכותרתו אז נתפסו עם 3H5-1-MNPs נתון לזרום ניתוח 14. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55020/55020fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של זה</a>דמות. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55020/55020fig3.jpg" /> איור 3: ניתוח של EVS מחולי ACS ובקרות בריאות. כלי רכב חשמליים פלזמה נתפסו עם CD31-MNPs, CD63-MNPs או CD41a-MNPs ומוכתמת עם נוגדנים נגד CD41a ו CD63, נגד CD31 ו CD41a ונגד CD31 ו CD63, בהתאמה. מכוניות חשמליות שנתפסו, מוכתמות לפחות אחד Abs זיהוי, היו דמיינו ו מנויי ניתוח תזרים. מנתונים שהוצגו כמו עלילת נקודה עם מגוון חציון interquartile (IQR). סימני גרין: מתנדב בריא (שולט), סימנים חומים: חולי ACS. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55020/55020fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55020/55020fig4.jpg" /> איור 4: Evaluatiעל השבר של אירועי זרימת מייצגי virions פרט. (א) HIV-1. השעיה של virions חולקה לשני חלקים ומוכתמת או עם DID (פאנל משמאל) או DIO (פאנל באמצע). לאחר ערבוב, ההשעיה, שהכיל שני virions מוכתם באופן דיפרנציאלי, נלכד עם VRC01-MNPs נתון לזרום virometry (פאנל מימין). אגרגטים (אירועים כפולים בצבע) היוו פחות מ -10% של סך כל אירועים. (B - D) DENV. השעיה של virions מוכתם DiI היה מדולל באופן סדרתי שני לקפל מ 1: 2 עד 1: 256 ורכש עם HTS על cytometer זרימה (B). DiI-DENVs תויגו עם 2H2 נוגדנים (C) או-DENVs DiI נתפסו עם 3H5-1-MNPs (D). תכשירים C ו- D אז היו בדילול סדרתי שני לקפל מ 1: 2 עד 1: 256 ורכש עם HTS 14. Virions לא נראה לצבור מאז בכל המקרים ישקשר לינארי הוא בין הגורם לדילול ומספר האירועים. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55020/55020fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/55020/55020fig5.jpg" /> איור 5: איתור של חלקיקים אחת על ידי cytometer זרימה. DiI מוכתם ההשעיה DENV דוללה סדרתי שני לקפל מ 1: 2 עד 1: 2,048 ורכש באמצעות HTS על cytometer זרימה. (א) מספר הווירוסים שאותרו כפונקציה של גורם לדילול. (ב) עוצמת הקרינה החציונית (MFI) של DiI שכותרתו DENV 14. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55020/55020fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <ialt מ&quot;ג = &quot;איור 6&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55,020 / 55020fig6.jpg&quot; /&gt; איור 6: הערכת החלק היחסי של virions ואת שלפוחית תאיים שנתפסו עם MNPs מצמידים נוגדנים ספציפיים. HIV-1 virions או מכוניות חשמליות שכותרתו נתפסו עם MNPs מצמידים נוגדנים ספציפיים נתון לזרום virometry. לאחר הפרדה על עמודות מגנטיות, את הזרימה דרך (לא שמר) שברים נותחו עבור הנוכחות של virions או מכוניות חשמליות של עניין כי הוחמצו בטווח הראשון. (א) virions HIV-1 BAL תווית נתפסו עם 2G12-MNPs (פאנל משמאל). שבר זרימת הדרך נכבש מחדש נתון לזרום virometry (פנל מימין). במחזור הראשון על 95% של virions עניין נתפסו. (ב) כלי רכב חשמליים תווית נתפסו עם MNPs אנטי CD81 ומבודד על עמודות מגנטי (פאנל משמאל). שבר הזרימה דרך מחדש שנאסף ונותח (פנל מימין). בראשוןמחזור כ -99% של שלפוחית עניין נתפסו 8. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55020/55020fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

וירוסים או שלפוחיות חוץ-תאיות נלכדו חיסונית עם ננו-חלקיקים מגנטיים של 15 ננומטר יחד עם נוגדנים המזהים אנטיגנים על פני השטח. הנגיפים או השלפוחיות שנתפסו סומנו בנוגדנים פלואורסצנטיים כנגד אנטיגנים אחרים על פני השטח. הקומפלקסים שהתקבלו הופרדו בשדה מגנטי גבוה ונותחו באמצעות ציטומטרים זרימה קונבנציונליים המופעלים על פלואורסצנטיות.

זרימה Virometry לנתח אנטיגני ספקטרה של virions ואת תאי שלפוחית

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשתמש בחלקיקים מגנטיים או MNPs כדי לזהות אנטיגנים מרובים על פני השטח של נגיפים בודדים או שלפוחיות חוץ-תאיות בודדות עם ציטומטר זרימה קונבנציונאלי. שיטה זו יכולה לעזור לנו כאופי הקשר בין הפנוטיפ לתפקוד של שלפוחיות ווירוסים במחלות אנושיות, בפרט בזיהום ויראלי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת ניתוח של נגיפים בודדים או שלפוחיות חוץ-תאיות בודדות במקום ניתוח בתפזורת בו הולכים לאיבוד המאפיינים האישיים של חלקיקים אלה.שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הבדיקה הנכונה של חלקיקים נגיפיים, אך ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות בתנאי שיש נוגדנים מתאימים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שיש לאמת ולבדוק את כל השלבים לפני הניתוח כולל ההגדרה הנכונה של ציטומטר הזרימה. התחל בשילוב של 60 מיקרוליטר של MNPs לכל מצב, וחמישה מיקרוליטרים של שברי FAB מסומנים ספציפיים לאיזוטיפ של נוגדן הלכידה המעניין בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.דוגרים את התמיסה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בערבוב רציף. לאחר מכן הרטיבו מראש רכז 100K עם 300 מיקרוליטר PBS וסובבו את הרכז במיקרו-צנטריפוגה. בתום הצנטריפוגה, יש לטהר את הקומפלקסים המסומנים על עמודה של 100K ואחריה מיקרו-צנטריפוגה נוספת המשהה את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של PBS טרי.כדי ללכוד את החלקיקים המעניינים, דגרו את הנוגדן המסומן MNPs עם החלקיק המעניין לתקופת הדגירה והטמפרטורה המתאימים. לאחר מכן, חסמו כל קשירת FC לא ספציפית עם הזן המתאים של נוגדן IGG, מערבלו בעדינות ודגרו את תמיסת החלקיקים למשך שלוש עד חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הוסף את הריכוז המומלץ של היצרן של כל נוגדן זיהוי לחלקיקים או נוגדנים לבקרת איזוטיפ לדגימת בקרת האיזוטיפ למשך 20 דקות דגירה נוספות בטמפרטורת החדר.כדי להפריד את החלקיקים שנלכדו ב-MNP מהנוגדן הלא קשור, הנח תחילה עמודת הפרדה מגנטית במגנט מפריד והרטיב מראש את העמודה עם 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה. אפשר למאגר הכביסה לזרום דרך העמודה, ולאחר מכן הוסף את מתחמי חלקיקי ה-MNP לעמודה שאוספת את הזרימה במיכל פסולת. כאשר כל התמיסה המורכבת עברה דרך העמודה, יש לשטוף את העמוד שלוש פעמים עם 500 מיקרוליטר מאגר כביסה.לאחר מכן העבירו את העמודה לצינור בגודל 12 על 75 מילימטר. לאחר שלוש דקות, הוסף 200 מיקרוליטר PBS, מה שמאפשר לחרוזים לחמוק על ידי כוח הכבידה. כאשר כל ה-PBS עבר דרך העמודה, הוסף 200 מיקרוליטר PBS טרי לצינור ותקן את החלקיקים ב-200 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד.לאחר מכן, טען PBS מסונן של 0.22 מיקרון על ציטומטר זרימה והתאם את מתח ה-PMT על הציטומטר עד שה-PBS המסונן יראה אפס עד מעט מאוד אירועים. לאחר מכן הפעל את החלקיקים שנלכדו ב-MNP באמצעות זרימה נמוכה עם מסנן מקוון של 0.04 מיקרון לנוזל נדן הממוקם בסדרה מאחורי מסנן המעטפת הסטנדרטי של 0.2 מיקרון כדי למנוע עוד יותר אירועי שווא. בעזרת וירומטריית זרימה, ניתן כעת לדמיין אנטיגנים תאיים על חלקיקים נגיפיים בודדים.לדוגמה, בניסוי זה נצפתה הטרוגניות גבוהה של נגיפים של HIV-1 לנוכחות LFA-1 ו-HLA-DR עם לכידת חלקיקים נגיפיים שהייתה תלויה בתאים ששיכפלו את הנגיף. התבגרות נגיף הדנגי קשורה לביטוי של חלבוני ממברנה קודמים על הוויריונים שניתן להבחין בהם באמצעות וירומטריית זרימה כפי שהודגם זה עתה. בניסוי מייצג זה, שלפוחיות חוץ-תאיות נלכדו מפלזמה דלה בטסיות באמצעות נוגדנים פלואורסצנטיים שונים בשילוב MNP כדי לחקור תת-קבוצות שונות של נגיפים חוץ-תאיים בחולים עם תסמונת כלילית חריפה.ניתוח וירומטריית זרימה קבע כי בעוד שמספרי השלפוחית החוץ-תאית הכוללים גדלו בעיקר בחולי תסמונת כלילית חריפה בהשוואה לביקורת תורם בריא, גודל העלייה השתנה בין תת-אוכלוסיות השלפוחית החוץ-תאיות השונות. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך שעתיים אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להגדיר כראוי את ציטומטר הזרימה שלך לפני תחילת הניתוח.פיתוח טכניקה זו פתח דרך לחוקרים בתחום הווירולוגיה והביולוגיה החוץ-תאית לחקור את תפקידם של חלקיקים אלה בתהליכים נורמליים ופתולוגיים במערכת החוץ גופית ובדגימות של בני אדם ובעלי חיים. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו PCR או ספקטרומטריית מסה כדי לענות על שאלות נוספות כמו אילו חלבונים או מולקולות RNA או DNA נושאים EVs או וירוסים שנלכדו במיוחד. אני מקווה שלאחר צפייה בסרטון זה יש לך הבנה טובה כיצד לנתח את ההרכב האנטיגני של נגיפים בודדים או שלפוחיות חוץ-תאיות בודדות.

flow-virometry-to-analyze-antigenic-spectra-virions-extracellular

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

שיטת מדידה של קינטיקס Fusion ויראלי ברמה חלקיק יחיד

ג'נומיקס וירוס אחד (SVG) הוא שיטה לבודד ולהגביר את הגנום של virons בודד. השעיות נגיפיות של מכלול מעורב מסודרים באמצעות cytometry זרימה לשקופית מיקרוסקופ עם בארות בדידות המכילות agarose, ובכך ללכוד את virion והפחתת גז הגנום במהלך עיבוד במורד הזרם. ההגברה הגנום כולו מושגת באמצעות הגברה עקירה מרובה (מד"א) וכתוצאה מכך חומר גנטי שמתאים לסידור.

בידוד ואנליזה של הגנום virions יחיד באמצעות &#39;נומיקס וירוס אחד &quot;

סרטון זה מדגים את הלכידה החיסונית של שלפוחיות חוץ-תאיות באמצעות צימודים של ננו-חלקיקים מגנטיים עם תווית פלואורסצנטית. התהליך כולל היווצרות מורכבת, צביעה בנוגדני זיהוי מסומנים פלואורסצנטית, הפרדה מגנטית וניתוח ציטומטרי זרימה לאפיון אנטיגני.

לכידה חיסונית וציטומטריית זרימה של שלפוחיות חוץ-תאיות לאפיון אנטיגני

ההחזקה של virions על פני השטח היא דרישה להדמיית virion יחיד על ידי הדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה סופר או מיקרוסקופיה כוח אטומי (AFM). כאן אנו מדגימים שיטת הכנה לדוגמה להדבקה מבוקרת של virions למשטחי זכוכית המתאימים לשימוש AFM והדמיה פלואורסצנטית ברזולוציה סופר.

הכנה לדוגמה למיקרוסקופיה של כוח אטומי של Virion יחיד והדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה במיוחד

כתב יד זה משתמש VirusMapper חבילת תוכנות הקוד הפתוח המבוססת פיג'י ליישם ניתוח חד חלקיקים לתמונות מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה כדי ליצור מודלים מדויקים של מבנה הננומטרי.

ניתוח קוד פתוח Single-חלקיק למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם VirusMapper

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את זרימת העבודה מלאה עבור בידוד מהיר של שלפוחית חוץ-תאי של דם אנושי ואפיון של סמני ספציפיים על-ידי ניתוח מעקב nanoparticle מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית. התוצאות שהוצגו להציג רמה גבוהה של הפארמצבטית, ניתן לכוונן תא תרבות supernatants.

אפיון מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית מהירה של יחיד חוץ-תאית שלפוחית בדם אנושי עם ניתוח מעקב ננו-חלקיק

מאמר זה מציע דור חדש של פלטפורמות אנליטיות רב-פרמטריות עם תפוקה מוגברת לאפיון תת-קבוצות שלפוחית חוץ-תאיות. השיטה מבוססת על שילוב של שיטות חישה ביולוגית מרובות עם אנליזות מטרולוגיות ומורפומכניות על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי, יחד עם ספקטרוסקופיית ראמאן, כדי להכשיר מטרות שלפוחיתיות הכלואות על שבב ביולוגי של מיקרו-מערך.

פלטפורמה אנליטית רב-מודאלית על שבב דימות תהודה פלסמון מרובה פני שטח לניתוח תת-קבוצות שלפוחית חוץ-תאית

כאן, אנו מתארים בדיקה חיסונית פלואורסצנטית מרובת מרבבים שפותחה לאחרונה המשתמשת במערכת ציטומטרית זרימה דו-מדווחת כדי לזהות בו זמנית שני אפיטופים ייחודיים של חלבון ספייק על חלקיקים נגיפיים שלמים של תסמונת נשימה חריפה חמורה קורונה 2 (SARS-CoV-2) שנלכדו על ידי מיקרוספרות מגנטיות מצומדות אנזים 2-2 הממירות אנגיוטנסין.

יצירת פרופיל של אפיטופים של חלבון פני השטח על חלקיקים נגיפיים על ידי אסטרטגיית Multiplex Dual-Reporter

פרוטוקול וידאו זה ממחיש כיצד לבצע טומוגרפיה של מיקרוסקופ אלקטרונים של שידור סריקה של דגימות וירולוגיה. לקבלת תוצאות מיטביות, הדגימות מוכנות על ידי הקפאה בלחץ גבוה והחלפת הקפאה לאחר מכן.

סריקת טומוגרפיה של מיקרוסקופ אלקטרונים שידור בווירולוגיה: הדמיה תלת מימדית של דגימות קפואות בלחץ גבוה, שהוחלפו בהקפאה

אנו מציגים פרוטוקול גמיש ליצירת מטגנומים איכותיים של שבר בגודל ויראלי (וירומים) מדגימות צואה אנושיות. הפרוטוקול פותח במקור לווירומיקה בקרקע, וכאן יושם בהצלחה על דגימות צואה, מה שאפשר אפיון חזק של וירוספירת המעי האנושית.

מטגנומיקה של DNA ויראלי בדגימות צואה אנושית

חקור שיטת זרימה וירומטרית לניתוח אנטיגנים בנגיפים בודדים ובשלפוחיות חוץ-תאיות באמצעות ננו-חלקים מגנטיים וציטומטריית זרימה סטנדרטית. שיטה זו מאפשרת פרופיל אנטיגני ברמת חלקיק יחיד.

זרימה Virometry לנתח אנטיגני ספקטרה של virions ואת תאי שלפוחית

גלה סרטונים נוספים