Vasodilation של כלי מבודד והבידוד של מטריקס של עכברים צמוד עור

המטרה הכוללת של הליכים אלה לבידוד מטריצה חוץ-תאית והרחבת כלי דם ex vivo היא לחקור טיפול בפפטיד מעכב IRF5 במכרסמים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על האופן שבו שינויים במטריצה החוץ-תאית יכולים להגדיל או להחליש את התקדמות המחלה. היתרון העיקרי של מחקרי הרחבת כלי הדם הוא לתת לנו תובנה על תהליכי in vivo מבלי שנצטרך לקחת בחשבון את כל מרכיבי האיתות.

ניתן ליישם את הבידוד של מטריצה חוץ-תאית לבבית על איברים אחרים כגון גפה אחורית או ריאה. הרעיון עלה לראשונה כשהתחלנו להתמקד בשכפול של פיברילין אחד בעכבר העור המתוח, וזיהינו את ההשפעה של שינוי המטריצה החוץ-תאית והתנהגות התאים. לאחר הרדמת העכבר והכנתו לניתוח, פתחו את העור בעזרת מספריים.

חיתוך מהחזה לרוחב לעצם הלסת בזהירות כדי לא להפריע לרקמה הבסיסית לכיוון קדמת הלסת. לאחר מכן נתח את עורק הפשיאליס על ידי הסרת הרקמה הרכה סביבו. תוך כדי כך, היזהר להימנע מפגיעה בעורק.

רחצו את הרקמה החשופה במאגר מגבים כדי שיישארו בריאים. לאחר שעורק הפשיאליס נחשף במלואו, אחוז בפשיאליס הפרוקסימלי לפיצול הדיסטלי הראשון למקום שבו ייחתך העורק. לאחר מכן, חתכו אותו מעורק האב ואחזו בעורק הפשיאליס בעזרת המלקחיים.

חותכים את שני הענפים היורדים מהפאשיאליס ולאחר מכן מרימים בעדינות את הכלי תוך ניתוק הקשרים לרקמה שמסביב עד להגעה לפיצול. בהתפצלות, חתכו את שני עורקי הבת כדי לשחרר את הכלי והעבירו אותו לצלחת של מאגר מגבים שם הוא יישאר לחות עד הצורך. כדי למדוד הרחבת כלי דם, התכוננו תחילה לקנולציה של הכלים.

טען פיפטות זכוכית בקוטר מסוף של 125 עד 175 מיקרון מלאות במאגר מגבים. מלאו גם מאגרי תמיסה במגבים. עכשיו קנו את הכלים המבודדים.

קושרים אותם על פיפטות זכוכית באמצעות תפר אופטי. הקפד למנוע היווצרות בועות אוויר בפיפטות . לאחר מכן, הרכיב את תאי הכלי על מיקרוסקופ הפוך עם חיבור מצלמת הווידאו.

הפעל את הסרטון דרך מערכת מדידת קליפר הווידאו למדידה על המסך של הכלים. כעת לחץ על הכלים בתהליך דו-שלבי. ראשית הרם את המאגרים המלאים במגבים בגובה מעל הכלי עבור 20 מילימטרים של כספית של לחץ.

פתח את הקו עם המגבים לכלי. כאשר הכלי לוחץ, חפש סימני דליפה סביב הקשרים ולאורך הכלי. אם לא נמצאו דליפות, הרם את המאגרים כדי לייצר 60 מילימטרים של כספית של לחץ.

לאחר מכן בדוק שוב את הכלים לאיתור נזילות. לאחר שהלחץ נשמר ללא נזילות, יש לאזן את הכלי למשך 30 דקות בלחץ זה. לאחר שיווי משקל, מדוד הרחבת כלי דם בתגובה לתרכובת ריבית.

תחילה צמצם את הספינה בחצי עד שלושה רבעים על ידי הוספת U46619. תנו לתמיסה לרחוץ את הכלים במשך שש דקות כדי להתייצב. לאחר מכן, הוסף בהדרגה את תרכובת הבדיקה לתמיסת האמבטיה כגון אצטילכולין.

כל שתי דקות יש להגדיל את ריכוז תמיסת הבדיקה באמבטיה ב -10 החל מ- 000001 טוחנת ומתקדם ל- 001 טוחנת. השינויים בהרחבת כלי הדם העלו שאלות לגבי איתות. אבל ההתמקדות שלנו היא בלב.

כדי להפחית את השימוש בבעלי חיים, בחרנו לבודד מטריצה חוץ-תאית לבבית כדי להתמקד באיתות המופעל מבחוץ. התחל באיסוף הלב מעכבר מורדם. העבירו אותו לכוס עמוסה ב-15 מיליליטר של נתרן דודציל סולפט היפרטוני.

שומרים את התמיסה תוך ערבוב עדין על צלחת ערבוב בטמפרטורת החדר למשך 18 שעות. למחרת, החלף את התמיסה ל -15 מיליליטר של 5 אחוז טריטון X100 למשך 30 דקות ואחריו 15 מיליליטר PBS למשך 15 דקות. לאחר מכן הקפיא את ה-ECM והחנקן הנוזלי בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.

לאחר ההקפאה, מעבירים את הרקמה למכתש ועלי מקוררים מראש וטוחנים אותה לאבקה. השעו את האבקה ב-PBS בתוספת אנטיביוטיקה בריכוז של 1:100 בתמיסה צמיגה. סוניקציה של המתלה למשך 30 עד 60 שניות באמבט קרח בהגדרת סוניקציה גבוהה.

חלבון ECM מבודד כעת וחייב להישאר קר. לפני השימוש בחלבון, יש למדוד את ריכוזו באמצעות בדיקת ברדפורד. פפטיד IRF5D הוא פפטיד מעכב השונה מאוד מ-IRF5 רגיל.

ל-IRF5D יש רק 17 חומצות אמינו והוא נקשר לאתר הזרחן של IRF5. זה מונע זרחון והומודימריזציה, ובכך מפריע להיווצרות המצב הפעיל IRF5. עכברי עור מתוחים הטרוזיגוטיים טופלו ב-IRF5D תת עורי במשך שלושה שבועות.

מספר הנויטרופילים וה-CD64 ירד כפי שנקבע על ידי אימונוהיסטוכימיה במספר הממוצע של תאים מוכתמים לשדה ראייה. טיפולי IRF5D שיפרו את הרחבת כלי הדם המושרה על ידי אצטילכולין של עורקי פאשיאליס בעכברי עור מתוחים הטרוזיגוטיים שטופלו ב-IRF5D בהשוואה לאלו שטופלו במאגר פוספט. בתרבית מיוציטים שמקורם ברקמת הלב של העכברים הטרנסגניים, היו יותר תאים חיוביים ל-IRF5 בתרביות מעכברים הטרוזיגוטיים בעלי עור מתוח מאשר בעכברי ביקורת.

טיפול בכל אחת מהתרביות עם IRF5D הביא להפחתה של גרעינים חיוביים ל-IRF5. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע דה-סלולריזציה של לב. לאחר שליטה, ניתן להעביר טכניקה זו לאיברים רבים ולסייע לענות על מגוון שאלות וזכרו שחשוב לא לעכל יתר על המידה את המטריצה.

אתה צריך גם להבין היטב כיצד לנתח ולתלות את עורק הפשיאליס. לאחר שליטה, טכניקה זו אמורה להימשך כ-60 דקות וניתן להשתמש בה כמעט על כל מיטת כלי דם. חשוב לזכור עד כמה האנדותל שברירי, המשך בזהירות במהלך הדיסקציה.

זה לא נדיר שיש שריר חלק בריא ואנדותל פגום.