Vasodilation של כלי מבודד והבידוד של מטריקס של עכברים צמוד עור
24 במרץ 2017
אנו מתארים את הבידוד של מטריצה חוץ-תאית לבבית מעכברי ביקורת C57Bl/6J, עכברים בעלי עור מתוח ועכברים בעלי עור מתוח שטופלו בפפטיד מעכב IRF5. אנו מתארים גם את מחקרי הרחבת כלי הדם על כלי הדם המבודדים מ-C57Bl/6J, עכברים בעלי עור מתוח ועכברים בעלי עור מתוח שטופלו בפפטיד מעכב IRF5.
המטרה הכוללת של הליכים אלה לבידוד מטריצה חוץ-תאית והרחבת כלי דם ex vivo היא לחקור טיפול בפפטיד מעכב IRF5 במכרסמים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על האופן שבו שינויים במטריצה החוץ-תאית יכולים להגדיל או להחליש את התקדמות המחלה. היתרון העיקרי של מחקרי הרחבת כלי הדם הוא לתת לנו תובנה על תהליכי in vivo מבלי שנצטרך לקחת בחשבון את כל מרכיבי האיתות.
ניתן ליישם את הבידוד של מטריצה חוץ-תאית לבבית על איברים אחרים כגון גפה אחורית או ריאה. הרעיון עלה לראשונה כשהתחלנו להתמקד בשכפול של פיברילין אחד בעכבר העור המתוח, וזיהינו את ההשפעה של שינוי המטריצה החוץ-תאית והתנהגות התאים. לאחר הרדמת העכבר והכנתו לניתוח, פתחו את העור בעזרת מספריים.
חיתוך מהחזה לרוחב לעצם הלסת בזהירות כדי לא להפריע לרקמה הבסיסית לכיוון קדמת הלסת. לאחר מכן נתח את עורק הפשיאליס על ידי הסרת הרקמה הרכה סביבו. תוך כדי כך, היזהר להימנע מפגיעה בעורק.
רחצו את הרקמה החשופה במאגר מגבים כדי שיישארו בריאים. לאחר שעורק הפשיאליס נחשף במלואו, אחוז בפשיאליס הפרוקסימלי לפיצול הדיסטלי הראשון למקום שבו ייחתך העורק. לאחר מכן, חתכו אותו מעורק האב ואחזו בעורק הפשיאליס בעזרת המלקחיים.
חותכים את שני הענפים היורדים מהפאשיאליס ולאחר מכן מרימים בעדינות את הכלי תוך ניתוק הקשרים לרקמה שמסביב עד להגעה לפיצול. בהתפצלות, חתכו את שני עורקי הבת כדי לשחרר את הכלי והעבירו אותו לצלחת של מאגר מגבים שם הוא יישאר לחות עד הצורך. כדי למדוד הרחבת כלי דם, התכוננו תחילה לקנולציה של הכלים.
טען פיפטות זכוכית בקוטר מסוף של 125 עד 175 מיקרון מלאות במאגר מגבים. מלאו גם מאגרי תמיסה במגבים. עכשיו קנו את הכלים המבודדים.
קושרים אותם על פיפטות זכוכית באמצעות תפר אופטי. הקפד למנוע היווצרות בועות אוויר בפיפטות . לאחר מכן, הרכיב את תאי הכלי על מיקרוסקופ הפוך עם חיבור מצלמת הווידאו.
הפעל את הסרטון דרך מערכת מדידת קליפר הווידאו למדידה על המסך של הכלים. כעת לחץ על הכלים בתהליך דו-שלבי. ראשית הרם את המאגרים המלאים במגבים בגובה מעל הכלי עבור 20 מילימטרים של כספית של לחץ.
פתח את הקו עם המגבים לכלי. כאשר הכלי לוחץ, חפש סימני דליפה סביב הקשרים ולאורך הכלי. אם לא נמצאו דליפות, הרם את המאגרים כדי לייצר 60 מילימטרים של כספית של לחץ.
לאחר מכן בדוק שוב את הכלים לאיתור נזילות. לאחר שהלחץ נשמר ללא נזילות, יש לאזן את הכלי למשך 30 דקות בלחץ זה. לאחר שיווי משקל, מדוד הרחבת כלי דם בתגובה לתרכובת ריבית.
תחילה צמצם את הספינה בחצי עד שלושה רבעים על ידי הוספת U46619. תנו לתמיסה לרחוץ את הכלים במשך שש דקות כדי להתייצב. לאחר מכן, הוסף בהדרגה את תרכובת הבדיקה לתמיסת האמבטיה כגון אצטילכולין.
כל שתי דקות יש להגדיל את ריכוז תמיסת הבדיקה באמבטיה ב -10 החל מ- 000001 טוחנת ומתקדם ל- 001 טוחנת. השינויים בהרחבת כלי הדם העלו שאלות לגבי איתות. אבל ההתמקדות שלנו היא בלב.
כדי להפחית את השימוש בבעלי חיים, בחרנו לבודד מטריצה חוץ-תאית לבבית כדי להתמקד באיתות המופעל מבחוץ. התחל באיסוף הלב מעכבר מורדם. העבירו אותו לכוס עמוסה ב-15 מיליליטר של נתרן דודציל סולפט היפרטוני.
שומרים את התמיסה תוך ערבוב עדין על צלחת ערבוב בטמפרטורת החדר למשך 18 שעות. למחרת, החלף את התמיסה ל -15 מיליליטר של 5 אחוז טריטון X100 למשך 30 דקות ואחריו 15 מיליליטר PBS למשך 15 דקות. לאחר מכן הקפיא את ה-ECM והחנקן הנוזלי בצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.
לאחר ההקפאה, מעבירים את הרקמה למכתש ועלי מקוררים מראש וטוחנים אותה לאבקה. השעו את האבקה ב-PBS בתוספת אנטיביוטיקה בריכוז של 1:100 בתמיסה צמיגה. סוניקציה של המתלה למשך 30 עד 60 שניות באמבט קרח בהגדרת סוניקציה גבוהה.
חלבון ECM מבודד כעת וחייב להישאר קר. לפני השימוש בחלבון, יש למדוד את ריכוזו באמצעות בדיקת ברדפורד. פפטיד IRF5D הוא פפטיד מעכב השונה מאוד מ-IRF5 רגיל.
ל-IRF5D יש רק 17 חומצות אמינו והוא נקשר לאתר הזרחן של IRF5. זה מונע זרחון והומודימריזציה, ובכך מפריע להיווצרות המצב הפעיל IRF5. עכברי עור מתוחים הטרוזיגוטיים טופלו ב-IRF5D תת עורי במשך שלושה שבועות.
מספר הנויטרופילים וה-CD64 ירד כפי שנקבע על ידי אימונוהיסטוכימיה במספר הממוצע של תאים מוכתמים לשדה ראייה. טיפולי IRF5D שיפרו את הרחבת כלי הדם המושרה על ידי אצטילכולין של עורקי פאשיאליס בעכברי עור מתוחים הטרוזיגוטיים שטופלו ב-IRF5D בהשוואה לאלו שטופלו במאגר פוספט. בתרבית מיוציטים שמקורם ברקמת הלב של העכברים הטרנסגניים, היו יותר תאים חיוביים ל-IRF5 בתרביות מעכברים הטרוזיגוטיים בעלי עור מתוח מאשר בעכברי ביקורת.
טיפול בכל אחת מהתרביות עם IRF5D הביא להפחתה של גרעינים חיוביים ל-IRF5. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע דה-סלולריזציה של לב. לאחר שליטה, ניתן להעביר טכניקה זו לאיברים רבים ולסייע לענות על מגוון שאלות וזכרו שחשוב לא לעכל יתר על המידה את המטריצה.
אתה צריך גם להבין היטב כיצד לנתח ולתלות את עורק הפשיאליס. לאחר שליטה, טכניקה זו אמורה להימשך כ-60 דקות וניתן להשתמש בה כמעט על כל מיטת כלי דם. חשוב לזכור עד כמה האנדותל שברירי, המשך בזהירות במהלך הדיסקציה.
זה לא נדיר שיש שריר חלק בריא ואנדותל פגום.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר את בידוד המטריקס החוץ-תאי של הלב ממודלים שונים של עכברים ואת מחקרי ההרחבה של כלי הדם (vasodilation) שבוצעו לאחר מכן. המיקוד הוא בהבנת ההשפעות של טיפול בפפטיד מעכב של IRF5 על התקדמות המחלה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביולוגיה קרדיווסקולרית
- מחקר על המטריקס החוץ-תאי
רקע
- בידוד של המטריצה החוץ-תאית הוא חיוני לחקר תפקידה במחלה.
- IRF5 מעורב בהתקדמות של מחלות מסוימות.
- עכברים מסוג Tight-skin מראים תכונות משתנות של המטריצה החוץ-תאית.
- מחקרים של התרחבות כלי דם מספקים תובנות לגבי תפקוד כלי הדם.
מטרת המחקר
- בידוד של המטריקס החוץ-תאי של הלב לצורך ניתוח נוסף.
- הערכת ההשפעה של פפטיד מעכב IRF5 על תגובות כלי דם.
- הבנה כיצד שינויים במטריקס החוץ-תאי משפיעים על התקדמות המחלה.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- בידוד מטריצה חוץ-תאית לבבית ממודלים של עכברים.
- בדיקות התרחבות כלי דם (vasodilation) ex vivo על כלי דם מבודדים.
- השוואה בין התגובות של עכברי ביקורת לעכברים שעברו טיפול.
- הכנה כירורגית של עכברים לצורך בידוד המטריצה.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של מטריצה חוץ-תאית לבבית מזני עכברים שונים.
- תגובות הווסודילציה השתנו בין עכברי ביקורת לעכברים שטופלו בפפטיד IRF5.
- השגת תובנות לגבי תפקידה של המטריצה החוץ-תאית בתפקוד כלי הדם.
- יישומים פוטנציאליים של שיטת הבידוד לאיברים אחרים.
מסקנות
- המחקר מדגיש את חשיבותה של המטריצה החוץ-תאית לבריאות קרדיווסקולרית.
- טיפול בפפטיד מעכב של IRF5 מראה פוטנציאל בשינוי תגובות כלי דם.
- נדרש מחקר נוסף כדי לבחון את ההשלכות על ניהול המחלה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית ביצועית
שיטה זו מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית עבור IRF5 כמטרה טיפולית, על ידי קישור של עיצוב מחדש של המטריצה החוץ-תאית לתפקוד כלי דם לקוי בפיברוזיס דלקתית. בדיקת ההרחבה של כלי הדם (vasodilation) ex vivo מספקת מדדים כמותיים וניתנים לשחזור של תפקוד האנדותל ללא השפעה של גורמים מערכתיים מבלבלים, ובכך תומכת בתיקוף המטרה במודלים פרה-קליניים. בידוד של מטריצה חוץ-תאית הרלוונטית למחלה מקל על סריקה פנוטיפית והבהרת מסלולים לצורך גילוי תרופות אנטי-פיברוטיות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן את ההיפותזה הטיפולית לפיה עיכוב של IRF5 מפחית סיגנלינג פרו-דלקתי והשקעה של מטריקס חוץ-תאי בעכברים עם עור מהודק (tight-skin mice).
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף פונקציונלי של מטרה באמצעות מדידה של תעתוק גרעיני של IRF5 וביטוי ICAM במורד המסלול במיוציטים של הלב.
- ערך ניבוי: תומך בסינון תיקי פיתוח על ידי הדגמת שיפור בהתרחבות כלי דם אנדותליאלית כביומארקר פונקציונלי למעורבות המטרה.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מוכנות הבדיקה: מטריצה חוץ-תאית לבבית מבודדת מספקת מערכת סטנדרטית הרלוונטית למחלה להערכת השפעות של תרכובות על התנהגות תאים ואיתות.
- פלט כמותי: מדידות של התרחבות כלי דם ex vivo באמצעות עקומות תגובה למינון של acetylcholine מאפשרות הערכה מדויקת של תפקוד האנדותל בעורקים facialis מבודדים.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: ניתן להשליך את פרוטוקול בידוד ה-ECM על מיטות כלי דם של הגפה האחורית, הריאה או מיטות כלי דם אחרות כדי לתמוך בתיקוף מטרות חוצה-איברים.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- רלוונטיות למחלה: משתמש במודל העכבר בעל העור המהודק, המפגין פיברוזיס ותפקוד כלי דם לקוי המקבילים לסקלרודרמה בבני אדם.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין עיכוב של IRF5 לבין הפחתה בשינויים של המטריצה החוץ-תאית ושיפור בהרחבת כלי דם (vasodilation), ובכך תומך בהפחתת סיכונים מנגנונית לצורך תרגום קליני.
- תועלת של מודל פרה-קליני: מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם-סיכונים על ידי הדגמת שיפור בתפקוד כלי הדם המתווך על ידי המטרה, לאחר מתן תת-עורי כרוני.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד להערכת יעילות פרה-קלינית, ומאפשרת תכנון איטרטיבי של תרכובות מווסתות IRF5 בהתבסס על פנוטיפים של כלי דם ומטריקס.
- ביולוגיה של התגליות: תומך בבדיקת היפותזות על ידי בידוד של המטריקס החוץ-תאי כדי לחקור סיגנלינג Outside-in המניע את הפעלת IRF5 ותגובות פרו-דלקתיות.
- סריקה: מספק רקמות וסקולריות מוכנות לבדיקה עם תגובות וזודילטציה הניתנות לשחזור, לצורך הערכת העוצמה והסלקטיביות של תרכובות.
- אנליטיקה: מספק מדידות כמותיות של משתנים תלויים (שינויים בקוטר כלי הדם) ופלטים סטטיסטיים (EC50, % וזודילטציה) להשוואת השפעות הטיפול בין קבוצות.
- מחקר תרגומי: מקשר בין מעורבות של מטרה מולקולרית (הפחתה גרעינית של IRF5) לתוצאות ברמת הרקמה (עיצוב מחדש של ה-ECM) ושיפור תפקודי (וזודילטציה) במערכת הרלוונטית למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס יכולת ניתנת לשימוש חוזר לחקר אינטראקציות בין המטריקס החוץ-תאי לכלי הדם במערכות איברים ובמודלים של מחלות מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי בידוד התפקוד הווסקולרי ממשתנים סיסטמיים, ובכך מגביר את הביטחון בקשרי הגומלין בין המטרה למחלה.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של נהלי הרחבת כלי דם (vasodilation) ובידוד ECM, מה שמשפר את השחזוריות בין מעבדות שונות ומאפשר שיתופי פעולה רב-תחומיים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) על ידי קישור עיכוב המטרה לתוצאות וסקולריות תפקודיות, ובכך מפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים של תוכניות לטיפול בפיברוזיס.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם-סיכון של טיפולים המכוונים ל-IRF5 בהתבסס על שיפור מוכח בתפקוד האנדותל ובהומיאוסטזיס של המטריקס.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בדיסקציה של מיקרו-כלי דם, במיוגרפיה של לחץ ובביוכימיה של המטריצה החוץ-תאית.
- תלוי במיכשור ייעודי הכולל מערכות קליפר וידאו, מיקרוסקופים הפוכים ומאגרי לחץ למחקרי התרחבות כלי דם.
- מחייב סטנדרטיזציה של הטיפול ברקמה, הרכב התמיסות (MOPS) ופרוטוקולי התכווצות (pre-constriction באמצעות U46619) כדי להבטיח השוואתיות של הנתונים.
- כולל שיקולי התאמה בעת יישום בידוד ECM לרקמות שאינן לבביות, כולל אופטימיזציה של ריאגנטים לדה-צלולריזציה (SDS, Triton X-100) ושל משך הזמן.
- מגבלה מעשית: שבריריות האנדותל המבודד מחייבת טכניקה קפדנית כדי למנוע נזק מכני במהלך קנולציה והלחצה של כלי הדם.
