Name: טיפוח Elegans Caenorhabditis ב בשלושה ממדים במעבדה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: למד לטפל בנמטודות Caenorhabditis elegans במערכת תלת-ממדית שמדמה תנאי טבע. שיטה זו משפרת את הבנת התפתחות, פיזיולוגיה והתנהגות הנמטודות במעבדה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי ניו החוקר גרנט [2014R1A1A1005553] מן קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) כדי ג&#39;יל; ומענק אתגר העתיד אוניברסיטת Yonsei המנהיג [2015-22-0133] כדי ג&#39;יל

1. הכינו פתרונות עבור NGT-3D ו NGB-3D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות סטרילי הבאים: 1 ליטר של 0.1454 פתרון M NaCl, 1 ליטר של 1 M CaCl 2, 1 ליטר של 1 M MgSO 4, מרק Lysogeny (LB), 1 ליטר של 1 M KPO 4 חיץ (108.3 גרם של KH 2 4 PO ו 35.6 גרם של K 2 HPO 4, ולמלא H 2 O ל L 1). הפקה של NGM באמצעות פתרונות אלה ניתן למצוא בפרוטוקול קודם 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרונות חיטוי ב 121 ° C, 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 מ&quot;ל של פתרון 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​כולסטרול סטרילי. בתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל, לערבב 0.25 גרם של כולסטרול ו -50 מ&quot;ל של אתנול 99.99% ומערבבים היטב. אל חיטוי. לעקר את הפתרון כולסטרול באמצעות מזרק 50 מ&quot;ל עם מסנן מזרק 0.45 מיקרומטר. זה יהיה גם להסיר כל כולסטרול שלא נמס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) הכן 10 מ&quot;ל של 150 מ&quot;מ של 2&#39;-deoxy-5-fluorouridine המניות (FUDR). בתוך צינור חרוטי 15 מ&quot;ל, לערבב 0.3693 גרםשל FUDR ו -10 מ&quot;ל מים מזוקקים. נער היטב. </li></ol> 2. כן תרבות חיידקים עבור NGT-3D ו NGB-3D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן 10 מ&quot;ל מרק LB עם חיידקים. החיידקים הסטנדרטיים המשמשים עבור אלגנס האכלה הוא OP50 זן החיידק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות חיסון החיידקים על 37 מעלות צלזיוס חממה רועדת הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקראת דילול סדרתי, aliquot 9 מ&quot;ל של פתרון NaCl לתוך צינורות חרוטי 15 מ&quot;ל סטרילי. לדוגמה, aliquot 9 מ&quot;ל לתוך סך של 7 צינורות לבצע דילול 10 -7 של E. coli זן OP50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה 1,000 μl סטרילי, pipet 1 מ&quot;ל של תרבית החיידקים או התרבות חיידקים בדילול לתוך הצינור החדש סטרילי עם 9 מ&quot;ל של תמיסת NaCl ו מערבולת את התערובת 10 מ&quot;ל היטב. חזור על הפעולה עד דילול חיידקי הרצוי הוא הגיע. ההערה: דילול החיידקים הרצוי תלוי בסוג והמצב של חיידקים, כמו גם את תנאי ניסוי המדויקים.לדוגמה, 10 -6 - 10 -8 דילול של זן OP50 E. coli היה מספיק כדי להפיק מן 1 - 200 מושבות חיידקים לכל 6.5 מ&quot;ל צינור NGT-3D. תולעים שפותחו באופן מהימן ומתרבים בדרך כלל כאשר מספר מושבות היה מעל גיל 60, שאירע בשעת דילול של 10 -6 - 10 -7. לקבלת NGB-3D, השתמש דילול של 10 -8. </li></ol> 3. ביצוע NGT-3D ו NGB-3D (200 מ&quot;ל) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הכנת תרבית החיידקים, לערבב 0.6 גרם NaCl, 1 גרם אגר מגורען, ו -0.5 גרם peptone בבקבוק 500 מ&quot;ל. הכנס בר ומערבבים מגנטיים לתוך הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 195 מ&quot;ל מים מזוקקים לכסות את הפה של הבקבוק עם רדיד אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> C חיטוי 121 מעלות במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הבקבוק autoclaved חם על צלחת ומערבבים, ומערבבים במהירות בינונית במשך שעה לפחות 2. מצננים את הבקבוק עד 40 ° C. הקפד לקרר מספיק כממשיך מכאן בטמפרטורות גבוהות עלול להוביל ערפול של אגר המוגמר.עם זאת, בטמפרטורות נמוכות עלולות לגרום התקשות המוקדמת של אגר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) כדי להאיץ את תהליך הקירור, הנח את הבקבוק בתוך 15 דקות באמבט מים 40 ° C לפני הצבת בצלחת ומערבבים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הטמפרטורה של התקשורת אגר מגיע 40 ° C, להוסיף 200 μl 1 M CaCl 2, 200 μl של 5 מ&quot;ג / פתרון כולסטרול מ&quot;ל, 200 μl 1 M MgSO 4 ו -5 מ&quot;ל 1 M KPO 4 חיץ כפתרון ממשיכה לעורר לריכוזים סופי של 1 2 מ&quot;מ CaCl, 5 כולסטרול מיקרוגרם / מ&quot;ל, 1 מ&quot;מ 4 MgSO, 1 מ&quot;מ KPO 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) עבור assay תוחלת החיים NGT-3D להוסיף 80 μl של 150 מ&quot;מ FUDR לריכוז סופי של 120 מיקרומטר 12. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6 מ&quot;ל של 10 מ&quot;ל מדולל תרבית החיידקים משלב 2.4 לתוך הבקבוק ישירות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) עבור NGT-3D, להסיר 6 מ&quot;ל של התקשורת אגר לפני שלב 3.6 ו לשמור אותו חם בנפרד. מדיה זה ישמש את החיידקים ללאשכבה עליונה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת הליכים סטרילי, לוותר התקשורת לתוך תא תרבות סטרילי. ודא שהמכסה של החדר נסגרת בחוזקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי) כדי למנוע מושבות חיידקים מ טביעה על פני השטח העליונים של אגר, ליצור שכבה של תקשורת אגרה חיידקים ללא משלב 3.6.1 בחלק העליון בפני התקשורת משלב 3.7 מתקשה לחלוטין. פעולה זו תיצור אזור חיידקים ללא בחלק העליון של NGT-3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת NGT-3D, יוצקים 6.5 מ&quot;ל התקשורת לתוך מבחנות פלסטיק 8 מ&quot;ל ברור ליצור שכבה אגר חיידקים, ובזהירות לוותר 200 μl של התקשורת חיידקים חינם על גבי מדיה 3D קשוח למחצה לעשות bacteria- דק שכבה חינם על העליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת NGB-3D, יוצקים 65 מ&quot;ל של המדיה לתוך בקבוק תרבית תאים 25 ס&quot;מ 2 פלסטיק שקוף. סכום זה צריך למלא את הגוף של בקבוק תרבות 25 ס&quot;מ 2 תאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר תאים אנכיים בטמפרטורת חדר למשך שבוע כדי לאפשר מושבות חיידקים לגדוללגודל ניכר מ&quot;מ קוטר 1 לפחות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונלי) עבור assay תוחלת החיים ב NGT-3D, תאי מכסים ברדיד אלומיניום כדי למנוע השפלה לאור FUDR. </li></ol></li></ol> 4. כושר מדוד אוכלוסין תולעת על NGT-3D (Assay גודל יחסית Brood) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק תולעת L4 לבמה בעזרת חוט פלטינה לקטוף העברה בצלחת NGM חיידקים חינם. אפשר תולעת לנוע בחופשיות במשך כמה דקות כדי להסיר חיידקים מחוברים לגוף שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 4.1 וודא כי התולעת היא ללא חיידקים. באופן כללי, ולשני שידורים חוזרים של 4.1 הם מספיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות במקום התולעת הנקיה על פני השטח של תקשורת 3D במכוש חוט פלטינה. התולעת צריכה בסופו של דבר להיכנס אגר לתוך המטריצה ​​אגר 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את המכסה רופף המאפשר אוויר כלשהו להגיע לתוך הצינור, אבל מניעת ההתייבשות של התקשורת אגרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 96 שעות ב 20 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 4 ימים, לסגור את העפעפיים בחוזקה והמקוםNGT-3D תא תרבות לתוך אמבט מים 88 ° C כדי להמיס את אגר. החום הורג תולעים אך גופם נותרו על כנן. הערה: שימוש 8 מ&quot;ל צינורות עבור NGT-3D, 20 - 30 הדגירה דקות בדרך כלל מספיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה זכוכית, להעביר את התקשורת מומסת על צלחת פטרי פלסטיק 9 ס&quot;מ. טפטפות פלסטיק לא מומלצות, כמו תולעים לעתים קרובות יכולים להידבק אליהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתח סטריאו שידור, לספור את מספר תולעים בבית L3, L4, ושלבי מבוגר. אל תסמכו תולעים כי הם בשלב L2 וצעיר, במרוצת הדורות F1 ו- F2 יכול להתבלבל כאן. לפיכך, assay זה הוא assay גודל להרהר ביחס ולא assay גודל גוזל הכולל. </li></ol> תמונה 5. והתנהגות תולעת שיא על NGB-3D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק תולעת L4 לבמה בעזרת חוט פלטינה לאסוף ולהסיר כל חיידקים תקועים אל פני השטח על ידי העברה לצלחת חיידקים ללא NGM ומאפשר לו לנוע בחופשיות במשך כמה דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 5.1 לוודא ווrm הוא ללא חיידקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות במקום התולעת הנקיה על גבי במרכז השטח אגר של NGB-3D ליד הצוואר של הבקבוק במכוש חוט פלטינה. התולעת צריכה בסופו של דבר להיכנס אגר לתוך המטריצה ​​אגר 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את המכסה רופף המאפשר אוויר כלשהו להגיע לתוך הצינור, תוך מניעת ההתייבשות של התקשורת אגרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונה או להקליט את התולעת תחת מיקרוסקופ לנתח סטריאו שידור. התאם את המיקוד כתולעת עוברת דרך מטריקס 3D. </li></ol>

<ol><li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+Window+into+Biology%3A+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li>
<li>Consortium, C. E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+the+nematode+C.+elegans%3A+a+platform+for+investigating+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology.</a> Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).</li>
<li>Choi, J. I., Yoon, K. H., Kalichamy, S. S., Yoon, S. S., Lee, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+natural+odor+attraction+between+lactic+acid+bacteria+and+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">A natural odor attraction between lactic acid bacteria and the nematode Caenorhabditis elegans.</a> ISME J. 10 (3), 558-567 (2016).</li>
<li>Gaertner, B. E., Phillips, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+molecular+quantitative+genetics+and+the+systems+biology+of+natural+variation%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Res+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a platform for molecular quantitative genetics and the systems biology of natural variation.</a> Genet Res (Camb). 92 (5-6), 331-348 (2010).</li>
<li>Cutter, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+evolution+in+the+wild%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis evolution in the wild.</a> Bioessays. 37 (9), 983-995 (2015).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Felix, M. A., Braendle, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+natural+history+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The natural history of Caenorhabditis elegans.</a> Curr Biol. 20 (58), R965-R969 (2010).</li>
<li>Barriere, A., Felix, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+local+genetic+diversity+and+low+outcrossing+rate+in+Caenorhabditis+elegans+natural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">High local genetic diversity and low outcrossing rate in Caenorhabditis elegans natural populations.</a> Curr Biol. 15 (13), 1176-1184 (2005).</li>
<li>Lee, T. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NGT-3D%3A+a+simple+nematode+cultivation+system+to+study+Caenorhabditis+elegans+biology+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">NGT-3D: a simple nematode cultivation system to study Caenorhabditis elegans biology in 3D.</a> Biol Open. 5 (4), 529-534 (2016).</li>
<li>Lewis, J. A., Flemming, J. T. Basic Culture Methods. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLewis%2C+JA+%22Caenorhabditis+elegans.%3A+Modern+Biological+Analysis+of+an+Organism%22">Caenorhabditis elegans.: Modern Biological Analysis of an Organism</a>. Epstein, H. F., Shakes, D. C. 48, 4-27 (1995).</li>
<li>Choi, S. Y., Yoon, K. H., Lee, J. I., Mitchell, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Violacein%3A+Properties+and+Production+of+a+Versatile+Bacterial+Pigment%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Violacein: Properties and Production of a Versatile Bacterial Pigment.</a> Biomed Res Int. , 465056(2015).</li>
<li>Solis, G. M., Petrascheck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+in+96+well+microtiter+plates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li>
<li>Kwon, N., Pyo, J., Lee, S. J., Je, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+worm+tracker+for+freely+moving+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">3-D worm tracker for freely moving C. elegans.</a> PLoS One. 8 (2), e57484(2013).</li>
<li>Pierce-Shimomura, J. T., Chen, B. L., Mun, J. J., Ho, R., Sarkis, R., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+crawling+and+swimming+locomotory+patterns+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of crawling and swimming locomotory patterns in C. elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20982-20987 (2008).</li>
<li>Kwon, N., Hwang, A. B., You, Y. J., SJ, V. L., Je, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+C.+elegans+behavioral+genetics+in+3-D+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Dissection of C. elegans behavioral genetics in 3-D environments.</a> Sci Rep. 5, 9564(2015).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

טיפוח המעבדה של C. elegans באמצעות צלחות תקשורת צמיחת נמטודות הקלסיות היה חיוני למאות תגליות חשובות כי המחקר ב C. elegans ספקה. כאן, אנו מציגים שיטות חדשות לטפח סי אלגנס בסביבה בצורה מדויקת יותר משקפת גידול תלת מימדי הטבעי שלהם. למרות שיטות אחרות שימשו להתבונן אלגנס ב 3D 13, זהו הפרוטוקול הראשון המאפשר טיפוח תולעים במטריצה 3D מוצק. שתי השיטות שמוצגות כאן, NGT-3D ו NGB-3D, לאפשר למדענים לשאול שאלות של כושר, התפתחות וצמיחה בטיפוח 3D, וג...

חקר הנמטודה Caenorhabditis elegans במעבדה הוביל לתגליות מכוננות בתחום הביולוגיה במהלך חמשת העשורים האחרונים1. C. elegans היה האורגניזם הרב-תאי הראשון שריצף את הגנום שלו ב-19982, והוא לא יסולא בפז בהבנת התרומות של גנים בודדים להתפתחות, לפיזיולוגיה ולהתנהגות של אורגניזם שלם. מדענים מחפשים כעת להבין עוד יותר כיצד גנים אלה עשויים לתרום להישרדות ולכושר הרבייה של אורגניזמים בסביבתם הטבעית, ושואלים שאלות על אקולוגיה ואבולוציה ברמה הגנטית3-5. 
C. elegans שוב יכול לספק מערכת מצוינת לענות על שאלות אלה. עם זאת, מעט ידוע על הביולוגיה של C. elegans בבתי גידול טבעיים של נמטודות, ואין כיום שיטות לדמות תנאים טבעיים מבוקרים של C. elegans במעבדה. במעבדה, C. elegans מעובד על פני צלחות אגר שנזרעו עם חיידקי E. coli 6. בטבע, לעומת זאת, ניתן למצוא C. elegans ונמטודות קשורות המאכלסות בדלילות קרקעות ברחבי העולם, אך הן נמצאות במיוחד משגשגות בפירות נרקבים ובחומר צמחי7,8. הסביבות התלת-ממדיות המורכבות האלה שונות למדי מהסביבות הדו-ממדיות הפשוטות שאליהן תולעים נחשפות במעבדה. 
כדי להתחיל לענות על שאלות על הביולוגיה של נמטודות בסביבה תלת-ממדית טבעית יותר, עיצבנו בית גידול תלת-ממדי לגידול מעבדה של נמטודות שקראנו לו Nematode Growth Tube 3Dאו בקיצור NGT-3D. המטרה הייתה לתכנן מערכת גידול תלת מימדית המאפשרת צמיחה, התפתחות ופוריות דומות ללוחות הסטנדרטיים של 2D Nematode Growth Media (NGM)10. מערכת זו תומכת בגידול חיידקים ונמטודות לאורך כל מחזורי חייהם בתלת מימד, מאפשרת לתולעים לנוע ולהתנהג בחופשיות בתלת מימד, והיא קלה וזולה לייצור ולשימוש. 
במחקר הנוכחי, אנו מספקים שיטה שלב אחר שלב לייצור NGT-3D ולהערכת התפתחות תולעים ופוריותן. בנוסף להערכת כושר התולעים בתלת-ממד, ביקשנו לצלם, לווידאו ולהעריך את התנהגות התולעים והפיזיולוגיה שלהן בגידול תלת-ממדי. לפיכך, בנוסף ל-NGT-3D, אנו מציגים כאן שיטה חלופית הנקראת Nematode Growth Bottle 3D או NGB-3D, להדמיה מיקרוסקופית של C. elegans במהלך גידול תלת מימדי. זה יהיה חשוב במיוחד לחקר התנהגויות ידועות שזוהו בדו-ממד, ולזיהוי התנהגויות חדשות ייחודיות לטיפוח תלת-ממדי.

<table><tbody><tr><td>מרק LB, מילר (לוריא-ברטני)</td> <td>Difco</td><td>224620</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>DAEJUNG</td><td>7548-4400</td><td>58.44 MW</td></tr><tr><td>אגר, דיפקו מגורען</td><td></td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>פפטון</td><td>בקטו</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי, דיהידראט</td><td>ביו בייסיק</td><td>CD0050</td><td>2*H<תת>2O; 147.02 מגה-וואט</td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td>ביו בייסיק</td><td>CD0122</td><td>386.67 MW</td></tr><tr><td>אלכוהול אתילי</td><td>B& J</td><td>RP090-1</td><td>99.99%; 46.07 מגה-וואט</td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי,</td><td>נטול מים ביו בייסיק</td><td>MN1988</td><td>120.37 מגה-וואט</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט, מונובסיסי, נטול מים</td><td>ביו בייסיק</td><td>PB0445</td><td>136.09 מגה-וואט</td></tr><tr><td>2'-דאוקסי-5-פלואורורידין</td><td>טוקיו תעשייה כימית</td><td>D2235</td><td>246.19 מגה-וואט</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט, דו-בסיסי, נטול מים</td><td>ביו בייסיק</td><td>PB0447</td><td>174.18 מגה-וואט</td></tr><tr><td>מבחנות רב תכליתיות</td><td>Stockwell Scientific</td><td>ST.8570</td><td>8 מ"ל</td></tr><tr><td>סגירות מבחנה</td><td>Stockwell Scientific</td><td>ST.8575</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק תרבית תאים</td><td>SPL Lifescience</td><td>70125</td><td>25 ס"מ2</td></tr><tr><td>Research מיקרוסקופ סטריאו</td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td></td></tr><tr><td>ראש מצלמה צבעוני בחדות גבוהה</td><td>Nikon</td><td>DS-Fi2</td><td></td></tr><tr><td>יחידת בקרה מבוססת PC,</td><td>Nikon</td><td>DS-U3</td><td></td></tr>, <tr><td>NIS-Elements, מחקר בסיסי, תוכנת הדמיית מיקרוסקופ</td>, <td>Nikon</td><td>MQS32000</td><td></td></tr></tbody></table>

טיפוח<em&gt; elegans caenorhabditis</em&gt; ב בשלושה ממדים במעבדה

Cultivation of Caenorhabditis elegans in Three Dimensions in the Laboratory

השימוש באורגניזמים במודל גנטי כמו Caenorhabditis elegans הוביל לתגליות מכוננות בביולוגיה בחמשת העשורים האחרונים. רוב מה שאנו יודעים על C. elegans מוגבל לגידול מעבדה של נמטודות שאולי לא בהכרח משקפות את הסביבות שהן מאכלסות בדרך כלל בטבע. גידול C. elegans בבית גידול תלת מימדי הדומה יותר למטריצה התלת-ממדית שתולעים נתקלות בה בפירות רקובים ובקומפוסט צמחי בטבע יכול לחשוף פנוטיפים והתנהגויות חדשים שלא נצפו בדו-ממד. נוסף על כך, ניסויים בתלת-ממד יכולים להתייחס לאופן שבו פנוטיפים שאנו רואים בדו-ממד רלוונטיים לתולעת בטבע. כאן מוצגת שיטה חדשה שבה C. elegans גדל ומתרבה באופן נורמלי בתלת מימד. גידול של C. elegans ב-Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) יכול לאפשר לנו למדוד את כושר הרבייה של זני C. elegans או תנאים שונים בסביבה תלת מימדית. אנו מציגים גם שיטה חדשנית, הנקראת בקבוק גידול נמטודות תלת מימד (NGB-3D), לטיפוח C. elegans בתלת מימד לניתוח מיקרוסקופי. שיטות אלה מאפשרות למדענים לחקור את הביולוגיה של C. elegans בתנאים המשקפים יותר את הסביבות שהם נתקלים בהן בטבע. אלה יכולים לעזור לנו להבין את הרלוונטיות האבולוציונית הכוללת של הפיזיולוגיה וההתנהגות של C. elegans שאנו רואים במעבדה.

בניית NGT-3D היא פרוטוקול פשוט וברור שתוצאתה הוא מבחנה המלאה אגרה עם מושבות חיידקים קטנות במרווחים לאורך (איור 1 א) אגר. תולעים יכולים לנוע בחופשיות דרך מטריקס אגר, מציאה וממצים את מושבות חיידקים. כדי לברר האם אלגנס יכולים להתרבות ולגדול בדרך כלל NGT-3D, השווינו פוריות התפתחות הזחל ב -3 D עם צלחות 2D NGM סטנדרטיים. ב assay הגודל גוזל יחסית, מבוגר C. elegans הרמפרודיטים ב NGT-3D לשחזר בדיוק כמו הרמפרודיטים צלחות NG...

אנו מציגים שיטה פשוטה לבנות מערכות טיפוח נמטודות 3D נקרא NGT-3D ו NGB-3D. אלה יכולים לשמש כדי לחקור כושר נמטודות והתנהגויות בבתי גידול, כי הם יותר דומים לאזורים מחית elegans Caenorhabditis הטבעית מאשר צלחות תרבות elegans המעבדה ג 2D הסטנדרטיות.

טיפוח<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; ב בשלושה ממדים במעבדה

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר מערכת טיפוח תלת מימדית לנמטודות שעשויה לדמות טוב יותר תנאים טבעיים. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום ההתפתחות, הפיזיולוגיה וההתנהגות של C elegans. הרעיון לשיטה הזו עלה לנו לראשונה כשחקרנו התנהגות נמטודות טבעיות בפירות נרקבים, שהיא סביבה תלת-ממדית.טכניקה זו היא יתרון בהשוואה לטכניקות גידול דו-ממדיות סטנדרטיות מכיוון שנמטודות שוכנות בבתי גידול תלת מימדיים בטבע. למרות ששיטה זו פותחה גידול C elegans, ניתן ליישם אותה גם על נמטודות אחרות. מי שידגים את ההליך הזה יהיה טונג יאנג לי, סטודנט לתואר שני במעבדה שלי.כדי להתחיל בהליך זה, אוטו קלאב את התמיסות המוכנות בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, הכינו 50 מיליליטר מתמיסת הכולסטרול הסטרילית ב -5 מיליגרם למיליליטר. בצינור חרוטי של 50 מיליליטר מוסיפים 0.25 גרם כולסטרול ו -50 מיליליטר אתנול 99.99% ומערבבים היטב.לאחר מכן, יש לעקר את תמיסת הכולסטרול באמצעות מזרק של 50 מיליליטר עם פילטר מזרק מאוורר 0.45 ולהסיר כל כולסטרול לא מפותח. לאחר מכן, חסנו 10 מיליליטר מרק ליזוגני עם חיידקים. תרבית החיסון החיידקי ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד למשך הלילה.כהכנה לדילול סדרתי, הקצו תשעה מיליליטר של תמיסת הנתרן הכלורי לשבעה צינורות חרוטיים סטריליים של 15 מיליליטר. להכנת אוהל של דילול הקיפול השביעי של Opi 50 Strain E Coli. לאחר מכן, הוציאו מיליליטר אחד מתרבית החיידקים או תרבית החיידקים המדוללת לצינור חדש עם תשעה מיליליטר של תמיסת נתרן כלורי.ומערבלים היטב את התערובת. לאחר הכנת תרבית החיידקים מוסיפים 0.6 גרם נתרן כלורי, גרם אחד של מקדחה מגורענת ו -0.5 גרם פפטון בבקבוק של 500 מיליליטר. הנח מוט ערבוב מגנטי לתוך הבקבוק.לאחר מכן מוסיפים 195 מיליליטר מים מזוקקים ומכסים את הבקבוק בנייר אלומיניום. לאחר מכן, אוטו מחבק את הדגימה ב-121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, מניחים את בקבוק האוטו החם בצלחת ערבוב, מערבבים במהירות מתונה לפחות שעתיים עד שהוא מגיע ל -40 מעלות צלזיוס.לחלופין, ניתן לקרר את הבקבוק ל-40 מעלות צלזיוס על ידי הנחתו באמבט מים של 40 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפני העברתו על צלחת ערבוב. הקפד להתקרר מספיק כדי להמשיך מכאן. טמפרטורה גבוהה עלולה להוביל לעכירות של המקדחה המוגמרת, אך טמפרטורה נמוכה מדי עלולה לגרום להתקשות מוקדמת של המקדחה.כאשר הטמפרטורה של אמצעי המקדחה מגיעה ל -40 מעלות צלזיוס, הוסף סידן כלורי, תמיסת כולסטרול, מגנזיום גופרתי ומאגר אשלגן פוספט והמשיך לערבב את התמיסה. לבדיקת תוחלת חיים של NGT-3D, הוסף 80 מיקרוליטר של FUDR של 150 מילימטר למדיה כדי לקבל ריכוז סופי של 120 מיקרומולר. לאחר מכן, הסר שישה מיליליטר של מדיה מקדחה לתוך צינור חרוטי סטרילי ושמור אותו חם בחממה.מדיה זו תשמש לשכבה העליונה נטולת החיידקים. לאחר מכן, הוסף שישה מיליליטר מתרבית החיידקים המדוללת לבקבוק ישירות על ספסל מעוקר. עבור NGT-3D, שפכו 6.5 מיליליטר של מדיה לתוך מבחנות הפלסטיק השקופות בנפח שמונה מיליליטר ליצירת שכבת מקדחת חיידקים.והוציא בזהירות 200 מיקרו ליטר של המדיה נטולת החיידקים על גבי המדיה התלת מימדית הקשה למחצה כדי ליצור שכבה דקה נטולת חיידקים מעל. ואז סגור את מכסה החדר בחוזקה. עבור NGB-3D, שפכו 65 מיליליטר של מדיה לבקבוק תרבית תאי פלסטיק שקופים בגודל 25 סנטימטר רבוע.לאחר מכן מקם את החדר אנכית בטמפרטורת החדר למשך שבוע כדי לאפשר למושבות חיידקים לגדול לגודל ניכר בקוטר של מילימטר אחד לפחות. בהליך זה, בחר תולעת L בעלת ארבעה שלבים והעביר אותה לצלחת NGM נטולת חיידקים. לאחר מכן אפשר לתולעת לנוע בחופשיות במשך מספר דקות על מנת להסיר חיידקים מגופה.וחזור על ההליך פעמיים נוספות. לאחר מכן, הנח בזהירות את התולעת הנקייה על פני המדיה התלת מימדית. התולעת הייתה צריכה למעשה להכניס את המקדחה למטריצת המקדחה התלת מימדית.לאחר מכן סגור את המכסה באופן רופף כדי לדגור למשך 96 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. לאחר ארבעה ימים, סגרו היטב את המכסה והניחו את תא התרבות NGT-3D לאמבט מים בטמפרטורה של 88 מעלות צלזיוס כדי להמיס את המקדחה. בעזרת פיפטה מזכוכית מעבירים את החומר המומס לצלחת פטרי מפלסטיק באורך תשעה סנטימטרים.לאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ מנתח סטריאו שידור, ספרו את מספר התולעים בשלבים L3, L4 ובוגרים. כפי שמוצג כאן, הבנייה של NGT-3D היא פרוטוקול פשוט ופשוט שמביא למבחנה מלאה במקדחה עם מושבות חיידקים קטנות המרווחות לאורך המקדחה. כדי לאשר אם C elegans יכול להפחית ולגדול באופן נורמלי ב-NGT-3D, פוריות והתפתחות זחלים מושווים בתלת מימד עם לוחות NGM דו-ממדיים סטנדרטיים.בבדיקת גודל הדגים היחסי, הרמפרודיטים בוגרים של C elegans ב-NGT-3D התרבו בדיוק כמו הרמפרודיטים בלוחות MGM הדו-ממדיים הסטנדרטיים כאשר מושבות חיידקים נמצאות בשפע עם לפחות 60 מושבות. יתר על כן, התפתחות הזחלים ב-NGT-3D ממשיכה כרגיל גם כאשר יש הרבה מושבות חיידקים עם רוב התולעים במצב בוגר לאחר 96 שעות. עם זאת, אם מושבות חיידקים דלילות במטריצה התלת-ממדית, גם גודל הדגים היחסי וגם התפתחות הזחלים מושפעים לרעה.להלן עקומת הישרדות של האלגנים מסוג C הפראי בלוחות NGT-3D או NGM. לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך שלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מבחני תוחלת חיים וניתוח התנהגות על מנת לענות על שאלות על הזדקנות והתנהגות בתלת מימד.לאחר פיתוחה, טכניקה זו יכולה לסלול את הדרך לחוקרים בתחומי הגנטיקה לחקור שאלות על אקולוגיה ואבולוציה ב-C elegans. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לטפח נמטודות בסביבת מעבדה תלת מימדית.

cultivation-caenorhabditis-elegans-three-dimensions

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מקור: פטרסן, ק. ואחרים, בידוד ואפיון המיקרוביום הטבעי של הנמטודה המודל Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2022)סרטון זה מדגים את הבידוד והטיפוח של מיני חיידקים הקשורים ל-Caenorhabditis elegans. פירוק מבוסס חרוזים של C. elegans, ואחריו גידול סלקטיבי, מאפשר בידוד של זנים מיקרוביאליים מגוונים לניתוח נוסף.

בידוד וגידול חיידקים קשורים ל-Caenorhabditis elegans

אנו מתארים כאן פרוטוקול מתוקן לתרבות בקנה מידה גדולה של ג העוברי elegans תאים. עוברי ג elegans תאים בתרבית במבחנה באמצעות שיטה זו, מופיעים כדי לבדל ולשחזר את הביטוי של גנים באופן ספציפי בתא. טכניקות הדורשות גישה ישירה לתאים או בידוד של סוגי תאים ספציפיים מרקמות האחרות יכולות להיות מיושמות על ג elegans תאים בתרבית.

שיטה לCulturing עוברי<em&gt; ג elegans</em&gt; תאים

סי אלגנס בדרך כלל הוא גדל על צלחות אגר מוצקות או נוזליים בתרבויות זרע עם א ' coli. כדי למנוע תוצרי לוואי חיידקים מבלבול מחקרי טוקסיקולוגי ותזונתיים, אנו מנוצלים מדיום נוזלי axenic, CeHR, לגדול ולסנכרן מספר רב של תולעים עבור מגוון רחב של יישומים במורד הזרם.

Culturing Elegans Caenorhabditis בAxenic נוזלית מדיה ובריאה של תולעים מהונדסים ידי microparticle הפצצה

כאן, אנו מציגים את תולעים נימיות Caenorhabditis elegans כמודל מארח רב-תכליתי ללמוד אינטראקציה מיקרוביאלי.

נמטודות. Caenorhabditis Elegans - מודל רב תכליתי In Vivo ללמוד אינטראקציות מארח-חיידק

פרוטוקול זה מתאר שיטה לגידול בקנה מידה גדול Caenorhabditis elegans במדיה מוצק. כחלופה תרבית נוזלית, פרוטוקול זה מאפשר קבלת הפרמטרים של סולמות שונים המעובדים המבוסס על צלחת. פעולה זו מגדילה את comparability של תוצאות על-ידי השמטת את ההבדלים מטבולית מורפולוגיים בין תרבות המדיה נוזלי ומוצק.

מבוסס על צלחת Large-scale טיפוח Caenorhabditis elegans: הכנת הדוגמא על המחקר של שינויים מטבוליים בחולי סוכרת

הפרוטוקול מתאר תכנון שבבים מיקרופלואידיים פשוטים ומתודולוגיית מיקרו-פבריקציה המשמשת לגידול C. elegans בנוכחות אספקת מזון רציפה למשך עד 36 שעות. מכשיר הגדילה וההדמיה מאפשר גם הדמיה ארוכת טווח ברזולוציה גבוהה לסירוגין של תהליכים תאיים ותת-תאיים במהלך הפיתוח במשך מספר ימים.

שבב מיקרופלואידי פשוט לגדילה והדמיה ארוכת טווח של Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans הוא אחד ממיני המודל העיקריים בביולוגיה, אך כמעט כל המחקר מתבצע בהיעדר מיקרובים הקשורים אליו באופן טבעי. השיטות המתוארות כאן יסייעו לשפר את הבנתנו את מגוון המיקרובים הקשורים כבסיס למחקר פונקציונלי עתידי של C. elegans.

בידוד ואפיון המיקרוביוטה הטבעית של מודל נמטודה Caenorhabditis elegans

מיקרוקוסמוסים של קומפוסט מביאים את המגוון המיקרוביאלי שנמצא בטבע למעבדה כדי להקל על מחקר המיקרוביום ב-Caenorhabditis elegans. מובאים כאן פרוטוקולים להקמת ניסויי מיקרוקוסמוס, כאשר הניסויים מדגימים את היכולת לווסת את המגוון המיקרוביאלי הסביבתי כדי לחקור את הקשרים בין המגוון המיקרוביאלי הסביבתי לבין הרכב המיקרוביום של מעי התולעים.

מיקרוקוסמוסים של קומפוסט כסביבות טבעיות מגוונות מיקרוביאלית לחקר המיקרוביום ב-Caenorhabditis elegans

מוצג כאן פרוטוקול אופטימלי לגידול נמטודות בודדות מבודדות על מדיה מוצקה בהתקנים מרובי בארות מיקרו-מפוברקים. גישה זו מאפשרת לעקוב אחר בעלי חיים בודדים לאורך חייהם עבור מגוון פנוטיפים הקשורים להזדקנות ולבריאות, כולל פעילות, גודל וצורת גוף, גיאומטריה של תנועה והישרדות.

תרבית ארוכת טווח וניטור של Caenorhabditis elegans מבודדים על מדיה מוצקה במכשירים מרובי בארות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לתרבית נמטודות בודדות על מדיה מוצקה למעקב אחר פרמטרים פיזיולוגיים לכל החיים וכימות פלואורסצנטי. מערכת תרבית זו כוללת מחסום חומצה פלמיטית סביב בארות תולעים בודדות כדי למנוע מבעלי חיים לברוח, ומאפשרת שימוש בהתערבויות מרתיעות, כולל חיידקים פתוגניים וגורמי עקה כימיים.

תרבות ארוכת טווח של Caenorhabditis elegans בודדים על מדיה מוצקה לניטור פלואורסצנטי אורכי והתערבויות מרתיעות

למד לטפל בנמטודות Caenorhabditis elegans במערכת תלת-ממדית שמדמה תנאי טבע. שיטה זו משפרת את הבנת התפתחות, פיזיולוגיה והתנהגות הנמטודות במעבדה.

טיפוח

גלה סרטונים נוספים