טיפוח Elegans Caenorhabditis ב בשלושה ממדים במעבדה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר מערכת טיפוח תלת מימדית לנמטודות שעשויה לדמות טוב יותר תנאים טבעיים. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום ההתפתחות, הפיזיולוגיה וההתנהגות של C elegans. הרעיון לשיטה הזו עלה לנו לראשונה כשחקרנו התנהגות נמטודות טבעיות בפירות נרקבים, שהיא סביבה תלת-ממדית.

טכניקה זו היא יתרון בהשוואה לטכניקות גידול דו-ממדיות סטנדרטיות מכיוון שנמטודות שוכנות בבתי גידול תלת מימדיים בטבע. למרות ששיטה זו פותחה גידול C elegans, ניתן ליישם אותה גם על נמטודות אחרות. מי שידגים את ההליך הזה יהיה טונג יאנג לי, סטודנט לתואר שני במעבדה שלי.

כדי להתחיל בהליך זה, אוטו קלאב את התמיסות המוכנות בטמפרטורה של 121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, הכינו 50 מיליליטר מתמיסת הכולסטרול הסטרילית ב -5 מיליגרם למיליליטר. בצינור חרוטי של 50 מיליליטר מוסיפים 0.25 גרם כולסטרול ו -50 מיליליטר אתנול 99.99% ומערבבים היטב.

לאחר מכן, יש לעקר את תמיסת הכולסטרול באמצעות מזרק של 50 מיליליטר עם פילטר מזרק מאוורר 0.45 ולהסיר כל כולסטרול לא מפותח. לאחר מכן, חסנו 10 מיליליטר מרק ליזוגני עם חיידקים. תרבית החיסון החיידקי ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד למשך הלילה.

כהכנה לדילול סדרתי, הקצו תשעה מיליליטר של תמיסת הנתרן הכלורי לשבעה צינורות חרוטיים סטריליים של 15 מיליליטר. להכנת אוהל של דילול הקיפול השביעי של Opi 50 Strain E Coli. לאחר מכן, הוציאו מיליליטר אחד מתרבית החיידקים או תרבית החיידקים המדוללת לצינור חדש עם תשעה מיליליטר של תמיסת נתרן כלורי

ומערבלים היטב את התערובת. לאחר הכנת תרבית החיידקים מוסיפים 0.6 גרם נתרן כלורי, גרם אחד של מקדחה מגורענת ו -0.5 גרם פפטון בבקבוק של 500 מיליליטר. הנח מוט ערבוב מגנטי לתוך הבקבוק.

לאחר מכן מוסיפים 195 מיליליטר מים מזוקקים ומכסים את הבקבוק בנייר אלומיניום. לאחר מכן, אוטו מחבק את הדגימה ב-121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, מניחים את בקבוק האוטו החם בצלחת ערבוב, מערבבים במהירות מתונה לפחות שעתיים עד שהוא מגיע ל -40 מעלות צלזיוס.

לחלופין, ניתן לקרר את הבקבוק ל-40 מעלות צלזיוס על ידי הנחתו באמבט מים של 40 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפני העברתו על צלחת ערבוב. הקפד להתקרר מספיק כדי להמשיך מכאן. טמפרטורה גבוהה עלולה להוביל לעכירות של המקדחה המוגמרת, אך טמפרטורה נמוכה מדי עלולה לגרום להתקשות מוקדמת של המקדחה.

כאשר הטמפרטורה של אמצעי המקדחה מגיעה ל -40 מעלות צלזיוס, הוסף סידן כלורי, תמיסת כולסטרול, מגנזיום גופרתי ומאגר אשלגן פוספט והמשיך לערבב את התמיסה. לבדיקת תוחלת חיים של NGT-3D, הוסף 80 מיקרוליטר של FUDR של 150 מילימטר למדיה כדי לקבל ריכוז סופי של 120 מיקרומולר. לאחר מכן, הסר שישה מיליליטר של מדיה מקדחה לתוך צינור חרוטי סטרילי ושמור אותו חם בחממה.

מדיה זו תשמש לשכבה העליונה נטולת החיידקים. לאחר מכן, הוסף שישה מיליליטר מתרבית החיידקים המדוללת לבקבוק ישירות על ספסל מעוקר. עבור NGT-3D, שפכו 6.5 מיליליטר של מדיה לתוך מבחנות הפלסטיק השקופות בנפח שמונה מיליליטר ליצירת שכבת מקדחת חיידקים.

והוציא בזהירות 200 מיקרו ליטר של המדיה נטולת החיידקים על גבי המדיה התלת מימדית הקשה למחצה כדי ליצור שכבה דקה נטולת חיידקים מעל. ואז סגור את מכסה החדר בחוזקה. עבור NGB-3D, שפכו 65 מיליליטר של מדיה לבקבוק תרבית תאי פלסטיק שקופים בגודל 25 סנטימטר רבוע.

לאחר מכן מקם את החדר אנכית בטמפרטורת החדר למשך שבוע כדי לאפשר למושבות חיידקים לגדול לגודל ניכר בקוטר של מילימטר אחד לפחות. בהליך זה, בחר תולעת L בעלת ארבעה שלבים והעביר אותה לצלחת NGM נטולת חיידקים. לאחר מכן אפשר לתולעת לנוע בחופשיות במשך מספר דקות על מנת להסיר חיידקים מגופה.

וחזור על ההליך פעמיים נוספות. לאחר מכן, הנח בזהירות את התולעת הנקייה על פני המדיה התלת מימדית. התולעת הייתה צריכה למעשה להכניס את המקדחה למטריצת המקדחה התלת מימדית.

לאחר מכן סגור את המכסה באופן רופף כדי לדגור למשך 96 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס. לאחר ארבעה ימים, סגרו היטב את המכסה והניחו את תא התרבות NGT-3D לאמבט מים בטמפרטורה של 88 מעלות צלזיוס כדי להמיס את המקדחה. בעזרת פיפטה מזכוכית מעבירים את החומר המומס לצלחת פטרי מפלסטיק באורך תשעה סנטימטרים.

לאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ מנתח סטריאו שידור, ספרו את מספר התולעים בשלבים L3, L4 ובוגרים. כפי שמוצג כאן, הבנייה של NGT-3D היא פרוטוקול פשוט ופשוט שמביא למבחנה מלאה במקדחה עם מושבות חיידקים קטנות המרווחות לאורך המקדחה. כדי לאשר אם C elegans יכול להפחית ולגדול באופן נורמלי ב-NGT-3D, פוריות והתפתחות זחלים מושווים בתלת מימד עם לוחות NGM דו-ממדיים סטנדרטיים.

בבדיקת גודל הדגים היחסי, הרמפרודיטים בוגרים של C elegans ב-NGT-3D התרבו בדיוק כמו הרמפרודיטים בלוחות MGM הדו-ממדיים הסטנדרטיים כאשר מושבות חיידקים נמצאות בשפע עם לפחות 60 מושבות. יתר על כן, התפתחות הזחלים ב-NGT-3D ממשיכה כרגיל גם כאשר יש הרבה מושבות חיידקים עם רוב התולעים במצב בוגר לאחר 96 שעות. עם זאת, אם מושבות חיידקים דלילות במטריצה התלת-ממדית, גם גודל הדגים היחסי וגם התפתחות הזחלים מושפעים לרעה.

להלן עקומת הישרדות של האלגנים מסוג C הפראי בלוחות NGT-3D או NGM. לאחר שליטה, טכניקה זו יכולה להיעשות תוך שלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו מבחני תוחלת חיים וניתוח התנהגות על מנת לענות על שאלות על הזדקנות והתנהגות בתלת מימד.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו יכולה לסלול את הדרך לחוקרים בתחומי הגנטיקה לחקור שאלות על אקולוגיה ואבולוציה ב-C elegans. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לטפח נמטודות בסביבת מעבדה תלת מימדית.