מהיר, שיטת Scalable עבור הבידוד, הלימוד פונקציונלי, וניתוח של מטריקס תאים שמקורם

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד מטריצה חוץ-תאית מתאים מתורבתים למגוון רחב של ניסויים במורד הזרם, כדי לסייע בהבנת הפונקציות והתכונות של מטריצה חוץ-תאית ברקמות נורמליות ובתהליכי מחלה. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המטריצה החוץ-תאית, כגון הארגון, ההרכב המולקולרי, אינטראקציות החלבון או התכונות הפונקציונליות של מטריצה חוץ-תאית. כמו כן, ניתן להכין את המטריצה החוץ-תאית מכל סוג תא דבק.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע אותם בקנה מידה שונה כדי להסיר ביעילות תאים ולשמור על חלבוני מטריצה חוץ-תאיים. הדגימו את ההליך סילביה רוזיני, סטודנטית לתואר שני במעבדה שלי, ואנדרו הלוול, חוקר פוסט-דוקטורט. כדי להתחיל, תאי צלחת על הכיסוי מחליקות להדמיה של תאים חיים ומטריצה חוץ-תאית או ECM.

למחקרי מיקרוסקופיה תפרחת, ECM קבוע. או להכנת ECM שמקורו בתאים למחקרים פונקציונליים בקנה מידה קטן. דגרו את התאים בטמפרטורה ולחות מתאימים לזמן מתאים לתאים להפקיד ECM.

בדרך כלל יותר מ-16 שעות. במכסה המנוע, הכינו 20 מילי-מולרי אמוניום הידרוקסיד בכלי מתאים על ידי שימוש במים נטולי יונים כדי לדלל את תמיסת המלאי מאחד עד 14. הסר את התאים מהחממה והסר בעדינות את מדיום התרבות.

לאחר מכן מוסיפים PBS ללא סידן או מגנזיום על ידי מזיגה בעדינות על דופן המנה. נדנדו את התבשיל פעמיים ושפכו את הנוזל. לאחר מכן חזור על הכביסה פעמיים נוספות.

במכסה המנוע, הסר את שטיפת ה- PBS האחרונה, הוסף 1.5 מיליליטר אמוניום הידרוקסיד למנה של 60 מילימטר ודגר את הצלחות בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. מערבבים בעדינות את הכלים כל דקה כדי להבטיח ליזה של כל התאים. לאחר מכן, הוסיפו כמויות גדולות של מים נטולי יונים לכל מנה ונדנדו את הצלחת.

לאחר מכן שפכו את החומר המסיס אמוניום הידרוקסיד, המורכב מאמוניום הידרוקסיד, תאים ליזים ומים נטולי יונים. שטפו את שכבת ה-ECM הבלתי מסיסה בכמויות גדולות של מים נטולי יונים ארבע פעמים נוספות, כדי להבטיח הסרה מלאה של כל החומר המסיס באמוניום הידרוקסיד. חיוני שהתאים יוסרו במלואם עם שטיפות רבות במים נטולי יונים.

אם שלבים אלה אינם מבוצעים כראוי, חומר סלולרי עלול להישאר על הצלחת ולזהם את הניתוח במורד הזרם. לבדיקת ה-ECM על ידי אימונופלואורסצנטי, הסר את המים נטולי היונים הנותרים, תקן את ה-ECM על ידי הוספת 2% פרפורמלדהיד, קיצור PFA, ודגירה על הכלים בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. השתמש ב-PBS כדי לשטוף כל דגימת תיקון פעמיים, והשליך את התמיסה למיכל פסולת נוזלית לפני ביצוע מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בהתאם לפרוטוקול הטקסט.

במכסה זרימה למינרי הכינו תמיסות סטריליות של PBS ללא סידן ומגנזיום, 20 מילי-מולרי אמוניום הידרוקסיד ומים נטולי יונים על ידי העברת כל תמיסה דרך מסנן סטרילי של 0.2 מיקרומטר למיכל סטרילי מתאים. תוך שמירה על טכניקה סטרילית, השתמש ב-PBS סטרילי כדי לשטוף בעדינות את תאי יצרן המטריצה על החלקות הכיסוי שלוש פעמים. לאחר הסרת שטיפת ה- PBS הסופית, הוסיפו 1.5 מיליליטר אמוניום הידרוקסיד סטרילי לצלחת 60 מילימטר ודגרו בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות עם נדנדה לסירוגין.

הוסף כמויות גדולות של מים סטריליים נטולי יונים לכלי עם נדנדה, שפך את ליזט התא למיכל פסולת מתאים. חזור על שטיפה זו ארבע פעמים נוספות כדי להבטיח הסרה מלאה של החומר המסיס. לאחר ניסיון וכדור התאים על פי פרוטוקול הטקסט, השעו מחדש את תאי הבדיקה במדיום סטרילי טרי, והשתמשו בהמוציטומטר כדי לספור את התאים.

לאחר מכן צלח את המספר המתאים של תאי בדיקה ומדיום תרבית על ה-ECM המבודד הסטרילי על החלקות כיסוי ודגירה למשך שעתיים-שלוש או למשך הזמן הנדרש. כדי לבחון את ארגון השלד הציטולוגי של אקטין, תקן את תאי הבדיקה ב-2% PFA וצבוע אותם ב-FITC-Phalloidin כדי לדמיין את ה-F-actin, ו-DAPI כדי לדמיין את הגרעינים. לאחר גידול מספר רב של תאים, ולאחר מכן הסרת התאים ושטיפת ה-ECM כפי שהודגם קודם לכן בסרטון, הטה כל צלחת בזווית כדי לנקז את שאריות המים לתחתית הכלי והשתמש בפיפטה P200 כדי להסיר בזהירות את כל המים שנותרו עד שהצלחת יבשה לחלוטין.

במקביל יש לחמם את מאגר הדגימה SDS-PAGE המכיל 100 מילי-מולרי DDT ל-95 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות, ולהוסיף 200 מיקרוליטר לכל צלחת של 100 מילימטר לבדיקה על ידי אימונובלוט. השתמש במגרד תאים כדי לאסוף את הדגימה לצד אחד של המנה, והשתמש בקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר כדי להעביר אותה לתוך צינור. כדי לנתח את ה-ECM על ידי ספקטרומטריית מסה, הכינו דגימה מרוכזת יותר על ידי איסוף מאגר הדגימה SDS-PAGE מהצלחת, חימום מחדש ל-95 מעלות צלזיוס, ושימוש באותה אליקוטה על פני שתיים עד שלוש צלחות נוספות.

העבר כל תמצית מאגר דגימה SDS-PAGE שנותרה מקצה מגרד התאים לתוך הצינור כדי למזער את אובדן חומר ה-ECM. למיצוי יעיל של ה-ECM המבודד למאגר הדגימה SDS-PAGE, חיוני שמאגר הדגימה יחומם ל-95 מעלות, יכיל חומר מפחית ושהצלחת תגרד בהרחבה. מוצגים כאן תאי COS-7 הגדלים על פתקי כיסוי זכוכית.

טיפול באמוניום הידרוקסיד הסיר את התאים ביעילות כפי שנקבע על ידי אובדן גרעיני התא ושלד התא אקטין. באיור זה, תאי COS-7 הועברו עם תג RFP thrombospondin-1. וה-ECM הוצג לפני ואחרי הטיפול באמוניום הידרוקסיד.

ניתן להסיק כי הפונקטה הפלואורסצנטית שזוהתה בשתי התמונות קשורה ל-ECM. בניסוי זה הוסרו פיברובלסטים עוריים אנושיים עם אמוניום הידרוקסיד וה-ECM נבדק עם נוגדן אנטי-קולגן 1, שהדגים דפוס צביעה סיבי ורשת אופייני. כפי שמוצג כאן, צביעת פיברונקטין בוצעה על ה-ECM מתאי כונדרוסרקומה של חולדות שהופקו על ידי אמוניום הידרוקסיד.

בדוגמה זו, תאי COS-7 לבדיקה צופו במשך שעתיים על ECM סטרילי המיוצר על ידי תאי RCS ונותחו לארגון F-actin על ידי צביעת FITC-Phalloidin. בהשוואה לתאי COS-7 המייצרים ECM משלהם. בניסוי זה בודד ECM מתאי כונדרוסרקומה של חולדות ולאחר מכן הופרדו חלבונים שמקורם ב-ECM על ידי SDS-PAGE.

וארבע הלהקות העיקריות בודדו ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסה. זוהו פיברונקטין, טרומבוספונדין-1 ו-5 ומטרילין-1. לבסוף, ה-ECM האנדוגני של פיברובלסטים עוריים אנושיים נותח על ידי אימונובלטינג.

זוהו פיברונקטין וטרומבוספונדין-1, בעוד שהחלבונים התוך-תאיים אלפא-טובולין ובטא-אקטין נעדרו. לאחר השליטה, הסרת תאים עם אמוניום הידרוקסיד ומיצוי ECM עם מאגר דגימת SDS-PAGE חם משלוש צלחות של 100 מילימטר יכולה להיעשות תוך שעה אחת אם היא מבוצעת כראוי. בזמן ניסיון הליך זה חשוב לזכור להכין פתרונות עבודה טריים של אמוניום הידרוקסיד בכל פעם להסרת התאים.

חשוב מאוד גם להשתמש בשטיפות רבות עם מים נטולי יונים כדי לוודא שמסירים את כל התאים. בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות כגון ניתוח פרוטאומיקה של ECM שחולץ על מנת לענות על שאלות נוספות כגון שפע יחסי של חלבוני ECM המיוצרים על ידי סוגי תאים שונים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להסיר תאים ביעילות מצלחות תרבית תאים וכיצד לחלץ ECM.

אל תשכח שעבודה עם פרפורמלדהיד עלולה להיות מסוכנת ביותר ותמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון עבודה במכסה המנוע ולבישת ציוד מגן אישי בעת ביצוע הליך זה.