Name: Cryosectioning של רציף אזורים של שרירי שלד עכבר אחת על ביטוי גנים ועל ניתוח היסטולוגית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: למד שיטת קריוסקשן לניתוח רציפי אזורים משכבות סמוכות של שרירי שלד עכבר אחת. שיטה זו מאפשרת מתאם בין נתונים היסטולוגיים ומולקולריים לחקר ביולוגיית שריר ומחלות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מדיסון גרנט, סטיבן פולץ, היילי זסטרה וג'ונה לואן סיפקו סיוע טכני. המחקר המדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי לדלקת מפרקים ומחלות שרירים ושלד ועור של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר AR065077. התוכן הוא באחריות המחבר בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

<ol><li>Foltz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+skeletal+muscle+regeneration+plus+mild+alterations+in+mature+fiber+type+specification+in+Fktn-Deficient+Dystroglycanopathy+Muscular+Dystrophy+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Abnormal skeletal muscle regeneration plus mild alterations in mature fiber type specification in Fktn-Deficient Dystroglycanopathy Muscular Dystrophy Mice.</a> PLoS One. 11 (1), 0147049(2016).</li>
<li>Bartoli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+monitoring+of+therapeutic+gene+transfer+in+animal+models+of+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Noninvasive monitoring of therapeutic gene transfer in animal models of muscular dystrophies.</a> Gene Ther. 13, 20-28 (2006).</li>
<li>Ip, W. T., Huggins, C. E., Pepe, S., Delbridge, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+RNA+preparation+options+for+archived+myocardial+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Lung+Circ%22%5BJournal%5D)">Evaluating RNA preparation options for archived myocardial biopsies.</a> Heart Lung Circ. 20 (5), 329-331 (2011).</li>
<li>Beedle, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+fukutin+deletion+impairs+dystroglycan+processing+and+recapitulates+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Mouse fukutin deletion impairs dystroglycan processing and recapitulates muscular dystrophy.</a> J. Clin. Invest. 122 (9), 3330-3342 (2012).</li>
<li>Foltz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-week+rapamycin+treatment+improves+muscular+dystrophy+in+a+fukutin-deficient+mouse+model+of+dystroglycanopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Four-week rapamycin treatment improves muscular dystrophy in a fukutin-deficient mouse model of dystroglycanopathy.</a> Skeletal Muscle. 6, 20(2016).</li>
<li>AVMA Guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. , American Veterinary Medical Association (AVMA). Available from: 
 <a target="_blank" href="www.avma.org/KB/Policies/Pages/Euthanasia-Guidelines.aspx">www.avma.org/KB/Policies/Pages/Euthanasia-Guidelines.aspx</a> 1-102 (2013).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nat. Protoc. 10, 1612-1624 (2015).</li>
<li>Rump, L. V., Asamoah, B., Gonzalez-Escalona, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+commercial+RNA+extraction+kits+for+preparation+of+DNA-free+total+RNA+from+Salmonella+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res.+Notes%22%5BJournal%5D)">Comparison of commercial RNA extraction kits for preparation of DNA-free total RNA from Salmonella cells.</a> BMC Res. Notes. 3, 211(2010).</li>
<li>Desjardins, P., Conklin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoDrop+microvolume+quantitation+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids.</a> J. Vis. Exp. (45), e2565(2010).</li>
<li>Valdez, M. R., Richardson, J. A., Klein, W. H., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failure+of+Myf5+to+support+myogenic+differentiation+without+myogenin%2C+MyoD%2C+and+MRF4%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Failure of Myf5 to support myogenic differentiation without myogenin, MyoD, and MRF4.</a> Dev Biol. 219 (2), 287-298 (2000).</li>
<li>Pavlath, G. K., Dominov, J. A., Kegley, K. M., Miller, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+transgenic+skeletal+muscles+with+altered+timing+of+expression+of+the+basic+helix-loop-helix+muscle+regulatory+factor+MRF4%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Regeneration of transgenic skeletal muscles with altered timing of expression of the basic helix-loop-helix muscle regulatory factor MRF4.</a> Am. J. Pathol. 162 (5), 1685-1691 (2003).</li>
<li>Chomczynski, P., Mackey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substitution+of+chloroform+by+bromo-chloropropane+in+the+single-step+method+of+RNA+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Substitution of chloroform by bromo-chloropropane in the single-step method of RNA isolation.</a> Anal. Biochem. 225 (1), 163-164 (1995).</li>
<li>Lee, J. T. Y., Cheung, K. M. C., Leung, V. Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+RNA+from+tough+tissues+with+high+proteoglycan+content+by+cryosection%2C+second+phase+separation+and+high+salt+precipitation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Extraction of RNA from tough tissues with high proteoglycan content by cryosection, second phase separation and high salt precipitation.</a> J. Biol. Methods. 2 (2), 20(2015).</li>
<li>Guo, D., Catchpoole, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+intact+RNA+following+cryosections+of+archived+frozen+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Isolation of intact RNA following cryosections of archived frozen tissue.</a> BioTechniques. 34, 48-50 (2003).</li>
<li>Goodpaster, T., Randolph-Habecker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+flexible+mouse-on-mouse+immunohistochemical+staining+technique+adaptable+to+biotin-free+reagents%2C+immunofluorescence%2C+and+multiple+antibody+staining%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">A flexible mouse-on-mouse immunohistochemical staining technique adaptable to biotin-free reagents, immunofluorescence, and multiple antibody staining.</a> J. Histochem. Cytochem. 62 (3), 197-204 (2014).</li>
<li>Ikezawa, M., Minami, N., Takahashi, M., Goto, Y., Miike, T., Nonaka, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+gene+analysis+of+130+patients+with+Duchenne+muscular+dystrophy+with+a+special+reference+to+muscle+mRNA+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Dev%22%5BJournal%5D)">Dystrophin gene analysis of 130 patients with Duchenne muscular dystrophy with a special reference to muscle mRNA analysis.</a> Brain Dev. 20 (3), 165-168 (1998).</li>
<li>Majumdar, G., Vera, S., Elam, M. B., Raghow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streamlined+protocol+for+extracting+RNA+and+genomic+DNA+from+archived+human+blood+and+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A streamlined protocol for extracting RNA and genomic DNA from archived human blood and muscle.</a> Anal. Biochem. 474, 25-27 (2015).</li>
<li>Espina, V., Heiby, M., Pieroban, M., Liotta, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Mol+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection technology.</a> Expert Rev Mol Diagnostics. 7 (5), 647-657 (2007).</li>
</ol>

המחברת מצהירה שאין לה אינטרסים כלכליים מתחרים.

כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר עם שיטה זו, לשמור הטבעת השרף המוגבל לנמוך השליש או המחצית של השריר במהלך cryopreservation רקמות בגלל שרף עודף יאט את האוסף של cryosections ונקווה ועלול להגדיל הטבעת זיהום שרף בידוד RNA. כמו כן, תשומת לב קפדנית במהלך המגון מחט חשוב למקסם את התשואה ולהקטין את ההסתברות של סתימת המחט. הפרוטוקול ניתן לשנות באמצעות מזרק Luer-Lok כדי להגן מפני אובדן מדגם אם המחט נחסמה ודורשת בלחץ גבוה כדי לסלק את המחסום. צעד המגון מחט נוסף עם מחט מד 25 או 26 ניתן גם להוס...

מטרת טכניקה זו היא להפוך ניתוחים ניסיוניים מרובים על ידי שיטות שונות, כגון ביטוי היסטולוגיה גן, נגישות מכל רקמה ממקור שרירי שלד אחת קטנה. יישומים מיקרוסקופים הם הרגישים ביותר כדי לטעום דרכי שימור, אשר חייב להיות מבוקר בקפידה כדי להגביל את ההיווצרות של חפצי גביש הקרח במהלך cryopreservation. לפיכך, פיתוח שיטה מבוסס על קדמי tibialis (ת&quot;א) שריר קפוא מכוסה חלקית עם ההטבעה שרפה באמבט חנקן מקורר נוזל -140 ° C 2-methylbutane כחומר המקור הוא מיקרוסקופיה immunofluorescence ביטוי גני המנתח. הצורך להשתמש באותו מקור חומר עבור גישות טכניות מגוונות חשוב במיוחד עבור ניסויים מבוססי זריקה תוך שרירית שבו השרירים ימין ועל שמאל מייצגים תנאים שונים, אחד ניסוי ובקרה אחד. לדוגמה, במחקרים התחדשות שריר, mu אחדscle מוזרק עם רעלן לגרום נזק לרקמות נרחבת תוך השריר הנגדי משמש כביקורת הרכב מוזרק 1. בדומה לכך, מחקרי ריפוי גנטי להפרעות שריר בדרך כלל מתחילים עם אימות של וקטור הריפוי הגנטי על ידי זריקה תוך שרירית להיות לעומת וקטור ריק, וקטור קשור או שליטה ברכב בצד הנגדי 2. לכן, אין זה אפשרי למקור כל שריר ת&quot;א ליישום אחר. אסטרטגיות נפוצות להתמודד עם בעיה זו הן: i) להשתמש קבוצת שרירים שונה עבור כל יישום, ii) להשתמש עכברים נוספים, או iii) כדי לחתוך חתיכה של השריר עבור כל יישום. עם זאת, הבדלים משמעותיים בין קבוצות השרירות להקשות להשוות נתונים מיישומים נפרדים, וחיות נוספות להגדיל הוצאה והם גרועים מוצדקים אם קיימות חלופות אחרות. חלוקת השרירים לאחר דיסקציה למקור יישומים שונים היא i האפשרות הטוב ביותרבמקרים רבים n. עם זאת, את החלקים שרירים הם בדרך כלל קטנים מדי לשימוש אִבּוּק תחת חנקן נוזלי או טכניקות שחיקה מכנית עבור המגון 2-5. כמו שריר היא רקמה מבנית מאוד עמוסה חלבוני מטריקס התכווצות תאיים, המגון מכאני לקוי מוביל בתשואה נמוכה של DNA, RNA או חלבון שלאחר מכן. השיטה המפורטת כאן מאפשרת כמויות קטנות של רקמת שריר מקור אחד לשימוש ביישומים מרובים, וההכללה של טחינה דקה cryosectioning ומחט משפר המגון מכנה תשואת RNA טובה.

<table><tbody><tr><td>פקק</td><td>VWR מדעי</td><td>23420-708</td><td>חותכים לריבועים קטנים עם להב חד.</td></tr><tr><td>כיסוי פלסטיק</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-547</td><td>משמש לכיוון השריר במהלך ההקפאה.</td></tr><tr><td>מדחום בטמפרטורה נמוכה</td><td>VWR Scientific</td><td>89370-158</td><td></td></tr><tr><td>2-methylbutane</td><td>Sigma</td><td>M32631-4L</td><td>זהירות: כימיקל מסוכן. אחסן בארון דליק.</td></tr><tr><td>הטמעת שרף: "cryomatrix"</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>6769006</td><td>ניתן להחליף שרפי הטמעה אחרים ב-cryomatrix.</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>microm HM550 עם מנשא להב חד פעמי</td><td>כל קריוסטט עובד צריך להספיק לפרוטוקול.</td></tr><tr><td>להב קריוסטט חד פעמי</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3052835</td><td>השתמש בלהב או בסכין מתאימים לשימוש בקריוסטט.</td></tr><tr><td>פתרון טיהור RNAse: "RNase Zap"</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>איזון אנליטי</td><td>מטלר טולדו</td><td>XS64</td><td></td></tr><tr><td>מברשת צבע</td><td>Daler Rowney</td><td></td><td>214900920 השתמש לטיפול בהקפאות. ניתן למצוא בחנויות עם ציוד אמנות פשוט.</td></tr><tr><td>סכין גילוח</td><td>VWR Scientific</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>שקופית מיקרוסקופ</td><td></td><td>VWR מגיב מיצוי אורגני 48311600</td><td></td></tr><tr><td>RNA: TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>זהירות: TRIzol הוא כימיקל מסוכן. הערה: רק ריאגנטים מיצוי אורגניים מומלצים למיצוי RNA משרירי השלד.</td></tr><tr><td>מחט 18 מד</td><td>VWR מדעי</td><td>BD305185</td><td></td></tr><tr><td>22 מחט מד</td><td>VWR מדעי</td><td>BD305155</td><td></td></tr><tr><td>26 מחט</td><td>מד VWR מדעי</td><td>BD305115</td><td>אופציונלי. יכול לשמש לסבב שלישי של טריטורציה של דגימה בפרוטוקול מיצוי RNA.</td></tr><tr><td>מזרק 1 מ"ל</td><td>VWR Scientific</td><td>BD309659</td><td>לדגימות בעלות ערך גבוה מאוד, מומלץ להשתמש במזרק Luer-Lok (למשל , VWR BD309628).</td></tr><tr><td>1-bromo-3-chloropentane (BCP)</td><td>Sigma</td><td>B9673</td><td></td></tr><tr><td>עבור 70% אתנול במי DEPC: אלכוהול 200 הוכחה</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>+M18027161M</td><td>לערבב 35 מ"ל 200 אלכוהול + 15 מ"ל מים DEPC.</td></tr><tr><td>ל-70% אתנול במי DEPC: מים שטופלו ב-DEPC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9922</td><td>מערבבים 35 מ"ל 200 אלכוהול הוכחה + 15 מ"ל מים DEPC.</td></tr><tr><td>ערכת טיהור RNA: PureLink RNA minikit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12183018A</td><td>שלבים אחרונים של הכנת RNA.</td></tr><tr><td>מים ללא DNase/Rnase&nbsp;</td><td>ניתן להשתמש גם במים שטופלו ב</td><td>- Gibco</td><td>10977</td> DEPC.</tr><tr><td>ספקטרופוטומטר: Nanodrop 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2222</td><td>טפל ב-RNA מטוהר כדי להסיר כל זיהום DNA לפני יישומי הזרם.</td></tr><tr><td>עט הידרופובי</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>8899</td><td></td></tr><tr>PBS <td>Gibco</td><td>14190</td> PBS<td>של Dulbecco</td><td>לפרוטוקול אימונופלואורסצנטי.</td></tr><tr><td>סרום חמורים</td><td>Jackson ImmunoResearch Laoratories, Inc</td><td>017-000-121</td><td>לחות מלאי סרום חמורים רגיל בהתאם להוראות היצרן, ולאחר מכן יש לדלל מינון ל-5% לאימונופלואורסצנטי.&nbsp; ניתן להשתמש גם בסרום עיזים רגיל.</td></tr><tr><td>נוגדן eMHC</td><td>אוניברסיטת איווה מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה</td><td>F1.652</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן קולגן VI</td><td>פיצג'רלד תעשיות</td><td>#70R-CR009x</td><td></td></tr><tr><td>חמור נגד ארנב AlexaFluor488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>עז נגד עכבר IgG1 AlexaFluor546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21123</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6- diamidino-2-phenylindole)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>מדיית הרכבה מימית: Permafluor</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TA-030-FM</td><td>השתמש רק באמצעי הרכבה המיועדים ליישומי פלורסנט בעלי תכונות נגד דהייה.</td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית</td><td>VWR Scientific</td><td>16004-314</td><td>השתמש להרכבת שקופיות בקצה הפרוטוקל האימונופלואורסצנטי</td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח תמונה: ImageProExpress</td><td>Media Cybernetics, Inc.</td><td>Image-Pro Express, או מוצרים מתקדמים יותר</td><td>Freeware ImageJ אמור לעבוד גם עבור ספירה ידנית. תוכנה מתקדמת יותר עם יכולת פילוח עשויה לאפשר אוטומציה חלקית של התהליך; e., ImageProPremier.</td></tr><tr><td>מיזוג ומיפוי תמונות של מקטעים: Photoshop</td><td>Adobe</td><td>Photoshop</td><td></td></tr><tr><td>Cardiotoxin</td><td>Sigma</td><td>C9659</td><td>Sigma C9659 הופסק. אפשרויות אחרות לקרדיוטוקסין הן EMD Millipore #217503; American Custom Chemicals Corp. # BIO0000618; או Ge Script # RP17303; אך אלה לא אושרו.</td></tr><tr><td>ערכת שעתוק הפוך: Superscript III מערכת סינתזה של גדיל ראשון</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18080051</td><td>ניתן להשתמש בכל ריאגנטים מאומתים ואיכותיים לשעתוק הפוך.</td></tr><tr><td>PCR סטנדרטי: מערכת פולימראז GoTaq Flexi</td><td>Promega</td><td>M8298</td><td>ניתן להשתמש בכל מערכת Taq פולימראז מאומתת ואיכותית. אם יש להשתמש בריצוף DNA עבור כל יישום במורד הזרם של ה-PCR, יש להשתמש במקום זאת במערכת PCR בנאמנות גבוהה.</td></tr><tr><td>SYBR ירוק</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>S7585</td><td>לשימוש ב-qPCR כאשר לא משתמשים בתערובת מאסטר ייעודית של qPCR. השתמש עם SuperROX (עבור מכשירי Applied Biosystems) ופולימראז GoTaq Flexi ומאגרים.</td></tr><tr><td>ROX: SuperROX, 15 מ"מ</td><td>BioResearch Technologies, Inc. Novato CA</td><td>SR-1000-10</td><td>SuperROX יציב יותר בתגובת ה-PCR, ולכן הוא מועדף לשימוש כצבע ייחוס פסיבי qPCR על פני ROX (קרבוקסי-X-רודמין). עבור qPCR עם מכשירי Applied Biosystems</td></tr><tr><td>PCR בזמן אמת</td><td>Applied Biosystems</td><td>7900HT</td><td></td></tr></tbody></table>

cryosectioning של רציף אזורים של שרירי שלד עכבר אחת על ביטוי גנים ועל ניתוח היסטולוגית

Cryosectioning of Contiguous Regions of a Single Mouse Skeletal Muscle for Gene Expression and Histological Analyses

באמצעות שיטה זו, ברציפות cryosections נאספים כדי לאפשר הן יישומים במיקרוסקופ לצורך היסטולוגיה רקמה והעשרה של רנ&quot;א עבור ביטוי גנים באמצעות אזורים סמוכים מתוך שרירי השלד יחיד העכבר. בדרך כלל, אתה עשוי להתקשות להשיג הומוגניזציה נאותה דגימות שריר שלד קטנות בגלל כרכי חיץ עשויים להיות נמוכים מדי עבור יישומי שחיקה יעילים, עדיין ללא הפרעה מכאנית מספיק, ארכיטקטורת הרקמה הצפופה של חדירה לתחום שריר של ריאגנטים חיץ, גורמת בסופו של דבר תשואת RNA נמוכה. על ידי ביצוע הפרוטוקול שדווח כאן, 30 מיקרומטר חלקים נאספים ונקווים המאפשרים cryosectioning ויצירת הומוגניות מחט לאחר מכנית לשבש את השריר, הגדלת שטח הפנים החשוף לחדירת חיץ. המגבלות העיקריות של הטכניקה הן כי זה דורש cryostat, וזה יחסית תפוקה נמוכה. עם זאת, RNA באיכות גבוהה ניתן להשיג דגימות קטנות של מטר ויקווהcryosections uscle, מה שהופך שיטה זו נגישה עבור שרירי שלד ורקמות אחרות רבים ושונים. יתר על כן, טכניקה זו מאפשרת ניתוחים מתאימים (למשל, histopathology רקמות ביטוי גנים) מאזורים סמוכים של שרירי שלד יחידים כך שמדידות ניתן להשוות באופן ישיר בין יישומים כדי לצמצם את אי הוודאות ניסיונית להפחית ניסויים בבעלי חיים בשכפול הדנ&quot;א צורך למקור רקמה קטנה עבור יישומים מרובים.

RNA השרירים cryosection הוא באיכות גבוהה ומספק תשואה מספיק עבור מרבית היישומים ניתוח של שש עשר הכנות RNA שרירי שלד מוצג בלוח 1 באמצעות 19.4 כדי 41 מ&quot;ג קדמי tibialis נקווה (ת&quot;א) שריר מ 8 עכברים שליטים. עזוב שניהם (L) וימין (R) שרירי ת&quot;א נערכו ניסויי התחדשות עם שרירים שנאספו 3 ימים לאחר זריקה תוך שרירית אורך של 25 μl של ת...

קריו-סעיפים רצופים נאספים כדי לאפשר יישומים היסטולוגית והעשרה של RNA למדידות ביטוי גנים באמצעות אזורים סמוכים מתוך שרירי שלד יחיד עכבר. RNA באיכות גבוהה מתקבל מ 20 - 30 מ&quot;ג של cryosections ומדידות ונקווה מושווים ישירות בין יישומים.

Cryosectioning של רציף אזורים של שרירי שלד עכבר אחת על ביטוי גנים ועל ניתוח היסטולוגית

With this method, consecutive cryosections are collected to enable both microscopy applications for tissue histology and enrichment of RNA for gene ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפשר ניתוח של פרמטרים היסטולוגיים ומולקולריים ממקטעים סמוכים של רקמה בודדת. בשיטה זו אנו יכולים לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה ומחלות שרירי השלד. כגון, מהן ההשפעות ההתחדשות לאחר פגיעה בשרירים, ומהן ההשפעות של העברת גנים ויראליים בהזרקה תוך שרירית?היתרון בשיטה זו הוא שניתן לתאם נתונים היסטולוגיים ומולקולריים ישירות מרקמה בודדת. זה הופך ניתוח נתונים יעיל יותר ושימוש טוב יותר ברקמות ניסוי. חמש דקות לפני השלמת הנתיחות, יש לקרר את אמבט השימור בהקפאה.כאשר דגימות הרקמה מוכנות להטמעה, יש למרוח תחילה שרף הטמעה על השליש התחתון עד מחצית הרקמה, היכן שהשריר פוגש את הפקק. זה צריך להיעשות בצורה מסודרת כדי להפחית את הפרעות השרף במדרגות במורד הזרם. לאחר מכן, זרוק מיד את הפקק לאמבט 2-מתילבוטן שהתקרר למינוס 140 מעלות צלזיוס.כלול עד שמונה תכשירי רקמות לכל אצווה. באמבטיה, מערבבים את הטישו למשך 30 שניות, מגרדים את תחתית הכוס כדי למנוע מפקקי הרקמה לקפוא לתמיסה. לאחר 30 שניות, בעזרת כלי מתכת, משוך פקק רקמה מה-2-מתילבוטן.לאחר מכן, הסר במהירות את החלקת הכיסוי התומכת. טפחו את עודפי 2-מתילבוטן בחזרה לאמבטיה, ולאחר מכן זרקו את פקק הרקמה לאמבט החנקן החיצוני. לאחר שכל הרקמות הועברו לחנקן הנוזלי, העבירו אותן למיכל ואחסנו בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס.לאחר הכנת הקריוסטט והרכבת דגימת רקמה, השתמש בפקדים הגסים והעדינים כדי לקדם את הדגימה עד ללהב כך שהיא תיגע בלהב. אפס את סכום עובי הקטע לאפס בשלב זה. לאחר מכן, הגדר את הקריוסטט לפונקציית הקיצוץ בעובי חתך של 30 מיקרון.וחותכים וזורקים חלקים עד לעומק הרקמה הרצוי. כדי לאסוף ביעילות חתכים קריוגרפיים למיצוי RNA, פתח תחילה את צינור האיסוף והנח אותו ליד מנשא הלהב. שם, השתמש במברשת נקייה ומקוררת מראש כדי להרים כל חלק ולהעביר אותו לצינור.קטעי שוק עכברים מאוגדים של 30 מיקרון שנלקחו מעומק רקמה של 400 עד 4,000 מיקרון מניבים בדרך כלל 25 עד 50 מיליגרם שריר. אם הטמעת שרף מקיפה את הקריוחת, נעל את בלם היד והשתמש בסכין גילוח כדי לגלח חתיכות קטנות של שרף עד שתהיה רק שכבה דקה סביב החלק העליון של השריר. חתוך תמיד שרף כשהלהב בזווית הרחק מהשריר.שכבה דקה של שרף הטמעה אינה פוגעת באופן מהותי במיצוי ה-RNA במורד הזרם. אם קיים שרף הטבעה עבה יותר, השתמש במברשות כדי להרחיק אותו מהשריר לפני העברת הקריוחתך לתוך צינור האיסוף. במהלך תהליך החיתוך, כאשר רוצים חתכים היסטולוגיים, אפס את עובי הפרוסה לשבעה מיקרון באמצעות פקדי הקריוסטט.לאחר מכן, חתוך והשליך ארבעה עד שבעה חלקים כדי לקבל משטח רקמה עקבי ואחיד ושים לב לעומק הרקמה הזה. כעת, חותכים קטע טוב ומכוונים אותו על פני מנשא הלהב. בעזרת שקופית מיקרוסקופ בטמפרטורת החדר, הרם את החלק והחזיר את השקופית לטמפרטורת החדר.אסוף את כל החלקים הרצויים ולאחר מכן רשום את עומק הרקמה הסופי. לאחר השלמת החיתוך, רשום במהירות את משקל ההקפאות המאוגדות לבידוד RNA. החזר מיד את הצינור לתא הקריוסטט כדי לשמור על טמפרטורת החלקים הקרובה ל-20 מעלות צלזיוס.התחל בהעברה מהירה של הקריוסקטורים המאוגדים לקרח, והוספת כמילילטר אחד של מגיב מיצוי RNA אורגני לכל 50 מיליגרם של קריוסקציה. ככל שמריחים את המגיב מוקדם יותר, כך ה-RNA מתכלה פחות. לאחר מכן, באמצעות מזרק מיליליטר אחד עם מחט בגודל 18, הומוגניזציה של הקריוסקציה מבלי ליצור יותר מדי בועות על ידי ציור חוזר ונשנה של תמיסה ופליטתה על דפנות הצינור.השתמש בקצה המחט כדי לפזר חתיכות גושים. לאחר כל חמש פעימות, החזירו לזמן קצר את הדגימה לקרח כדי לשמור עליה קרירה. לאחר ההומוגניות, השתמש במחט בגודל 22 כדי לשלש בזהירות את הדגימה באמצעות חמש משיכות נוספות.לאחר מכן החזירו את הדגימה לקרח. חזור על תהליך זה שלוש או ארבע פעמים כדי להשיג הומוגניות רקמה מפוזרת דק מאוד. לאחר יצירת ההומוגנאט הסופי, הניחו לו לדגור במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לשבש קומפלקסים מולקולריים.לאחר מכן, במכסה אדים, הוסף 0.1 מיליליטר BCP למיליליטר של מגיב בידוד RNA. לאחר מכן, יש לנער את הצינור במרץ למשך 15 שניות. אל תשתמש במערבולת.לאחר מכן, דגרו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך שתיים-שלוש דקות. לאחר הדגירה הקצרה, צנטריפוגה את הדגימה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 12, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, אסוף בזהירות את השלב העליון השקוף המכיל את ה-RNA.העבירו אותו לצינור נקי, והוסיפו נפח שווה של 70% אתנול, המורכב ממי ים עמוקים. לאחר מערבולת קצרה של הצינור, הניחו לו לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר והמשיכו על ידי ביצוע פרוטוקול הטקסט. תכשירי RNA של שרירי השלד נעשו מהשוקה הקדמית של העכבר.שלושה ימים לפני כן, לחלק מהשרירים הוזרקו 10 קרדיוטוקסין מיקרו-מולרי ולאחרים מי מלח. הטוהר והתפוקה של ה-RNA מדגימות אלה היו מצוינים. תפוקת ה-RNA הייתה גבוהה משמעותית בשרירים הקדמיים של השוקה לאחר פגיעה ברעלן.שלמות הרקמות וייצור ה-RNA יכולים להיות גורם בתצפית זו. התמדה באיכות ה-RNA המוכן הוערכה באמצעות מיקרוליטר אחד של RNA שנשמר בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס במשך 18 חודשים. רצועות RNA ריבוזומליות בולטות של 18S ו-28S עדיין ניכרות בדגימות המדגימות איכות RNA גבוהה.קטעים של שבעה מיקרון נצבעו לביטוי של שרשרת כבדה של מיוזין עוברי, שנראית באדום. לזהות סיבים מתחדשים, מוכתמים לקולגן שש, נראים בירוק, המתאר סיבי שריר ומוכתמים בכחול, כדי להתבונן בגרעינים. כאשר יש הזרקת רעלן לקויה, הפגיעה נראית מינימלית.הזרקת רעלן מוצלחת גורמת לאזור גדול בהרבה של תא השריר הממוקד להיות מושפע. מידת הפגיעה יכולה לשמש כקריטריונים להכללה לניתוח ה-RNA. לאחר השליטה, ניתן להשלים את חיתוך החלקים למיצוי RNA ושקופית היסטולוגית, תוך פחות מחצי שעה עבור רקמה בודדת.לאחר הליך זה, ניתן לעקוב אחר כתמים היסטולוגיים אחרים של אימונופלואורסצנט כדי לענות על מגוון רחב של שאלות. ניתן להשתמש בהקפאות משותפות גם לאיסוף DNA או חלבון.

cryosectioning-contiguous-regions-single-mouse-skeletal-muscle-for

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרופיל ביטוי של RNA מאזורים מובחנים במוח של עכבר דורש אסטרטגיה מדויקת וחזרתית לאיסוף רקמות. כאן מתואר פרוטוקול המשתמש הן בחיתוך קורונלי של המוח והן במיקרודיסקציה בעזרת מחלל רקמות (tissue corer). התנובה והאיכות של ה-RNA הכולל שהתקבל מהדגימות שהופקו מאשרות את יעילותו של המהלך המתואר.

Non-לייזר מיקרוסקופית לכידת גישה עבור Microdissection של אזורים במוח דיסקרטית עכבר עבור בידוד RNA סך סידור Downstream הדור הבא והביטוי פרופיל גנטי

סרטון זה מתאר את הליך הקפאת רקמת השריר והשגת החלקים הדקים שלה. הטכניקה יכולה לסייע בחקר קכקסיה הקשורה לסרטן במודלים של עכברים לסרטן המעי הגס.

הקפאה מהירה של רקמת שריר לצורך חיתוך: פרוטוקול להשגת מקטעים דקים במיוחד של רקמת שריר מורין שהוקפאה במהירות

הצומת העצבי-שרירי (NMJ) משתנה במגוון מצבים שיכולים לפעמים להגיע לשיאם בכשל סינפטי. דוח זה מתאר שיטות מבוססות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לכימות שינויים מבניים כאלה.

Neuromuscular צומת: גודל סינפסה מדידה, שינויי פיצול ובצפיפות חלבון Synaptic שימוש Confocal מיקרוסקופ פלואורסצנטי

כאן אנו מדגימים את השיטות היעילות ביותר להקפאה, הטמעה, הקפאה וצביעה של ביופסיות שריר כדי למנוע הקפאת חפצים.

עשה ואל תעשה בהכנת השריר cryosections לניתוח היסטולוגית

כאן אנו מתארים שיטה פשוטה לבידוד של תאי פני השטח של המעי הגס של עכברים מובחנים מרחבית מתאי בסיס הקריפטה הבסיסיים.

Cryosectioning שיטה לMicrodissection של Murine גס רירית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול הקפאה של סעיף רקמת מוח מחיות מרובים כחלופה ייעול עיבוד המוח יחיד. זה מפחית את השתנות מכתימים במהלך אימונוהיסטוכימיה, מפחית את הזמן cryosectioning והדמיה.

Cryosectioning בו זמנית של המוח מכרסמים מרובים

פרוטוקול לכידת מיקרודיסקציה (LCM) לכידה פותחה כדי להשיג כמות מספקת של RNA באיכות גבוהה עבור ניתוח ביטוי גנים בתאי עצם. המחקר הנוכחי מתמקד על מקטעי עצם הירך העכבר. עם זאת, פרוטוקול LCM דווח כאן ניתן להשתמש כדי ללמוד ביטוי גנים בתאים של כל רקמה קשה.

לכידת לייזר פרוטוקול מיקרודיסקציה התשואות באיכות גבוהה RNA מ-העכבר קפואים טרי-קפוא

פרוטוקול זה מתאר מיקרוניתוח לכידת לייזר עבור הבידוד של סחוס ועצם מחלקים קפואים טריים של העובר העכבר. סחוס ועצם יכול להיות דמיינו במהירות על ידי cresyl סגול כתמים ונאסף בדיוק כדי להניב RNA באיכות גבוהה עבור ניתוח transcript.

לכידת לייזר מיקרו חיתוך של העכבר סחוס ועצם עבור ניתוח ביטוי גנים

אנו מציגים פרוטוקול מהיר, שלב אחר שלב, להסרת מוח עכבר ודיסקציה של אזורים בדידים מרקמת מוח טרייה. השגת אזורי מוח לניתוח מולקולרי הפכה לדבר שבשגרה במעבדות רבות למדעי המוח. אזורי מוח אלה מוקפאים באופן מיידי כדי לקבל נתוני תעתיק באיכות גבוהה לניתוח ברמת המערכת.

מיקרו-דיסקציה של מוח העכבר לאזורים שונים מבחינה תפקודית ואנטומית

עדויות הולכות וגוברות מצביעות על כך שחדירה מוגזמת של שומנים בתוך שרירי השלד גורמת לליפטוקסיות ולסוכרת. כאן אנו מציגים פרוטוקול שלם, כולל עיבוד רקמות, צביעה עם Bodipy, רכישת תמונה וניתוח, כדי לכמת את הגודל, הצפיפות וההתפלגות התת-תאית של טיפות שומנים באופן ספציפי מסוג סיבים.

סוג הסיבים וניתוח ספציפי תת-תאי של תכולת טיפות השומנים בשרירי השלד

מחקר זה מציג פרוטוקול מולטיאום מרחבי Trekker–CUT&amp;Tag, המשלב ברקידוד מרחבי ישיר של חתך רקמה עם ניתוח מולטיאום חד-תאים. גישה זו מאפשרת פרופילינג חד-תאי של ביטוי גנים ושינוי ההיסטון H3K27ac בו-זמנית, ומציעה תובנות מכניות על ויסות גנים בהקשר של מיקרואנטומיה של רקמות.

לאחר פתרון מרחבי, פרופיילינג מולטיאומי חד-תאי משולב של מטרות טרנסקריפטום ואפיגנומיה בחתכי רקמה קפואים.

למד שיטת קריוסקשן לניתוח רציפי אזורים משכבות סמוכות של שרירי שלד עכבר אחת. שיטה זו מאפשרת מתאם בין נתונים היסטולוגיים ומולקולריים לחקר ביולוגיית שריר ומחלות.

Cryosectioning של רציף אזורים של שרירי שלד עכבר אחת על ביטוי גנים ועל ניתוח היסטולוגית

גלה סרטונים נוספים