Cryosectioning של רציף אזורים של שרירי שלד עכבר אחת על ביטוי גנים ועל ניתוח היסטולוגית
12 בדצמבר 2016
קריו-סעיפים רצופים נאספים כדי לאפשר יישומים היסטולוגית והעשרה של RNA למדידות ביטוי גנים באמצעות אזורים סמוכים מתוך שרירי שלד יחיד עכבר. RNA באיכות גבוהה מתקבל מ 20 - 30 מ"ג של cryosections ומדידות ונקווה מושווים ישירות בין יישומים.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לאפשר ניתוח של פרמטרים היסטולוגיים ומולקולריים ממקטעים סמוכים של רקמה בודדת. בשיטה זו אנו יכולים לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה ומחלות שרירי השלד. כגון, מהן ההשפעות ההתחדשות לאחר פגיעה בשרירים, ומהן ההשפעות של העברת גנים ויראליים בהזרקה תוך שרירית?
היתרון בשיטה זו הוא שניתן לתאם נתונים היסטולוגיים ומולקולריים ישירות מרקמה בודדת. זה הופך ניתוח נתונים יעיל יותר ושימוש טוב יותר ברקמות ניסוי. חמש דקות לפני השלמת הנתיחות, יש לקרר את אמבט השימור בהקפאה.
כאשר דגימות הרקמה מוכנות להטמעה, יש למרוח תחילה שרף הטמעה על השליש התחתון עד מחצית הרקמה, היכן שהשריר פוגש את הפקק. זה צריך להיעשות בצורה מסודרת כדי להפחית את הפרעות השרף במדרגות במורד הזרם. לאחר מכן, זרוק מיד את הפקק לאמבט 2-מתילבוטן שהתקרר למינוס 140 מעלות צלזיוס.
כלול עד שמונה תכשירי רקמות לכל אצווה. באמבטיה, מערבבים את הטישו למשך 30 שניות, מגרדים את תחתית הכוס כדי למנוע מפקקי הרקמה לקפוא לתמיסה. לאחר 30 שניות, בעזרת כלי מתכת, משוך פקק רקמה מה-2-מתילבוטן.
לאחר מכן, הסר במהירות את החלקת הכיסוי התומכת. טפחו את עודפי 2-מתילבוטן בחזרה לאמבטיה, ולאחר מכן זרקו את פקק הרקמה לאמבט החנקן החיצוני. לאחר שכל הרקמות הועברו לחנקן הנוזלי, העבירו אותן למיכל ואחסנו בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס.
לאחר הכנת הקריוסטט והרכבת דגימת רקמה, השתמש בפקדים הגסים והעדינים כדי לקדם את הדגימה עד ללהב כך שהיא תיגע בלהב. אפס את סכום עובי הקטע לאפס בשלב זה. לאחר מכן, הגדר את הקריוסטט לפונקציית הקיצוץ בעובי חתך של 30 מיקרון.
וחותכים וזורקים חלקים עד לעומק הרקמה הרצוי. כדי לאסוף ביעילות חתכים קריוגרפיים למיצוי RNA, פתח תחילה את צינור האיסוף והנח אותו ליד מנשא הלהב. שם, השתמש במברשת נקייה ומקוררת מראש כדי להרים כל חלק ולהעביר אותו לצינור.
קטעי שוק עכברים מאוגדים של 30 מיקרון שנלקחו מעומק רקמה של 400 עד 4,000 מיקרון מניבים בדרך כלל 25 עד 50 מיליגרם שריר. אם הטמעת שרף מקיפה את הקריוחת, נעל את בלם היד והשתמש בסכין גילוח כדי לגלח חתיכות קטנות של שרף עד שתהיה רק שכבה דקה סביב החלק העליון של השריר. חתוך תמיד שרף כשהלהב בזווית הרחק מהשריר.
שכבה דקה של שרף הטמעה אינה פוגעת באופן מהותי במיצוי ה-RNA במורד הזרם. אם קיים שרף הטבעה עבה יותר, השתמש במברשות כדי להרחיק אותו מהשריר לפני העברת הקריוחתך לתוך צינור האיסוף. במהלך תהליך החיתוך, כאשר רוצים חתכים היסטולוגיים, אפס את עובי הפרוסה לשבעה מיקרון באמצעות פקדי הקריוסטט.
לאחר מכן, חתוך והשליך ארבעה עד שבעה חלקים כדי לקבל משטח רקמה עקבי ואחיד ושים לב לעומק הרקמה הזה. כעת, חותכים קטע טוב ומכוונים אותו על פני מנשא הלהב. בעזרת שקופית מיקרוסקופ בטמפרטורת החדר, הרם את החלק והחזיר את השקופית לטמפרטורת החדר.
אסוף את כל החלקים הרצויים ולאחר מכן רשום את עומק הרקמה הסופי. לאחר השלמת החיתוך, רשום במהירות את משקל ההקפאות המאוגדות לבידוד RNA. החזר מיד את הצינור לתא הקריוסטט כדי לשמור על טמפרטורת החלקים הקרובה ל-20 מעלות צלזיוס.
התחל בהעברה מהירה של הקריוסקטורים המאוגדים לקרח, והוספת כמילילטר אחד של מגיב מיצוי RNA אורגני לכל 50 מיליגרם של קריוסקציה. ככל שמריחים את המגיב מוקדם יותר, כך ה-RNA מתכלה פחות. לאחר מכן, באמצעות מזרק מיליליטר אחד עם מחט בגודל 18, הומוגניזציה של הקריוסקציה מבלי ליצור יותר מדי בועות על ידי ציור חוזר ונשנה של תמיסה ופליטתה על דפנות הצינור.
השתמש בקצה המחט כדי לפזר חתיכות גושים. לאחר כל חמש פעימות, החזירו לזמן קצר את הדגימה לקרח כדי לשמור עליה קרירה. לאחר ההומוגניות, השתמש במחט בגודל 22 כדי לשלש בזהירות את הדגימה באמצעות חמש משיכות נוספות.
לאחר מכן החזירו את הדגימה לקרח. חזור על תהליך זה שלוש או ארבע פעמים כדי להשיג הומוגניות רקמה מפוזרת דק מאוד. לאחר יצירת ההומוגנאט הסופי, הניחו לו לדגור במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי לשבש קומפלקסים מולקולריים.
לאחר מכן, במכסה אדים, הוסף 0.1 מיליליטר BCP למיליליטר של מגיב בידוד RNA. לאחר מכן, יש לנער את הצינור במרץ למשך 15 שניות. אל תשתמש במערבולת.
לאחר מכן, דגרו את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך שתיים-שלוש דקות. לאחר הדגירה הקצרה, צנטריפוגה את הדגימה למשך 15 דקות בטמפרטורה של 12, 000 גרם וארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, אסוף בזהירות את השלב העליון השקוף המכיל את ה-RNA.
העבירו אותו לצינור נקי, והוסיפו נפח שווה של 70% אתנול, המורכב ממי ים עמוקים. לאחר מערבולת קצרה של הצינור, הניחו לו לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר והמשיכו על ידי ביצוע פרוטוקול הטקסט. תכשירי RNA של שרירי השלד נעשו מהשוקה הקדמית של העכבר.
שלושה ימים לפני כן, לחלק מהשרירים הוזרקו 10 קרדיוטוקסין מיקרו-מולרי ולאחרים מי מלח. הטוהר והתפוקה של ה-RNA מדגימות אלה היו מצוינים. תפוקת ה-RNA הייתה גבוהה משמעותית בשרירים הקדמיים של השוקה לאחר פגיעה ברעלן.
שלמות הרקמות וייצור ה-RNA יכולים להיות גורם בתצפית זו. התמדה באיכות ה-RNA המוכן הוערכה באמצעות מיקרוליטר אחד של RNA שנשמר בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס במשך 18 חודשים. רצועות RNA ריבוזומליות בולטות של 18S ו-28S עדיין ניכרות בדגימות המדגימות איכות RNA גבוהה.
קטעים של שבעה מיקרון נצבעו לביטוי של שרשרת כבדה של מיוזין עוברי, שנראית באדום. לזהות סיבים מתחדשים, מוכתמים לקולגן שש, נראים בירוק, המתאר סיבי שריר ומוכתמים בכחול, כדי להתבונן בגרעינים. כאשר יש הזרקת רעלן לקויה, הפגיעה נראית מינימלית.
הזרקת רעלן מוצלחת גורמת לאזור גדול בהרבה של תא השריר הממוקד להיות מושפע. מידת הפגיעה יכולה לשמש כקריטריונים להכללה לניתוח ה-RNA. לאחר השליטה, ניתן להשלים את חיתוך החלקים למיצוי RNA ושקופית היסטולוגית, תוך פחות מחצי שעה עבור רקמה בודדת.
לאחר הליך זה, ניתן לעקוב אחר כתמים היסטולוגיים אחרים של אימונופלואורסצנט כדי לענות על מגוון רחב של שאלות. ניתן להשתמש בהקפאות משותפות גם לאיסוף DNA או חלבון.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
נוהל זה מאפשר ניתוח של פרמטרים היסטולוגיים ומולקולריים מחתכים סמוכים של רקמה אחת, ובאופן ספציפי משריר שלב של עכבר. הוא מקל על ביצוע קורלציה בין נתונים היסטולוגיים למולקולריים, ובכך משפר את ניתוח הנתונים ואת ניצול הרקמות הניסיוניות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה
- מחקר שריר שלד
רקע
- חתכים קריו-סדרתיים נאספים ליישומים היסטולוגיים.
- העשרה של RNA למדידות ביטוי גנים מבוצעת באמצעות אזורים סמוכים.
- RNA באיכות גבוהה מופק מנתחים קפואים (cryosections) מאוחדים.
- שיטה זו מאפשרת השוואה ישירה בין יישומים שונים.
מטרת המחקר
- ניתוח השפעות רגנרטיביות לאחר פגיעה שרירית.
- בדיקת ההשפעות של העברת גנים נגיפית באמצעות הזרקה תוך-שרירית.
- ביצוע קורלציה בין נתונים היסטולוגיים לנתונים מולקולריים מרקמה אחת.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימור בהקפאה (Cryopreservation) של דגימות רקמה.
- איסוף של נתחי קריו (cryo-sections) רצופים.
- מיצוי RNA מנתחי קריו מאוחדים.
- ניתוח היסטולוגי של נתחי רקמה סמוכים.
תוצאות עיקריות
- ניתן להפיק RNA באיכות גבוהה מ- 20 - 30 mg של נתחים קפואים (cryosections) מאוגדים.
- ניתן לבצע מתאם יעיל בין נתונים היסטולוגיים לנתונים מולקולריים.
- השיטה משפרת את הניתוח של רקמות ניסיוניות.
- ניתן למענה על שאלות מפתח בביולוגיה של השריר השלדי.
מסקנות
- שיטה זו מספקת גישה חסונה לחקר ביולוגיה של השריר.
- היא מאפשרת ניתוח נתונים יעיל ממקור רקמה בודד.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בשיטה זו כדי להשיג תובנות עמוקות יותר לגבי התחדשות שרירים והחדרת גנים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת מתאם ישיר בין נתונים היסטולוגיים למולקולריים מחתכים סמוכים של שריר שלד, ובכך מפחיתה את אי-הוודאות הניסויית ואת מספר בעלי החיים המשמשים בתהליכי גילוי. באמצעות שיפור תנובת ה-RNA מדגימות רקמה קטנות על ידי איסוף (pooling) של חתכי קריו והומוגניזציה באמצעות מחט, השיטה תומכת בתיקוף מטרות (target validation) ובהפחתת סיכונים מכניסטיים במודלים של מחלות שלד ושריר בשלבים מוקדמים. הגישה מגבירה את הביטחון בחיזוי על ידי קישור תצפיות פנוטיפיות לשינויים בביטוי גנים מאותה מערכת ביולוגית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי ביצוע קורלציה בין סממני פגיעה היסטופתולוגיים לבין שינויים בביטוי גנים באותה רקמה.
- ערך תפעולי: מפחית את הצורך בניסויי חיות חוזרים על ידי השגת נתונים היסטולוגיים ומולקולריים תואמים משריר שלד בודד.
- ערך חיזוי: תומך בהפחתת סיכונים של מטרות טיפוליות באמצעות תוצאים פנוטיפיים ומולקולריים תואמים, המשפרים את רמת הביטחון בפירוש מנגנון המחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- ערך מדעי: מספק הכנה סטנדרטית של רקמות לצורך מיצוי RNA בהמשך, מה שמאפשר פרופיל ביטוי גנים עקבי בין תנאים ניסיוניים שונים.
- ערך תפעולי: מקל על המוכנות לבדיקה על ידי יצירת ליזטים הומוגנאיים מחתכים קפואים (cryosections) מאוגדים המתאימים לתהליכי qPCR או ריצוף.
- יכולת הרחבה (Scalability): מאפשר עיבוד של רקמות מרובות בכל סבב באמצעות קריוסטט, ובכך תומך ביישומים של גילוי בקיבולת בינונית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רציפות תרגומית: מאפשרת מעבר חלק מהיסטולוגיה של גילוי לוולידציה מולקולרית באמצעות אזורי רקמה סמוכים, ובכך מחזקת את המתאם של הביומארקרים.
- רלוונטיות למודלים פרה-קליניים: תומכת בהערכת תגובות רגנרטיביות והשפעות של טיפול גנטי במודלים של פגיעה, באמצעות ניתוח מבני ומולקולרי תואם.
- קידום מותאם סיכונים: משפרת החלטות של go/no-go על ידי הפחתת השונות בין נקודות סיום היסטולוגיות ומולקולריות המופקות מאותה דגימה.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline & Workflow)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי על ידי מתן אפשרות לניתוח מונחה-היפותזה של ביולוגיה של שריר שלד, שבו סריקה היסטולוגית מנחה המשך בירור מולקולרי מאותו מקור רקמה.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהבהרת מסלולים ובתיקוף מטרות על ידי קישור פנוטיפים מבניים (למשל, פיברוזיס, רגנרציה) עם תגובות שעתוק בחתכים סמוכים.
- סריקה: מייצרת מאגרי חתכי קריו סטנדרטיים המשמשים כקלטים ניתנים לשחזור לצורך מיצוי RNA ובדיקות אנליטיות המשך.
- אנליטיקה: מייצרת מדדי כמות ואיכות של תבואת RNA המאפשרים השוואה בין קבוצות טיפול ותנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין דירוג פגיעות היסטופתולוגי לבין חתימות מולקולריות של רגנרציה או העברת גנים, ובכך תומכת ברציפות פרה-קלינית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה להכנת רקמות הניתנת לשימוש חוזר וניתנת ליישום על פני שרירי שלד ומודלי מחלה מרובים, ובכך מפחיתה את הצורך בפיתוח פרוטוקולים כפולים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי על ידי הפחתת רעש ביולוגי באמצעות התאמה של נתונים היסטולוגיים ומולקולריים מאזורים זהים ברקמה.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה באמצעות איסוף נתחים קפואים (cryosection pooling) והומוגניזציה מבוקרת באמצעות מחט, תוך מזעור השונות הטכנית.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מקסום תפוקת הנתונים מכל בעל חיים, מה שמפחית את הצורך במחקרי שכפול במסעות של תיקוף מטרות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות מותאם לסיכון באמצעות ראיות פנוטיפיות ומולקולריות תואמות, ובכך מפחית את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים עקב חוסר התאמה מכניסטית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בתפעול קריוסטט ובטמיעת רקמות כדי להבטיח את איכות החתכים ולמנוע הפרעה של השרף (resin) ממיצוי RNA בשלבים הבאים.
- תלוי בגישה לקריוסטט ותשתית חנקן נוזלי לצורך שימור רקמות וחיתוכן בטמפרטורות מבוקרות.
- מחייב סטנדרטיזציה של עובי החתכים (30 µm עבור RNA, 7 µm להיסטולוגיה) ושל פרוטוקולי האיסוף בין המשתמשים השונים כדי להבטיח הדירות.
- התאמה לסוגי רקמות אחרים עשויה לדרוש אופטימיזציה של פרמטרי החיתוך ושל טכניקות ההומוגניזציה בהתבסס על צפיפות הרקמה ומבנהה.
- מגבלות מעשיות כוללות תפוקה נמוכה יחסית וצורך בטיפול זהיר כדי למנוע דגרדציה של RNA במהלך איסוף החתכים ועיבודם.
