מערכי ננו-אשכול ליגנד בתוך bilayer שומנים נתמך

המטרה הכוללת של טכניקה זו היא לייצר מערך של ננו-אשכולות חלבונים בשכבת שומנים דו-שכבתית נתמכת, התואמת לטכניקות מיקרוסקופ משטח רגישות ליישומי ביולוגיה של התא. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביופיזיקה של התא, בפרט, כיצד ננו-אשכולות של ליגנדים משפיעים על הפעלה והדבקה של תאי T. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא ניתנת לשחזור בקלות במעבדה ביופיזיקלית סטנדרטית והיא תואמת לטכניקת מיקרוסקופיה רגישה למשטח מתקדמת, כגון TIRF ו-RICM.

למרות שטכניקה זו נועדה לספק תובנה לאימונולוגיה, ניתן ליישם אותה על סוגי תאים אחרים עם יישומים פוטנציאליים בביולוגיה של התא, אונקולוגיה והנדסת רקמות. כדי להתחיל בהליך זה, נקה את שקופיות כיסוי הזכוכית ותאי התצפית כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, הפקידו 70 מיקרוליטר של מתלה חרוזי סיליקה 2% טיפה אחר טיפה על מגלשת כיסוי המוחזקת בשיפוע של 15 מעלות.

הפוך את הכוס 90 מעלות כל 15 שניות למשך דקה אחת בזמן שהמתלים מתייבשים. זה קריטי ליצור חד-שכבת חרוזים ארוזה היטב ולהימנע מהיווצרות רב-שכבתי ואשכולות שמן. לכן יש לייעל את הריכוז והנפח של תמיסת החרוז כמו גם את ההידרופיליות של המגלשה.

לאחר שהנוזל התאדה, הנח את המגלשה בתוך מכשיר מקרטע מגנטרון בתדר רדיו על שולחן מסתובב הממוקם במרחק של 105 מילימטרים ממטרת סיליקון מאלומיניום. לאחר מכן, השתמש במשאבה טורבו-מולקולרית כדי להפחית את הלחץ בתא התצהיר ל-2.6 פעמים 10 לפסקל הרביעי השלילי. הכניסו אווירת ארגון טהורה עם שטף של 10 סנטימטרים מעוקבים סטנדרטיים לדקה ולחץ של 0.8 פסקל.

לאחר מכן, הפעל את מחולל החשמל בתדר רדיו. לאחר ייצוב הפלזמה, יש להתיז למשך שתי דקות תוך שמירה על התריס סגור, כדי להסיר זיהומים אפשריים ממשטח המטרה. פתח את התריס ואפשר להתזה להימשך במשך 60 דקות כדי להניח שכבת אלומיניום בעובי 200 ננומטר על המגלשה.

ואז חתוך את זרימת הארגון. סגור את שסתום השער כדי לבודד את המשאבה הטורבו-מולקולרית מתא התצהיר. לאחר מכן, אוורור את החדר בחנקן נקי כדי להגיע ללחץ הסביבה.

שחזר את השקופית המצופה אלומיניום מהתא. טבלו את השקופית המשוחזרת במים טהורים במיוחד בטמפרטורת החדר ואולטרה-סוניקט ב-50 וואט ו-50 הרץ למשך 30 שניות. לאחר מכן, הפקידו 0.5 מיליליטר של APTES בתחתית מייבש כביסה.

הנח את מגלשת הזכוכית על רשת קרמיקה. הנח את הרשת לתוך חומר הייבוש. חבר את חומר הייבוש למשאבת ממברנה.

לאחר מכן הפעל את המשאבה בעוצמה מקסימלית למשך 30 דקות כדי ליצור ואקום נמוך. סגור את שסתום המייבש וכבה את המשאבה. מחממים ל 50 מעלות צלזיוס למשך שעה.

לאחר מכן פתח את מייבש הכביסה ואסוף את השקופית. הנח את השקופית שנאספה על תומך PTFE. הפקידו 2 מיליליטר של 25 מיקרוגרם למיליליטר ביוטין מומס ב- PBS.

הניחו לשקופית לנוח 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן יש לשטוף 10 פעמים עם PBS. דגרו את השקופית בתמיסה של נתרן הידרוקסיד ו-PBS בטמפרטורת החדר למשך הלילה.

לאחר מכן, שטפו את השקופית 10 פעמים במים טהורים במיוחד. לאחר ניקוי שוקת Langmuir, הנח מגשי PTFE במארז ה-PTFE של השוקת. לאחר מכן מלאו אותו במים טהורים במיוחד.

הגדר את הלחץ הנמדד לאפס מילי-ניוטון למטר. בעזרת מזרק מתכת מזכוכית אטום לגז, הניחו 30 מיקרוליטר של 1 מיליגרם למילימטר DOPC ותמיסת כלורופורם על פני המים. סגור את מחסום ה-PTFE עד שיגיע ללחץ הרצוי של 27 מילי-ניוטון למטר כדי לדחוס את שכבת השומנים החד-שכבתית.

לאחר מכן, בעזרת מהדק ממונע, טבלו את מגלשת הזכוכית המוכנה לתוך מארז ה-PTFE. החזק את המגלשה ב-clamp בניצב לממשק האוויר-מים. הרם את המגלשה דרך הממשק בקצב של 15 מילימטר לדקה תוך שמירה על לחץ קבוע של 27 מילי-ניוטון למטר.

לאחר מכן, הנח את מגלשת הזכוכית אופקית על פני המים מעל מגש PTFE. לאחר מכן, בעזרת פינצטה ממתכת, דחף את השקופית כלפי מטה לתוך מגש ה-PTFE, וטבל אותה במים הטהורים במיוחד. השתמש בפינצטה כדי להעביר את מגש ה-PTFE המכיל את השקופית לתוך מגבש מלא במים טהורים במיוחד.

העבירו את המגלשה המצופה מתחת למים לתא תצפית. לאחר מכן, סגור את החדר, וודא כי כמיליליטר מים כלואים בפנים. שלב עדין נוסף הוא הרכבת תא הדגימה מתחת למים.

ויש להימנע לחלוטין ממגע עם האוויר של השכבות הדו-שכבתיות המופקדות, כך שכדי להבטיח זאת השתמש בנפח גדול של מים ולהבטיח שכל תהליך ההרכבה יכול להתרחש מתחת למים. הסר את החדר המורכב מהמים, בדוק כדי לוודא שהתא אטום למים וללא נזילות. הוסף 500 מיקרוליטר PBS, ואז הסר 500 מיקרוליטר נוזלים מהתא.

חזור על תהליך זה 10 פעמים כדי להחליף באופן מלא את המיליליטר האחד של מים טהורים במיוחד בתא ב-PBS. לאחר מכן, הכניסו 100 מיקרוגרם למיליליטר של חלבון סרום בקר לתא התצפית. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.

לאחר מכן, יש לשטוף את השכבה הדו-שכבתית על ידי הסרה והוספה של 500 מיקרוליטר מהתא, 10 פעמים. לאחר מכן, תתפקדו עם ליגנדים, תאי הפקדה והתבוננו בננו-דפוס הפרוטאוליפידי ובנזילות SLB כמתואר בפרוטוקול הטקסט. בפרוטוקול זה, מסכת חרוזים משמשת ליצירת מסכת מתכת משנית על ידי תצהיר מבוקר של אלומיניום.

לאחר מכן, מסכת החרוזים מוסרת ומשאירה שכבת אלומיניום עם חורים. לאחר מכן, סילין אורגנו-אמינו, הנקרא APTES, מופקד בשלב האדים, ואחריו שקיעה של BSA-ביוטין בשלב מימי. לאחר מכן, אלומיניום מוסר, וחושף כתמי חלבון ננומטריים.

לבסוף, החלל בין הנקודות מתמלא מחדש בשכבת שומנים נתמכת. לאחר מכן נלקחות תמונות אפיפלואורסצנטיות של הננו-נקודות ונתמכות בשכבת השומנים הדו-שכבתית. תמונה מורכבת מציגה השלמה מושלמת עם שכבת השומנים המופקדת באופן ייחודי סביב נקודות החלבון, אך לא עליהן.

בתמונת אפיפלואורסצנציה של שכבת שומנים נתמכת טרייה, נקודות החלבון מופיעות ככתמים כהים בים בהיר של שומנים. עם זאת, לאחר הלבנת תמונה רציפה במשך 50 שניות, התמונה מציגה הילה בתוך האזור התחום על ידי דיאפרגמת השדה, מה שמצביע על כך שהליפידים ניידים. ניתוח פרופיל העוצמה הממוצעת לאורך קצה דיאפרגמת השדה, ודעיכת עוצמה זו לאורך זמן בתהליך ההלבנה, מגלה כי קבוע הדיפוזיה הוא חמישה מיקרומטר רבוע לשנייה.

ניתן לבצע טכניקה זו תוך יומיים אם היא מבוצעת כראוי. חשוב לשמור על תנאים נקיים מאוד במהלך שקיעת אלומיניום, ולכייל בזהירות את עקומת התצהיר. בעקבות הליך זה, ניתן לתפקד עוד יותר את השקופית המעוצבת.

לדוגמה, על ידי הוספת ביומולקולה נוספת בשכבה הדו-שכבתית. אנו משתמשים בזה כדי לחקות את התאים אוכלי הצמחים של האנטיגן, במטרה לחקור את הפעלת תאי ה-T. אז לאחר פיתוחה, טכניקה זו אמורה לעניין קהלים מגוונים.

לדוגמה, מהנדסי רקמות עשויים לרצות להשתמש בו כפיגום לגידול רקמות מלאכותיות, ואונקולוגים עשויים להשתמש בזה כפלטפורמה להצגת שאלות בסיסיות לגבי הוספת תאים סרטניים. לאחר צפייה בסרטון זה אמורה להיות לך הבנה טובה כיצד לייצר אזור של ננו-אשכולות חלבון בשכבת שומנים דו-שכבתית נתמכת, התואמת לטכניקת מיקרוסקופיה מתקדמת. בעוד שאנו משתמשים בזה כדי לחקור תאי T, אנו מאמינים שלמצע זה יש פוטנציאל להפוך לפלטפורמה הנבחרת לחקר האינטראקציה של כל סוג של תאים עם ממברנה פרוטאוליפידית מבוקרת.