לתוספי משפר את היעילות התמרה חושית Lentiviral של תאי NK העיקרי מאתר ואנושי

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לפתח טכנולוגיות המאפשרות טרנסדוקציית גנים מוצלחת בתאי NK (תאיe killer טבעיים) ראשוניים. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום האימונותרפיה, כגון השפעתה של מודיפיקציה גנטית על לימפוציטים אפקטורים, כמו תאי NK. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא ביטוי יעיל של גן רצוי בתאי NK ראשוניים של עכבר או אדם.

לאחר הכנת טיטרציה של וקטורים לנטיביריים בהתאם לפרוטוקול הכתוב, יש לטהר תאי NK ראשוניים של עכברים על ידי העברת תרחיפי טחול של תאים בודדים דרך עמודי צמר ניילון כדי להסיר את האוכלוסיות הנצמדות המורכבות מתאי B ומקרופאגים. השתמש ב-1,000 units per milliliter של Interleukin-2 במצע RPMI1640 מלא כדי לגדל את האוכלוסייה שאינה נצמדת המכילה תאי NK. ביום הרביעי לתרבית, החלף את המצע באמצעות 20 milliliters של מצע RPMI1640 מלא ו-1,000 units per milliliter של IL-2 כדי להסיר את תאי T ותאי NKT שאינם נצמדים.

ביום השביעי, השתמשו בסממנים ספציפיים לתאי MK כדי לבדוק את טוהר תאי ה-NK העכבריים באמצעות ציטומטריה עם זרימה, תוך שימוש בדגימות עם אוכלוסייה של יותר מ-95% CD3 שלילי ו-NK1.1 חיובי. כדי לבודד תאים חד-גרעיניים של דם היקפי, או PBMCs, שכבו בזהירות 35 milliliters של תאים מהולים למחצית מעל 15 milliliter של מדרג צפיפות בתוך מבחנה קונית של 50 milliliters. סובבו את המדרג בצנטריפוגה עם רוטור של דליים מתנדנדים (swinging-bucket rotor) ב-400 times G וב-20 degrees Celsius למשך 30 דקות ללא הפסקה.

לאחר טיהור תאי NK ראשוניים של בני אדם בהתאם לפרוטוקול הכתוב, קבע את רמת טוהר התאים על ידי הוספת 2 µg/mL של נוגדנים anti-CD3, ו-2 µg/mL של נוגדנים anti-CD56. דגרו את התאים בטמפרטורה של 4 °C למשך 20 דקות. השתמשו ב-PBS כדי לשטוף את התאים פעמיים.

לאחר מכן, נתחו את התאים באמצעות ציטומטריה של זרימה. אוכלוסיית תאי ה-NK תהיה חיובית ל-CD56 על פני השטח של התא, ושלילית ל-CD3. השעו תאי NK ראשוניים של עכבר או בן אדם בבארות של פלטת 24 בארות בריכוז של 0.5×10⁵ למילליטר של מצע עם עליון (supernatant) של GFP Lentivirus, ב-NLY של 5, 10 ו-20.

לאחר מכן, בנוכחות polybrene, protamine sulfate או dextran, סבבו את הפלטות בצנטריפוגה ב-1,000 ×g למשך 60 דקות. לאחר מכן, ללא שפיכת הנוזל העליון, דגרו את התאים באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5.2% carbon dioxide למשך הלילה.

לאחר שטיפת התאים עם 10 milliliters של PBS, השתמשו בשני milliliters של מצע RPMI1640 עם IL-2 כדי להחזיר את התאים לתליה. ביום שלפני קצירת התאים, צפו פלטות פוליסטירן ב-96 בארות בעלות ספיגת חלבון גבוהה עם 2.5 micrograms per milliliter של נוגדנים מונוקלונליים נגד MKG2D, והדגירו את הפלטות בטמפרטורת החדר או במקרר למשך הלילה.

ביום למחרת, השתמשו ב-100 microliters של PBS כדי לשטוף כל באר שלוש פעמים. אספו את תאי ה-NK שעברו טרנסדוקציה על ידי תיפוף עדין של הפלטות, ולאחר מכן העבירו 100 microliters של תאים לכל באר בלוחות ה-96-well.

לאחר מכן, באמצעות הציטוקין הרקומביננטי מהערכת ELISA, צור עקומת סטנדרט וכמת את הציטוקינים, כגון Interferon Gamma, בתעליל. כדי לבחון את חיוניות תאי ה-NK, ארבעה ימים לאחר הטרנסדוקציה, שטוף את התאים פעמיים עם 10 milliliters של PBS קר. לאחר מכן, קצור את התאים והשתמש ב-XM5 7-aminoactinomycin D כדי לצבוע אותם.

השתמשו בציטומטריה של זרימה כדי לקבוע את אחוז התאים הנקרוטיים בקרב תאי ה-NK שעברו טרנספורמציה, ונתחו את הנתונים בהתאם לפרוטוקול הכתוב. איור זה מראה שתאי NK אנושיים שדוהרו עם IL-2 רקומביננטי ולאחר מכן עברו טרנסדוקציה עם Lentivirus GFP השיגו יעילות טרנסדוקציה גבוהה יותר והגבירו את הטרטר הווירוסלי כאשר נוסף דקסטראן לתרבית, בהשוואה להוספה של פוליברן או פרוטמין סולפייט. כפי שנראה כאן, תוצאות דומות הודגמו בתאי NK עכבריים, כאשר דקסטראן הגביר את היעילות של וקטורי Lentiviral, בהשוואה לפוליברן או פרוטמין סולפייט.

בניסוי זה, נבחנה היכולת הציטוטוקסית של תאי NK ראשוניים שעברו טרנסדוקציה באמצעות בדיקת שחרור CR כנגד תאי K562 ו-YAC-1 כתאי מטרה. הטרנסדוקציה של תאי NK באמצעות דקסטראן אינה פוגעת בפוטנציאל ההריגה של תאי NK שעברו טרנספורמציה בהשוואה לתאי NK שלא עברו טרנסדוקציה. כאן, תאי NK ראשוניים אנושיים שעברו טרנסדוקציה גודלו בתרבית משותפת עם K562 למשך 24 שעות, והעלונים נאספו כדי למדוד את רמות ה-Interferon Gamma.

התוצאות מעידות כי לדקסטראן אין השפעה על יכולתן של תאי NK שעברו טרנסדוקציה לייצר ציטוקינים. בנוסף, תיקוף עצמאי הראה שתאי NK שטופלו בדקסטראן והופעלו באמצעות נוגדנים מונוקלונליים anti-NKG2DA10 קשורי-לוח עדיין היו מסוגלים לייצר את הציטוקין Interferon Gamma. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לצנטריפוג את התאים שעברו טרנסדוקציה.

בעקבות פרוצדורה זו, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון טרנספקציה, כדי לענות על שאלות נוספות, כמו דרכים לשיפור העברת גנים. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום האימונולוגיה לחקירת מניפולציה גנטית בתאי NK. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו מבצעים טרנסדוקציה של תאי NK.