מודל דלקת ריאות חזק במכרסמי immunocompetent להערכת יעילות אנטיבקטריאלי נגד S. pneumoniae, H. אינפלואנזה, K. pneumoniae, P. aeruginosa או A. baumannii

המטרה הכוללת של הליך זיהום תוך סימפונות לא ניתוחי זה היא לבסס דלקת ריאות חיידקית חזקה במכרסמים בעלי יכולת חיסונית. שיטה זו מוסיפה ערך לגילוי ופיתוח של אנטיבקטריאליים בכך שהיא מאפשרת להעריך את יעילותם של טיפולים פוטנציאליים במודל בעל יכולת חיסונית של דלקת ריאות חמורה. היתרון העיקרי של טכניקה זו, הוא שהיא מבססת זיהום ריאות חזק וניתן לשחזור עם מבודדים רבים, כולל אלה שבדרך כלל דורשים מבעלי החיים להיות נויטרופניים או מבודדים שאינם מייצרים זיהום בר-קיימא בשיטות אחרות.

בדרך כלל, אנשים חדשים בהליך זה יתקשו. אינטובציה נכונה היא הליך עיוור הדורש לימוד התחושה הנכונה לאינטובציה של קנה הנשימה במקום הוושט. אינטובציה נכונה שונה עבור כל מדען.

ייתכן שהזווית המדויקת של הצינורית לא תהיה זהה עבור כולם. תחושת רכסי קנה הנשימה היא המפתח. תדגים את הטכניקה הזו סינדי מינינגר, מדענית מהמעבדה שלנו.

כדי להתחיל, הכינו תרחיפי חיידקים מלוחים מתרביות מרק לילה, כפי שמצוין בפרוטוקול הטקסט, או מצלחות אגר, כפי שמודגם כאן. קצרו גידול בן לילה מצלחות אגר באמצעות לולאה סטרילית כדי לגרד מושבות מפני השטח. העבירו את החומר שנקטף לחמישה מיליליטר של מי מלח סטריליים עד לקבלת תרחיף מעונן ואטום, ומערבלו בעדינות את התרבית עד לקבלת תערובת אחידה.

לאחר מכן יש לדלל באופן סדרתי ולצלוח אליקוט מכל דילול בהתאם לפרוטוקול הטקסט. לאחר הכנת האגר והרכבת הכלים הדרושים לתהליך ההדבקה, על פי פרוטוקול הטקסט, מכניסים תשעה מיליליטר אגר לצינור סטרילי ואז מכניסים את הצינור לאמבט המים עד שהאגר מתייצב לכ-42 מעלות צלזיוס. הוסף מיליליטר אחד של תרחיף חיידקי המלח שהוכן בעבר לצינור האגר.

לאחר מכן, הפוך את הצינור מספר פעמים כדי לערבב ולהחזיר אותו למים. הניחו מחצלת נקייה וחד פעמית על משטח העבודה קרוב לאמבט המים. כדי להכין את משטח העבודה ומכשיר האינטובציה, יש לעקר תחילה את צינורית המתכת וצינורות הפוליאתילן בהתאם לפרוטוקול הטקסט ולאחר מכן להעביר אותו בצינור אחסון הזכוכית שלו למשטח העבודה.

לאחר מכן, הסר את המכסה מצינור האחסון והחלק את קצה הידית של הצינורית לקצה הפתוח של הצינור. בעזרת מלקחיים סטריליים, הסר אורך אחד של צינור פוליאתילן מהכוס והכנס אותו דרך החלק הפנימי של צינורית המתכת הסטרילית, וודא שהיא נעה בחופשיות. הניחו סימן מנחה במיקום קבוע מראש בעזרת עט בלתי ניתן למחיקה.

לאחר מכן, התקן מחט חד פעמית סטרילית בגודל 25 על הקצה החופשי של צינור הפוליאתילן על ידי החלקת המחט מספר מילימטרים לתוך הצינור. לאחר מכן, השתמש במי מלח סטריליים כדי למלא מזרק חד פעמי טרי של מיליליטר. חבר את המזרק למחט המותקנת על צינור הפוליאתילן ושטוף את כל נפח המלח דרך הצינור.

השליכו את המזרק המשומש למיכל החדים. לאחר מכן, מלאו מזרק חד פעמי סטרילי חדש של מיליליטר אחד בחיסון על בסיס אגר מאמבט המים. חבר מחדש את המחט והצינור בגודל 25 ושטוף אגר דרך הצינור על ידי לחיצה על הבוכנה רק עד שהצינור מתמלא לחלוטין באגר.

לאחר הרדמת החולדה על פי פרוטוקול הטקסט, הניחו את החיה במצב שכיבה על המחצלת החד פעמית כשהראש פונה ימינה והזנב פונה שמאלה. לאחר מכן, הכנס את הקצה החופשי של צינורית המתכת לפה של החיה. סובב את הצינורית כך שהקצה החופשי יהיה בזווית כלפי מעלה וקדם אותה בעדינות לקנה הנשימה, תוך עקיפת מבני הגרון בתנועת פיתול קלה.

אשר את ההחדרה לקנה הנשימה, בניגוד לוושט, על ידי החלקה עדינה של הצינורית מעט קדימה ואחורה מספר פעמים תוך שימוש באצבע המורה השמאלית כדי למשש את טבעות קנה הנשימה. כדי להבטיח אינטובציה לקנה הנשימה, ולא לוושט, הזיזו מעט את הצינורית קדימה ואחורה והרגישו את הרכסים. אם הצינורית מחליקה בצורה חלקה במורד הגרון ולא ניתן להרגיש את הרכסים, הסר את המכשיר ונסה שוב.

כאשר הצינורית מגיעה לפיצול שבו קנה הנשימה מתפצל לסמפונות השמאלית והימנית, בצע תנועת פיתול קלה לכיוון הצד השמאלי של החיה כדי להבטיח שהצינורית מוכנסת לסמפונות השמאליים. טעות נפוצה היא אי הכנסת החיסון עמוק מספיק לתוך הריאה, מה שעלול לחסום את דרכי הנשימה ולעכב את הנשימה. כאשר הופכים את הצינורית לזווית הנכונה, היא צריכה להחליק בקלות לתוך הסימפונות השמאליים ולהתקדם בצורה חלקה לעומק המתאים.

קדם את צינורית המתכת עד שהקצה נמצא באמצע הדרך לשלושה רבעים במורד הריאה השמאלית, באמצעות סימן ההנחיה שהוצב קודם לכן כדי לאשר שהעומק המתאים הושג. כשצינורית המתכת במקומה, קדם את צינורות הפוליאתילן כמה מילימטרים באמצעות סימן ההנחיה שהוצב קודם לכן על הצינור כדי להבטיח שהוא מתקדם רק מספיק כדי לצאת מקצה צינורית המתכת ולא לנקב את הריאה. כאשר שתי הצינוריות במקומן, השתמש במזרק המצורף כדי להחדיר 100 מיקרוליטר של תרחיף אגר עמוק לתוך האונה הגדולה של הריאה השמאלית.

משוך כמה מילימטרים מהצינור והסר בעדינות את מכשיר האינטובציה השלם. החזירו אותו לצינור האחסון מזכוכית והעבירו את החיה לכלוב טרי כדי להתאושש. הכן את משטח העבודה והצינורית כפי שהודגם זה עתה עבור חולדות, באמצעות הציוד בגודל המתאים לעכברים.

השתמש במזרק חד פעמי סטרילי של 1 מיליליטר ובמחט סטרילית בגודל 25 כדי למלא את מזרק המיקרו-הזרקה מזכוכית במי מלח סטריליים. לאחר מכן, שטפו את מי המלח דרך המכשיר שהורכב מחדש. לאחר מכן, השתמש במזרק חד פעמי סטרילי חדש של מיליליטר אחד ובמחט סטרילית בגודל 25 כדי למלא את מזרק המיקרו-הזרקה בחיסון אגר

לאחר מכן, הרכיבו מחדש את המכשיר ושטפו אגר דרך הצינור רק עד שהצינור מתמלא לחלוטין באגר. לאחר הרדמת העכבר על פי פרוטוקול הטקסט, מקם את החיה באותו כיוון שהודגם עבור החולדה, והשתמש בלחץ קבוע אך עדין כדי להחדיר את קנה הנשימה באופן דומה לזה של החולדה. הימנע משימוש בכוח מכיוון שהטכניקה עדינה יותר בעכברים.

ודא שהצינורית מוחדרת לקנה הנשימה על ידי מישוש טבעות קנה הנשימה. סובב מעט וקדם את הצינורית לתוך הסימפונות השמאליים, והכניס עמוק לריאה באמצעות סימני הנחיה שהוצבו בעבר. עם צינורית המתכת במקומה, קדם את צינורות הפוליאתילן כמה מילימטרים והחדיר 20 מיקרוליטר של מתלה אגר.

מוצגת כאן דוגמה מייצגת של מושבות הגדלות על צלחת אגר לאחר דילול סדרתי וציפוי משולש של דגימת ריאה הומוגנית. כפי שמודגם בגרף זה עם S.pneumoniae, עלייה בעומס החיידקים של מספר CFU על בסיס 10 מעל בקרות הבסיס נצפית בדרך כלל בריאות נגועות עבור רוב החיידקים המבודדים, אפילו 96 שעות לאחר ההדבקה, והשונות בין בעלי חיים נמוכה. בניסוי זה, שתי תרכובות הוערכו כנגד מבודדים רגישים לקווינולון או עמידים לקווינולון של S.pneumoniae כדי להמחיש שניתן להשתמש במודל זיהום ריאות זה במהלך אופטימיזציה של סדרה כימית מובילה כדי לתמוך בקשרי פעילות מבנה.

כל סמל מייצג CFU שנקבע מריאותיה של חולדה אחת. מוצגים כאן מודלים של E max שנוצרו באמצעות נתוני יעילות בטווח מינון בעכברים בעלי יכולת חיסונית הנגועים בריאה עם מבודדים של S.pneumoniae או H.influenzae כדי לקבוע יעדים פרמקוקינטיים ופרמקודינמיים למעכב פוליפפטיד דפורמילאז חדש. עיגולים מייצגים את עומס החיידקים הממוצע מארבעה עד חמישה עכברים לקבוצה שטופלה במינונים שונים של תרכובת.

העיגולים הפתוחים מייצגים שטח פנוי מתחת לעקומה ועיגולים מלאים מייצגים את השטח מתחת לעקומת זמן הריכוז מעל הריכוז המעכב המינימלי. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך כ-30 שניות לכל חיה, עם עד חמישה או שישה בעלי חיים מחוסנים לכל מזרק של חיסון אגר. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להיות בעל הבנה טובה כיצד לבצע את שיטת הזיהום התוך-סימפונות הלא ניתוחית הזו ולהיות מסוגל להשתמש בה לביסוס זיהומי ריאות עם מבודדי חיידקים רבים ושונים.

אינסטרומטנל אנרגטי