דור של תאי גזע מושרים אינטגרציה נטולה מן אדם הדם ההיקפי mononuclear תאי שימוש וקטורי Episomal

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר תאי iPS מתאים חד-גרעיניים מדם היקפי אנושי בוגר באמצעות וקטורים אפיזומליים שאינם משתלבים. פרוטוקול זה יכול לסייע למדענים בתחום תאי הגזע שרוצים לייצר תאי iPS לניטור מחלות, סינון תרופות ורפואת רדיו רגילה. פרוטוקול התכנות מחדש שלנו פשוט מאוד, אך יעיל ביותר.

בעקבות הליך זה, ניתן לשלוט בקלות בטכניקה של תכנות מחדש של תאי דם. איכות הפלזמה חשובה לא פחות לתכנות מחדש מוצלח. מזהמים עלולים להפחית את יעילות התכנות מחדש, לכן אנו ממליצים להשתמש בערכות Endofree לטיהור פלסמידים אפיזומליים.

תאי iPS שבירים יותר מתאים אחרים. הכנת תאים ליותר מגן אחד במהלך העברת הגן עלולה לגרום למוות מסיבי של תאים, במיוחד במעברים מוקדמים. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו את כל אמצעי התרבות הנדרשים בהתאם לכתב היד הנלווה.

לאחר מכן שלבו 10 מ"ל של דגימת PB טרייה ועשרה מ"ל של מאגר PBS לתוך צינור של 50 מ"ל וערבבו היטב. הביאו PBS לטמפרטורת החדר או 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. לאחר מכן, הוסף 10 מ"ל פיקול לתחתית הצינור.

תהליך זה צריך להתבצע לאט כדי להבטיח ששכבת הפיקול לא תתערבב עם ה- PB. צנטריפוגה את התערובת בחום של 400 x גרם למשך 30 דקות עם תאוצה והאטה נמוכים. לאחר צנטריפוגה, ה-PB MNCs נמצאים בשכבה הלבנה הממוקמת בין פלזמת PB לפיקול. שאפו לאט 10 מ"ל פלזמה PB מבלי להפריע לשכבת הפיקול הבוהק.

לאחר מכן קצרו בזהירות את השכבה הלבנה לצינור חדש של 50 מ"ל. הנפח הכולל של התאים שנאספו מהשכבה הלבנה צריך להיות כשלושה עד שישה מ"ל. לאחר מכן, הוסף PBS כדי להביא את הנפח הכולל ל-30 מ"ל ולערבב היטב.

לאחר מכן צנטריפוגה את הדגימה ב -400 x גרם למשך עשר דקות. לאחר עשר דקות, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את כדור התא במדיום תרבית של 20 מ"ל. מערבבים היטב וצנטריפוגה את הדגימה בחום של 400 x גרם למשך חמש דקות כדי להסיר את רוב הטסיות.

לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את גלולת התא במ"ל אחד עד שניים של IMDM. התאים עשויים לשמש לתרבית מיידית או להקפיא לשימוש מאוחר יותר. לשימור בהקפאה, הוסף כמות שווה של מדיום שימור בהקפאה.

מכניסים את התאים לקריוביאל ומעבירים אותם מיד למקפיא של 80 מעלות צלזיוס. בהליך זה, הכינו חמישה מ"ל של מדיום IMDM בצינור של 15 מ"ל. הפשירו במהירות את ה-PB MNCs הקפואים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס לפני העברתם לצינור עם מדיום IMDM.

צנטריפוגה את הדגימה ב-400 x גרם למשך חמש עד עשר דקות. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את כדור התא במדיום אריתרואידי. לאחר מכן ספרו את התאים תחת מיקרוסקופ באמצעות המוציטומטר.

לאחר מכן, תרבית PB MNCs בתרבית שאינה רקמה טיפלה בצלחת שש בארות עם שני מ"ל של מדיום לבאר ב-37 מעלות צלזיוס בחממה לחה של פחמן דו חמצני של 5%. יום שלישי ויום חמישי, הוסף מ"ל אחד של מדיום אריתרואיד טרי ישירות לכל באר מבלי לשנות את המדיום. ביום השישי, קצרו PB MNCs לנוקלאופציה.

יום אחד לפני הגרעין יש לצפות מראש את תרבית הרקמה שטופלה בשש צלחות-באר עם 0.1% ג'לטין ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. הפשירו את תאי הזנת ה-MEF המומתים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס והעבירו אותם מיד לצינור של 15 מ"ל המכיל חמישה מ"ל של מדיום MEF. לאחר מכן, צנטריפוגה אותם בחום של 400 x גרם למשך חמש דקות והוציאו את הסופרנטנט.

לאחר מכן הסר את הג'לטין מצלחת שש הבארות והשהה מחדש את כדור התא במדיום MEF. לאחר מכן, זרעו את תאי ה-MEF המומתים בשני מ"ל של מדיום MEF בכל באר של ג'לטין שטופלו מראש בצלחת שש בארות ותרבו אותם ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח של 5% פחמן דו חמצני. ביום הגרעין יש לשאוב את מדיום ה- MEF ולהחליף אותו במ"ל אחד של מדיום אריתרואיד.

לאחר מכן יש לאזן מראש את צלחת התרבות למשך 10-30 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס בחממה לחה של 5% פחמן דו חמצני. הוסף שני מיקרוגרם PEV OCT4 ל-Sox2, מיקרוגרם אחד PEV MYC, מיקרוגרם אחד PEV KLF4 ו-0.5 מיקרוגרם PEV Bcl-XL בצינור סטרילי של 1.5 מ"ל. מחממים את הצינור בחום של 50 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי למנוע זיהום ולאחר מכן מקררים אותו לטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, הוסף לדגימה 57 מיקרוליטר של מאגר נוקלאופקציה ו-13 מיקרוליטר של מאגר תוסף. קצרו פעמיים עשר עד שישית PBMNCs מתורבתים לצינור של חמישה מ"ל על ידי צנטריפוגה ב-200 x גרם למשך שבע דקות. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט והוסף את תערובת מאגר הפלסמיד והנוקלאופקציה לגלולת התא.

לאחר מכן מערבבים היטב על ידי לחיצה על הצינור באצבע. לאחר מכן, העבירו את ה-DNA בתרחיף התאים לקובט המסופק על ידי הערכה וכסו את הקובטה. בחר תוכנית U-008 במכשיר הגרעין.

לאחר מכן, הכנס את הקובטה למחזיק ולחץ על אישור. לאחר מכן, הוציאו את הקובט מהמחזיק. הוסף 0.5-1 מ"ל של מדיום אריתרואיד שחומם מראש לכל קובטה והעביר את התאים לצלחת MEF מאוזנת מראש. עבור דגימות מסוימות, אתה עשוי לקבל אלפי מושבות ממיל אחד של דם.

אם ברצונך לבחור מושבה בודדת לתרבית נוספת, ייתכן שתצטרך לזרוע באר אחת נוספת עם מיליון תאים בלבד. ממש לפני הכנסת תא ההיפוקסיה לחממה, נדנד בעדינות את החדר מספר פעמים כדי ליצור פיזור אחיד של תאים בבארות התרבות. לאחר מכן העבירו את הצלחת לתא היפוקסיה.

יש לשטוף את החדר בגז מעורב למשך דקה עד שתיים בקצב של 20 ליטר לדקה. לאחר מכן, אטמו את החדר ותרבו את הדגימה ב-37 מעלות צלזיוס. ביום השני לאחר הנוקלאופקציה, הוסף שני מ"ל של מדיום iPSC ישירות לכל באר.

ביום הרביעי לאחר נוקלאופקציה, הסר שלושה מ"ל של מדיום והוסף שני מ"ל של מדיום iPSC טרי. בשלב זה, רוב התאים החיים נצמדו לשכבת המזין. לאחר היום השישי לאחר הנוקלאופקציה, החלף את המדיום כל יומיים על ידי השארת 500 מיקרוליטר של מדיום משומש והוספת שני מ"ל של מדיום E8 טרי בתוספת 0.25 מילימול נתרן בוטיראט עד ימים 14-18.

מוצגת כאן סכימה של הפרוטוקול לתכנות מחדש של תאי דם היקפיים. תמונה זו מציגה את ה-AP עומד בקערה, וזו מציגה מושבת iPSC טיפוסית דמוית ESC ביום ה-14 לאחר גרעין PB MNCs. להלן דיאגרמות FACS מייצגות של iPSCs במעבר חמש המבטאות TRA-1-60 או SSEA4.

להלן התמונות הקונפוקליות המייצגות של מושבות iPSC המבטאות NANOG ו-OCT4. התמונות כאן מראות את צביעת ה-H&E של הטרטומה, הכוללת את כל שלוש שכבות הנבט. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד ליצור תאי iPS ללא אינטגרציה מתאים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי.

לאחר שליטה, ניתן לייצר כמויות גדולות של תאי iPS תוך שלושה שבועות, כך שהזמן המעשי ייקח פחות משלוש שעות. פיתחנו מערכת וקטורית אפיזומלית פשוטה לתכנות מחדש יעיל של תאי דם. אנו מאמינים שניתן לאמץ את המערכת הזולה הזו בקלות, במיוחד במעבדות קטנות עם משאבים מוגבלים.

אל תשכח שעבודה עם דם אנושי ופלזמות עלולה להיות מסוכנת, ויש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות ומעילי מעבדה בזמן ביצוע הליך זה.