הפעלת Autophagy ידי פעילות גופנית אירובית בעכברים
3 בפברואר 2017
Autophagy ההפעלה מועילה במניעת מספר מחלות. אחת הגישות הפיזיולוגיות לגרום autophagy in vivo הוא פעילות גופנית. כאן אנו מראים כיצד להפעיל autophagy ידי פעילות אירובית ולמדוד רמות autophagy בעכברים.
המטרה הכללית של ניסוי זה היא להפעיל פיזיולוגית אוטופגיה בעכברים באמצעות ריצה כפויה או רצונית, ולאחר מכן למדוד את רמות האוטופגיה ברקמות ספציפיות. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח הנוגעות לאוטופגיה, ובמיוחד לאופן שבו אוטופגיה ופעילות תורמות להשפעות המיטיבות המתווכות על ידי פעילות אירובית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שפעילות גופנית מהווה דרך מהירה להשראת אוטופגיה in vivo באמצעות עכברים.
עבור ניסוי זה, השתמשו בעכברי C57 black six בני שמונה עד שנים עשר שבועות, הנושאים גן טרנסגני לגילוי אוטופגיה המושרה על ידי פעילות גופנית in vivo, הידוע כ-GFP-LC3. לפרטים על השימוש במכשירי הליכה לעכברים, ראו את פרסום JoVE הבא. הגדירו את הגירוי החשמלי של מכשיר ההליכה לעוצמה נמוכה.
בשני המפגשים הראשונים, הגשילו את העכברים להליכון פתוח בשיפייה של עשרה מעלות כלפי מעלה. ביום הראשון, הגשילו את העכברים למשך חמש דקות כאשר ההליכון פועל במהירות של שמונה מטרים לדקה. ביום השני, הגשילו את העכברים למשך עשר דקות, בתחילה במהירות של שמונה מטרים לדקה, ולאחר חמש דקות, הגבירו את המהירות לעשרה מטרים לדקה.
ביום השלישי, הרצו את העכברים למשך 90 דקות מלאות. הפעילו את מסוע הריצה במהירות של 10 meters per minute ועודדו את העכברים לרוץ באמצעות דחיפות עדינות כדי למנוע הלמים חשמליים חוזרים בכפות הרגליים. קריטי להשגיח על העכברים ולכוון אותם כדי שלא יספגו יותר מדי הלמים חשמליים במהלך ריצת ה-90 דקות.
במהלך ההרצה, השתמש באצבעותיך כדי לעודד את העכברים להישאר על המסוע. לאחר 40 דקות, הגדל את המהירות במטר אחד לדקה. לאחר 50 דקות, הגדל שוב את המהירות במטר אחד לדקה.
לאחר 60 דקות, הגדילו את המהירות במטר נוסף לדקה. לאחר 70 דקות, התחילו להגדיל את המהירות בכל חמש דקות, כך שבחמש הדקות האחרונות של הריצה בת 90 הדקות תהיה המהירות 17 מטרים לדקה. עם סיום הניסוי, בצעו הריגה מיידית של העכברים לצורך איסוף רקמות במידה ונדרש.
עבור בדיקה זו, שכן את העכברים באופן פרטני. השתמש באותו זן כפי שתואר בעבר. הכן גלגל ריצה לעכברים בעל קוטר של 11.4 centimeter עם מד מרחק (одоמטר) מחובר.
כל סיבוב צריך למדוד 358 millimeters של מרחק. העבירו את העכבר לכלוב המכיל את הגלגל ואפשרו לו להשתמש בו בחופשיות למשך שבועיים. בכל 24 שעות, רשמו מהמד את המרחק שעבר העכבר.
לאחר שבועיים, קצרו את הרקמות לאנליזה לפי הצורך. כדי למדוד את השטף האוטופגי, טפלו בעכברים במעכב האוטופגיה, chloroquine, למשך שלושה ימים. המיסו את ה-chloroquine ב-PBS בריכוז של 5 mg/mL והזריקו אותו לעכברים באופן תוך-peritoneal במינון של 50 µg/g.
החדירו לעכברים זריקה אחת מדי יום למשך שלושה ימים רצופים, ואספו את הרקמות שלוש שעות לאחר הזריקה האחרונה. עבור העכברים שהפעילו עצמם על מסוע ריצה, התחילו את הריצה למשך 90 דקות כ-90 דקות לאחר הזריקה ביום השלישי, כך שהריצה תסתיים שלוש שעות לאחר הזריקה. לאחר מכן, בצעו הפתנסיה לעכברים ואספו את הרקמות שלהם באופן מיידי.
הכינו את חומר הקיבוע כדי לבצע פרופוזיה לבעל החיים בתוך 90 דקות לאחר הפעלתו. מלאו מזרק של 30 מיליליטר ב-15 עד 20 מיליליטר של פראפורמאלדהיד בריכוז ארבעה אחוזים שהוכן טרי, וחברו למזרק מחט קטטר במידה 20. חברו את המזרק למשאבה והגדירו אותה לזרימה רציפה של 90 מיליליטר לשעה.
כאשר בעל החיים נמצא על משטח עבודה נקי, במצב שכיבה על הגב, חתכו את חלל בית החזה דרך הסרעפת כדי לחשוף את הלב. כעת, הכניסו את מחט הקטטר לתוך החדר הימני. לאחר מכן, בצעו חתך קטן בכבד כדי לנקז את הדם והפעילו את המשאבה.
הזריקו את המקבע עד שהריאה והכבד יהפכו לחיוורים לחלוטין. בדרך כלל, 15 milliliters של מקבע יספיקו. לאחר הפרופוזיה, הוציאו את המחט ואספו את הרקמות הרלוונטיות.
לאיסוף שריר שלד, בצעו דיסקציה של השריר ה-vastus lateralis. משכו קלות את עור הרגל לאחור כדי לחשוף את השרירים ואתרו את ה-quadriceps femoris. לאחר מכן, הוציאו בדיסקציה את ה-vastus lateralis, שהוא השריר החיצוני המחובר לחלק העליון של עצם הירך.
לקיבוע ודהידרציה נוספים, העבירו את הרקמות שנאספו לתוך פאראפורמאלדהיד בריכוז 4% למשך 24 שעות בטמפרטורה של 4°C. למחרת, העבירו את הרקמות ל-PBS עם סוכרוז בריכוז 15% והשאירו אותן להשריה ב-4°C למשך לילה או עד שהן שקעו בתמיסה. לאחר מכן, העבירו את הרקמות ל-PBS עם סוכרוז בריכוז 30% ב-4°C למשך לילה או למשך זמן ממושך יותר.
יש לשמור על הרקמות בחשיפה מינימלית לאור ככל האפשר במהלך רחצות אלו. לאחר מכן, העבירו את הרקמות לתווך שימור כגון OCT וכסמו אותן לחתיכות קטנות יותר במידת הצורך. לאחר מכן, המתינו מספר דקות להסתגלות בתוך צלחת פטרי קטנה.
לאחר מכן, העבירו אותם לתבניות הקפאה (cryomolds) עם כמות מספיקה של OCT לכיסוי. בתוך התבניות, כוונות את משטחי החיתוך כלפי מטה והימנעו מהיווצרות בועות. לאחר מכן, הקפיאו את הדגימות במקרר קלקר מכוסה המלא בקרח יבש עד שה-OCT הופך ללבן.
כעת, עטפו דגימות בודדות בנייר גביס (foil) מסומן, אטמו אותן בשקית פלסטיק ואחסנו אותן בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד למועד העיבוד. באמצעות שימוש ב-LC3 המסומן ב-GFP כמערכת דיווח, נצפתה השראת אוטופגיה בעכברים שעברו אימון כמתואר. לאחר גירוי האוטופגיה, LC3 עבר מהציטוזול לאוטופגוזום במבנים נקודתיים.
בעכברים שעמדו במאמץ גופני נצפו הרבה יותר נקודות (puncta) של GFP-LC3 הן בשריר השלד והן בקליפת המוח בהשוואה לעכברים במצב מנוחה. ניתוח Western blot באמצעות נוגדן LC3 הראה כי הפעילות הגופנית הובילה להשראה משמעותית של ייצור LC3-II המצומד לליפידים, מה שמעיד על עלייה בהמרה של LC3-I ציטוזולי ל-LC3-II. לאחר מכן, נמדד קצב הפירוק של קולטן המטען האוטופגי, p62.
90 דקות של פעילות על מסוע גרמו לפירוק מוגבר של p62 בשריר השלד בהשוואה למצב מנוחה. אפקט זה נבלם על ידי הזרקה של chloroquine לפני הפעילות. מאחר ש-chloroquine הוא מעכב של פירוק ליזוזומלי, נתונים אלו מעידים כי התופעה שנצפתה נובעת מזרימה אוטופגית מוגברת ולא מחסימה בפירוק האוטופגוזומים.
לאחר פיתחו, היו לטכניקה זו קודמים בתחום האוטופגיה (autophagy) כדי לבחון את ההשפעות של מנגנון הפעילות הגופנית על פירוק חילופי החומרים והתנהגויות של בעלי חיים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לנטר את העכברים בזמן שהם רצים. לאחר הליך זה, מבוצעות שיטות כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית.
ניתן לבצע מיקרוסקופיה של בעלי חיים כדי לענות על שאלות נוספות, כגון תפקידה של פעילות גופנית במסלולי אוטופגיה סלקטיבית, כמו מיטופגיה וליפופגיה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את הפעלת האוטופגיה באמצעות פעילות אירובית בעכברים. על ידי מדידת רמות האוטופגיה ברקמות ספציפיות, המחקר שואף להשקיף על היתרונות הפיזיולוגיים של הפעילות הגופנית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- פיזיולוגיה
- ביולוגיה של התא
רקע
- אוטופגיה היא תהליך תאי המסייע בפירוק ובמיחזור של רכיבים תאיים.
- ידוע כי פעילות גופנית מעוררת אוטופגיה (בליעה עצמית) במודלים חיים (in vivo).
- הבנת הקשר בין פעילות גופנית לאוטופגיה עשויה לספק תובנות לגבי מניעת מחלות.
- מחקר זה עושה שימוש בעכברי C57 black six עם טרנסגן לזיהוי אוטופגיה המושרה על ידי פעילות גופנית.
מטרת המחקר
- להפעלת אוטופגיה בעכברים באמצעות ריצה כפויה או רצונית.
- למדידת רמות האוטופגיה ברקמות ספציפיות לאחר פעילות גופנית.
- לבחינת האופן שבו אוטופגיה תורמת ליתרונות של פעילות אירובית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש בעכברי C57 black six בני שמונה עד שנים עשר שבועות.
- הטמעה של הליכון לאימון עם גירוי חשמלי בעוצמה נמוכה.
- מדידת רמות אוטופגיה באמצעות טרנסגן GFP-LC3.
- השוואה של רמות האוטופגיה לפני ואחרי האימון.
תוצאות עיקריות
- פעילות גופנית אירוביתּיּיבּה בהצלחה הפעלה של אוטופגיה.
- רקמות ספציפיות הראו רמות משתנות של אוטופגיה לאחר הפעילות.
- הממצאים תומכים בהשערה שפעילות גופנית מגבירה אוטופגיה.
- התוצאות תורמות להבנת היתרונות הפיזיולוגיים של פעילות גופנית.
מסקנות
- פעילות גופנית אירובית היא שיטה יעילה להפעלת אוטופגיה in vivo.
- הבנת תפקידה של האוטופגיה יכולה לסייע באסטרטגיות למניעת מחלות.
- נדרש מחקר נוסף כדי לבחון את המנגנונים העומדים מאחורי השפעות אלה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מחקר זה מדגים שיטה פיזיולוגית להפעלה של אוטופגיה in vivo באמצעות פעילות אירובית בעכברים, ובכך מספק גישה לא-פארמקולוגית לוויסות של מסלול פירוק תאי מרכזי. היכולת לכמת את שטף האוטופגיה באמצעות סממנים של LC3 ו-p62 מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של התערבויות הקשורות לפעילות גופנית במודלים פרה-קליניים. הדבר תומך בתיקוף של מטרות ובפיתוח בדיקות עבור מחלות שבהן ויסות של האוטופגיה הוא רלוונטי מבחינה טיפולית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של אוטופגיה כמטרה טיפולית באמצעות השראה פיזיולוגית במקום סוכנים פרמקולוגיים.
- ערך תפעולי: משתמש במערכת דגלים של GFP-LC3 כדי להדמיז ויזואלית את היווצרות האוטופגוזומים ברקמות ספציפיות כגון שריר שלד וקליפת המוח.
- ערך ניבוי: מודד את המרת LC3-II לליפידציה ואת פירוק p62 כדי להעריך את שטף האוטופגיה, ובכך תומך בביטחון לגבי מעורבות המטרה וביצוע המודולציה של המסלול.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: קביעת פרוטוקולים סטנדרטיים להתרגילות על מסוע וריצה רצונית בגלגל לצורך השראת אוטופגיה באיברים מרובים.
- תוצר כמותי: שימוש ב-Western blot ובמיקרוסקופיה למדידת רמות LC3-II ופירוק p62 כמדדים אמינים לפעילות אוטופגית.
- שחזור: הטיפול כולל שימוש ב-chloroquine כדי להבדיל בין עלייה בזרם האוטופגיה (autophagic flux) לבין פירוק לקוי, ובכך להגביר את ספציפיות הבדיקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלות: מקשר בין פעילות אירובית לבין ויסות חיובי (upregulation) של אוטופגיה בכבד, בלב, במוח ובשרירים — רקמות הרלוונטיות למחלות מטבוליות, נוירודגנרטיביות ומחלות קרדיווסקולריות.
- המשכיות תרגומית: תומך בהערכה פרה-קלינית של התערבויות באורח החיים על ידי אספקת מדד ביומרקר מדיד (LC3-II/p62) להפעלת המסלול.
- הפחתת סיכונים מנגנוניים: מבהיר האם התועלות שנצפו נובעות מזרימה אוטופגית מוגברת לעומת פירוק חסום, ובכך מפחית פרשנויות של חיוביים שגויים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזות של מטרות ועד לתיקוף פרה-קליני, ובמיוחד עבור מסלולים המערבים הומאוסטזיס תאי ותגובה למעקה.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות לגבי תפקידה של האוטופגיה ביתרונות המתווכים על ידי פעילות גופנית, באמצעות מתן אפשרות להפעלה מבוקרת וניתנת להשראה in vivo.
- סריקה: מכינה מערכות ביולוגיות מתוקפות (למשל, רקמות של עכברים שעברו פעילות גופנית) לסריקה גנטית או של תרכובות במטרה לזהות רגולטורים של אוטופגיה.
- אנליטיקה: מייצרת מדידות כמותיות של משתנים תלויים (המרה של LC3-II, פירוק p62) המאפשרות השוואה בין תנאים ונקודות זמן שונות.
- מחקר טרנסלציונלי: מקשרת ממצאי גילוי להמשכיות פרה-קלינית על ידי התאמת אוטופגיה המושרית בפעילות גופנית למודלים של מחלות ספציפיות לרקמה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה רב-שימוש להערכת מודולציה של אוטופגיה בתחומי מחלה מגוונים, תוך שימוש בפרוטוקולים סטנדרטיים של פעילות גופנית וזיהוי.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מספק תובנה מכניסטית לגבי בקרה של אוטופגיה, ובכך מפחית עמימות במחקרי תיקוף של מטרות טיפוליות.
- ערך תפעולי: מספק פרוטוקולים סטנדרטיים וניתנים לשחזור להשראה ומדידה של אוטופגיה in vivo באמצעות ציוד נגיש (מספרי רכיצה, גלגלי ריצה).
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של go/no-go על ידי מתן אפשרות להערכה פרה-קלינית של אסטרטגיות לוויסות אוטופגיה בעלות רלוונטיות פיזיולוגית.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים של תוכניות המכוונות לאוטופגיה באמצעות נתונים פרה-קליניים חזויים ומבוססי-מכניזם.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בטיפול בבעלי חיים, פיזיולוגיה של מאמץ ותזמון של קצירת רקמות כדי למנוע גורמים מבלבלים של סטרס או פציעות.
- תלויה בציוד הכולל הליכות מכויילות, גלגלי ריצה עם מד מרחק ומערכות פרפוזיה לקיבוע רקמות.
- מחייבת סטנדרטיזציה בין מעבדות לגבי משך הפעילות הגופנית, העצימות ומינון ה-chloroquine כדי להבטיח מדידות השוואתיות של שטף אוטופגיה (autophagic flux).
- שיקולי התאמה כוללים שונות תלוית-רקמה בתגובת האוטופגיה והצורך בקצירה בזמן מיד לאחר הפעילות הגופנית או הטיפול במעכב.
- מגבלות מעשיות כוללות שונות בין בעלי חיים במרחק הריצה הרצוני ואתגר טכני בשמירה על עצימות פעילות גופנית עקבית ללא שימוש בגירויי חשמל מוגברים בכפות הרגליים.
