Name: הפעלת Autophagy ידי פעילות גופנית אירובית בעכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: חקור הפעלת אוטופגיה באמצעות פעילות גופנית אירובית בעכברים. שיטה זו מאפשרת למדוד רמות אוטופגיה ברקמות שונות ולהבין את הקשר בין התעמלות לבריאות תאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים למעבדה להיסטולוגיה ופנוטיפ של עכברים באוניברסיטת נורת'ווסטרן על התמיכה הטכנית והסיוע, ול-Noboru Mizushima (אוניברסיטת טוקיו) על אספקת עכברים טרנסגניים GFP-LC3. A.R. ו-C.H. נתמכו על ידי קרנות הסטארט-אפ מאוניברסיטת נורת'ווסטרן ומענק מהמכונים הלאומיים לבריאות (DK094980).

כל הנהלים הקשורים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות שאושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים אוניברסיטת נורת&#39;ווסטרן ועדת שימוש (IACUC). 1. מודלים עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש 8-12 עכברים שבועות בן באימון התעמלות. כדי לזהות autophagy למימוש מושרה in vivo, השתמשו העכברים המהונדסים GFP-LC3 (C57BL / 6 רקע) עבור בדיקות הדמיה ועכברי C57BL / 6 עבור ניתוחים ביוכימיים. </li></ol> Autophagy 2. הנגרמת ממאמץ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנת הליכון - נאלץ תרגיל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאקלם ולאמן את העכברים על הליכון פתוח במעלה ההר 10 מעלות במשך 2 ימים. ביום 1, לממש את העכברים במשך 5 דקות ב 8 מ &#39;/ דקה, וביום 2, לממש את העכברים במשך 5 דקות ב 8 מ&#39; / דקה ואחריו 5 דקות אחר ב -10 מ &#39;/ דקה 10. עודד העכברים המנוהל על ידי דחיפת יד עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 3 rd, מלאפשר לעכברים לעבור התקף יחיד של ריצה במשך 90 דקות על 10 ° הליכון במעלה ההר, starting במהירות של 10 מ &#39;/ דקה. לאחר 40 דקות, להגביר את מהירות הליכון בקצב של 1 מ &#39;/ דקה כל 10 דקות עבור סכום כולל של 30 דקות, ולאחר מכן להגביר את המהירות בשיעור של 1 מ&#39; / דקה כל 5 דקות עד שהוא מגיע 17 מ &#39;/ דקה, עבור סכום כולל של 90 דקות של זמן אימון ל -1,070 מטרים של מרחק ריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הגירוי החשמלי מגוון בעצימות נמוכה (1.2 הרץ), ולעודד העכברים לרוץ כדי למנוע הלם ברגל חזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת אוסף רקמות, להרדים את העכברים משאיפת isoflurane, ואחריו נקע בצוואר הרחם מיד לאחר פעילות גופנית. שיטות מתת חסד אשרו אחרים יכולות לשמש גם, כגון CO2 או הזרקת IP של הרדמה אחרת. רמת autophagy לא נראית להיות מושפעת שיטות של המתת חסד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקנת גלגל ריצה - גופני רצונית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים גלגל ריצה-עכבר (11.4 ס&quot;מ קוטר) בתוך כלוב עם העכבר חד שוכנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הקיבולת פועלת באמצעות מד מרחק אופניים.הגדרת פרמטר הגלגל [מרחק (במ&quot;מ) לכל סיבוב מלא של ההגה], בעמ &#39;358 (11.4 * π). למדוד את מרחק הריצה לאחר 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תנו עכבר להפעיל בהתנדבות עבור 2 שבועות עם גלגל ריצה. לקבלת אוסף רקמות, להקריב את העכבר בבוקר לאחר תקופת הריצה. </li></ol></li></ol> 3. Autophagy הערכת שטף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד את השטף autophagic בתנאים מנוחה ופעילות גופנית, טיפול בעכברים עם chloroquine autophagy מעכב במשך שלושה ימים ולהשוות אותם העכברים שטופלו PBS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים chloroquine PBS (5 מ&quot;ג / מ&quot;ל), ולהזריק chloroquine לעכברים intraperitoneally במינון של 50 מ&quot;ג / ק&quot;ג / יום, במשך שלושה ימים רצופים. קורבן עכברים ולאסוף רקמות 3 שעות לאחר הזריקה האחרונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור עכברים למימוש, pretreat אותם עם chloroquine במשך יומיים רצופים במינון של 50 מ&quot;ג / ק&quot;ג / יום. ביום השלישי, להזריק עכברים עם ריכוז זהה של chloroquine, ואחרי90 דקות ולתת להם לרוץ על הליכון למשך 90 דקות אחרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברים משאיפת isoflurane, ואחריו נקע בצוואר הרחם. דגימות של רקמות ומייד לאחר הפעלתו, כך שבפעם הדגירה הכוללת של chloroquine זהה עכברים שליטים (מנוחה) (3 שעות). הערה: לחילופין, להשתמש זריקה אחת של chloroquine לקבוע את השטף autophagy ברקמות העכבר. </li></ol></li></ol> רקמות 4. קציר קיבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני הקציר רקמות להכין פוספט בופר (PBS) ו paraformaldehyde 4% טרי (PFA, זהירות: ציוד מיגון אישי חובה) ב PBS ב- pH הסופי של 7.4. לאחסן הוא פתרונות על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו 30 מזרק מ&quot;ל עם 15 - 20 מ&quot;ל של 4% PFA (עבור עכברים GFP-LC3). חבר את המזרק עם מחט קטטר 20 G. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר פעילות גופנית, להרדים את העכברים משאיפת isoflurane, ואחריו נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את החיה על משטח עבודה נקי על ba שלהck. גזור לפתוח את חלל בית החזה על ידי חיתוך הסרעפת כדי לחשוף את הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך קטן על הכבד לתת את הדם לצאת, ולהזריק סך של 15 מ&quot;ל 4% PFA לאט לתוך החדר הימני של הלב באמצעות קטטר, עד הריאות והכבד להחוויר לחלוטין. Perfuse העכבר מיד לאחר האימון, באמצעות משאבת מזרק עם קצב הזרימה המתמדת של 90 מ&quot;ל / שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זלוף, להוציא את המחט ולאסוף רקמות עניין (מוח למשל 11 שרירי שלד). עבור שרירי השלד, לנתח את lateralis vastus. בקצרה, למשוך את העור של הרגל לאחור כדי לחשוף את השרירים, למקם את שריר הירך femoris 12, ו לנתח את lateralis vastus, המהווה את השריר החיצוני עם חיבור אל החלק העליון של עצם הירך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור קיבוע והתייבשות נוספים, למקם את הרקמות של עכברים-LC3 GFP ב PFA 4% למשך 24 שעות ב 4 ° C, ולאחר מכן להעביר אותם עד 15%סוכרוז- PBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה או עד שהשתקעו הרקמות, ולאחר מכן ל -30% סוכרוז-PBS ב 4 מעלות צלזיוס למשך לילה או לאחסון ארוך יותר. שמור את הדגימות בחושך ככל האפשר מכיוון שהם עלולים להיות רגישים לאור חזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לניתוח כתם המערבי הצמד להקפיא את רקמות מן C57BL / 6 עכברים ישירות בחנקן נוזלי, ולאחסן אותם ב -80 ° C. </li></ol> 5. ניתוח הדמיה של ה- GFP-LC3 puncta <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהליך רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום לטפל ברקמות (הקבועים בעבר PFA ומאוחסנים סוכרוז 30%) ב הטבעה בינונית כגון &quot;מתחם טמפרטורת חיתוך אופטימלי&quot; (אוקטובר) במשך כמה דקות בצלחת פטרי קטנה שכותרתו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הרקמה בתוך cryomold שכותרתו המכיל מספיק אוקטובר הטרי כדי לכסות את הרקמה. אוריינט פני השטח חתך לכיוון החלק התחתון של cryomold (חתך עבור vastus lateralis שרירים קטע sagittal עבור המוח חמי). למנוע היווצרות של בועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> freEze דגימות ידי הצבת cryomold במשך כמה דקות בתוך צידנית קצף ממולאת קרח יבש, עד ב- OCT הופך לבן. עוטפים דגימות בודדות רדידי שכותרתו, לאטום אותם בשקית ניילון, ולאחסן אותם ב -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה או יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש cryostat לחתוך חלקים מדגם בעובי של 10 מיקרומטר, ו הר בסעיפים בשקופיות. אחסן את השקופיות ב -20 ° C, ותמיד לשמור את השקופיות מן האור בכל הזדמנות אפשרית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת שקופיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר שקופית מהמקפיא להפשיר אותם בטמפרטורת חדר. מכסים את קטע רקמה עם ירידה של התקשורת גובר עם DAPI. מניחים coverslip בגודל המתאים על גבי למנוע היווצרות בועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרוח לק על הציפורניים כדי לאטום את הקצוות של coverslip, לאפשר לק להתייבש בחושך בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לאחסן את השקופיות במיכל אור חזק על 4 מעלות צלזיוס, או להמשיך עם לכידת הדמיה של puncta GFP-LC3. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &lt;strong&gt; כימות GFP - LC3 puncta ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע מיקרוסקופיה epifluorescence, לכידת תמונות באותו מצב (חשיפה והגדרות) עבור כל הדגימות. עבור GFP, להשתמש אורך גל פליטה של ​​525 ננומטר; עבור DAPI, השתמש 490 ננומטר. רוכש לפחות עשר תמונות לדגימה באמצעות מטרת 60X עבור lateralis vastus ואזור האונה הקדמי של המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת את מספר puncta GFP-LC3 באזור רקמות של 2,500 מיקרומטר 2 בכל תמונה לניתוח סטטיסטי, עיוור לקבוצות הניסוי. חשבתי את המספר הממוצע מ 10 תמונות של כל דגימה, באמצעות פונקצית המדידה האוטומטית של &quot;רוזן אובייקט&quot;. הגדרות עבור vastus lateralis שרירים הם: L סף = 10, H = 200; 2X להחליק; 1X נקי, והגדרות עבור האונה הקדמית במוח הם: L סף = 11, H = 200; 2X להחליק; 1X נקי. </li></ol></li></ol> 6. ניתוח כתם המערבי על מרקרים Autophagy <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &lt;תהליך strong&gt; רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החיץ תמוגה: 50 mM Tris-HCl; 150 מ&quot;מ NaCl; 1 mM EDTA; 1% Triton X-100; מעכב פרוטאז מעכב phosphatase (הוסיף טרי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרת הרקמה של C57BL / 6 עכברים מ -80 ° C אחסון. חותכים את רקמת השריר לחתיכות קטנות עם סכין גילוח לפני התהליך הבא. להוסיף 800 μl (עבור מוח חם) או 500 μl (עבור lateralis vastus) של חיץ תמוגה קר המדגם. Homogenize המדגם ב 4 ° C עם homogenizer במהירות בינונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא lyse את התערובת הומוגני במשך 30 דקות אחרות כדי השעה 1 ב 4 ° C עם רוטציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה homogenate ב XG 12,000 במשך 10 דקות ב 4 ° C, וזורקים את הכדור, ולאסוף את supernatant בצינור חדש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח autophagy <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת ריכוז החלבון של lysates רקמות באמצעות ערכת assay חלבון BCA על פי המפרט של היצרן. נרמל כל דגימהלאותו ריכוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את המדגם עם חיץ מדגם 2x Laemmli ביחס של 1: 1, להרתיח אותו ב 95 מעלות צלזיוס במשך 5 - 10 דק &#39;, והמשך עם ניתוח כתם המערבי על autophagy סמנים 13, 14, כגון p62 (נוגדן אנטי p62, 1: 500 דילול) ו LC3 (נוגדן אנטי LC3, 1: 500 דילול). מרתיח את הדגימות מייד לאחר תוספת של חיץ המדגם, כפי דגירה כבר על קרח עשויה ליצור להקות מושפלות מרובות של LC3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת להקות p62 ו LC3 ידי ניתוח צפיפות באמצעות ImageJ, לנרמל את הערך הלהקה אקטין המקביל. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+autophagy+in+response+to+nutrient+starvation+using+transgenic+mice+expressing+a+fluorescent+autophagosome+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker.</a> Mol Biol Cell. 15, 1101-1111 (2004).</li>
<li>Tracy, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BNIP3+is+an+RB%2FE2F+target+gene+required+for+hypoxia-induced+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+biology%22%5BJournal%5D)">BNIP3 is an RB/E2F target gene required for hypoxia-induced autophagy.</a> Molecular and cellular biology. 27, 6229-6242 (2007).</li>
<li>Mizushima, N., Komatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy%3A+renovation+of+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy: renovation of cells and tissues.</a> Cell. 147, 728-741 (2011).</li>
<li>Nikoletopoulou, V., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+the+physiology+and+pathology+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Autophagy in the physiology and pathology of the central nervous system.</a> Cell Death Differ. 22, 398-407 (2015).</li>
<li>Rocchi, A., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+autophagy+in+metabolism+and+metabolic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+biology%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of autophagy in metabolism and metabolic disorders.</a> Frontiers in biology. 10, 154-164 (2015).</li>
<li>Mathew, R., Karantza-Wadsworth, V., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+autophagy+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Role of autophagy in cancer.</a> Nature reviews. Cancer. 7, 961-967 (2007).</li>
<li>He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-induced+BCL2-regulated+autophagy+is+required+for+muscle+glucose+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Exercise-induced BCL2-regulated autophagy is required for muscle glucose homeostasis.</a> Nature. 481, 511-515 (2012).</li>
<li>He, C., Sumpter, R. J., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+induces+autophagy+in+peripheral+tissues+and+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Exercise induces autophagy in peripheral tissues and in the brain.</a> Autophagy. 8, 4(2012).</li>
<li>Kuramoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+activation+by+novel+inducers+prevents+BECN2-mediated+drug+tolerance+to+cannabinoids%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy activation by novel inducers prevents BECN2-mediated drug tolerance to cannabinoids.</a> Autophagy. 12, 1460-1471 (2016).</li>
<li>Dougherty, J. P., Springer, D. A., Gershengorn, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Treadmill+Fatigue+Test%3A+A+Simple%2C+High-throughput+Assay+of+Fatigue-like+Behavior+for+the+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">The Treadmill Fatigue Test: A Simple, High-throughput Assay of Fatigue-like Behavior for the Mouse.</a> JoVE. , (2016).</li>
<li>Navone, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+human+and+mouse+brain+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of human and mouse brain microvascular endothelial cells.</a> Nature protocols. 8, 1680-1693 (2013).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature protocols. 10, 1612-1624 (2015).</li>
<li>Eslami, A., Lujan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting%3A+sample+preparation+to+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Western blotting: sample preparation to detection.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).</li>
<li>Bjørkøy, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0076687908036124">Chapter 12 Monitoring Autophagic Degradation of p62/SQSTM1.</a> Methods Enzymol. 452, 181-197 (2009).</li>
<li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy+%283rd+edition%29%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy (3rd edition).</a> Autophagy. 12, 1-222 (2016).</li>
<li>Levine, B., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+the+Pathogenesis+of+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autophagy in the Pathogenesis of Disease.</a> Cell. 132, 27-42 (2008).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451, 1069-1075 (2008).</li>
<li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duration+of+rapamycin+treatment+has+differential+effects+on+metabolism+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Duration of rapamycin treatment has differential effects on metabolism in mice.</a> Cell Metab. 17, 456-462 (2013).</li>
<li>Thomson, A. W., Turnquist, H. R., Raimondi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoregulatory+functions+of+mTOR+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunoregulatory functions of mTOR inhibition.</a> Nature reviews. Immunology. 9, 324-337 (2009).</li>
<li>Miller, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapamycin-mediated+lifespan+increase+in+mice+is+dose+and+sex+dependent+and+metabolically+distinct+from+dietary+restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Rapamycin-mediated lifespan increase in mice is dose and sex dependent and metabolically distinct from dietary restriction.</a> Aging Cell. 13, 10(2014).</li>
<li>Grumati, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+exercise+stimulates+autophagy+in+normal+skeletal+muscles+but+is+detrimental+for+collagen+VI-deficient+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Physical exercise stimulates autophagy in normal skeletal muscles but is detrimental for collagen VI-deficient muscles.</a> Autophagy. 7, 1415-1423 (2011).</li>
<li>Lira, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+is+required+for+exercise+training-induced+skeletal+muscle+adaptation+and+improvement+of+physical+performance%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+journal+%3A+official+publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Autophagy is required for exercise training-induced skeletal muscle adaptation and improvement of physical performance.</a> FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 27, 4184-4193 (2013).</li>
<li>Lo Verso, F., Carnio, S., Vainshtein, A., Sandri, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25483961">Autophagy is not required to sustain exercise and PRKAA1/AMPK activity but is important to prevent mitochondrial damage during physical activity.</a> Autophagy. 10, 1883-1894 (2014).</li>
<li>Kregel, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.the-aps.org/mm/SciencePolicy/AnimalResearch/Publications/Animal-Exercise-Protocols">Resource book for the design of animal exercise protocols.</a> American Physiological Society. , 152(2006).</li>
<li>Lightfoot, J. T., Turner, M. J., Debated, K. S., Kleeberg, S. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11740298">Interstrain variation in murine aerobic capacity.</a> Med Sci Sports Exerc. 33, 5(2001).</li>
<li>Rezende, E. L., Chappell, M. A., Gomes, F. R., Malisch, J. L., Garland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximal+metabolic+rates+during+voluntary+exercise%2C+forced+exercise%2C+and+cold+exposure+in+house+mice+selectively+bred+for+high+wheel-running%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+biology%22%5BJournal%5D)">Maximal metabolic rates during voluntary exercise, forced exercise, and cold exposure in house mice selectively bred for high wheel-running.</a> The Journal of experimental biology. 208, 2447-2458 (2005).</li>
<li>Kayatekin, B. M., Gonenc, S., Acikgoz, O., Uysal, N., Dayi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+sprint+exercise+on+oxidative+stress+in+skeletal+muscle+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+applied+physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of sprint exercise on oxidative stress in skeletal muscle and liver.</a> European journal of applied physiology. 87, 141-144 (2002).</li>
<li>Kawanaka, K., Tabata, I., Tanaka, A., Higuchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+high-intensity+intermittent+swimming+on+glucose+transport+in+rat+epitrochlearis+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of high-intensity intermittent swimming on glucose transport in rat epitrochlearis muscle.</a> J Appl Physiol. 84, 4(1998).</li>
<li>Fernando, P., Bonen, A., Hoffman-Goetz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+submaximal+oxygen+consumption+during+treadmill+running+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Physiol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Predicting submaximal oxygen consumption during treadmill running in mice.</a> Can J Physiol Pharmacol. 71, 4(1993).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Autophagy הוא תהליך קטבולי המספק אנרגיה ומפחית רעילות על ידי השפלה lysosomal של רכיבים הציטופלסמה או אברונים פגומים. לימוד autophagy חשוב להבין הסדרת הומאוסטזיס הסלולר מנגנוני תגובת לחץ. מודלים ומתודולוגיות חדשים צצים בתחום המחקר 15, כדי ללמוד כיצד autophagy לקוי תורם תהליכים פתולוגיים רבים 16, 17. מניעת מזון (רעב) ואינדוקציה תרופת...

Autophagy הינו מסלול השפלה שמור באבולוציה, אשר נגרמת בתגובה לתנאי קיצון שונים כגון הרעבה היפוקסיה 1, 2. במהלך autophagy, שלפוחית כפולת הממברנה, שנקראה autophagosomes, לשלב רכיבי subcellular מיותרים או פגומים ולהעביר אותם לתוך lysosomes שפל 3. Autophagy בסל חיוני לתפקוד הסלולר ופיתוח האורגניזם, autophagy הבסיס לקוי הוא מעורב הפרעות רבות, כולל ניוון מוחיים, tumorigenesis וסוכרת מסוג 2 4, 5, 6. Inducer autophagy הפיזיולוגי הידוע ביותר הוא רעב. עם זאת, יש לו שתי מגבלות עיקריות. ראשית, רעב לוקח תקופה ארוכה כדי לגרום autophagy ביעילות בבעלי חיים, למשל, 48 שעות של הגבלת מזון בעכבריםברוב האיברים. שנית, רעב בקושי גורם autophagy המוח, בשל אספקת חומרי מזון יציבה יחסית במוח. למעשה, זה גם קשה לזהות אינדוקצית autophagy ידי מעורר-מולקולה קטנה, כמו תרופות רבות לא יכולות לעבור את מחסום דם המוח. לכן, כדי לנתח טוב יותר את הפונקציה של הפעלת autophagy בהיווצרות מחלה, גילינו לאחרונה כי פעילות גופנית היא שיטה פיזיולוגית חזקה יותר כדי לגרום autophagy בתוך פרק הזמן קצר 7, 8, 9. בהשוואה רעבה, autophagy מושרה ביעילות על ידי הפעלת הליכון מהר ככל 30 דקות. וכך, פעילות גופנית היא גישה פיזיולוגית נוחה ורב-עצמה כדי ללמוד את המנגנון של autophagy בתיווך יתרונות בריאות ולמניעת מחלות. ישנן מספר סמנים חלבוניים לצורך זיהוי של פעילות autophagy, כולל LC3 ו p62. LC3 (1A חלבון הקשורים microtubule / 1B-אור גהיין 3) הוא חלבון cytosolic (LC3-אני טופס) כי הוא מצומדות כדי PE (phosphatidylethanolamine) על אינדוקציה autophagy. PE-lipidated LC3 (טופס LC3-II) מגויס על ממברנות autophagosomal וניתן להשתמש בו כדי להמחיש autophagosomes כאשר שכותרתו עם GFP. טרנסלוקציה שלה מן cytosol כדי punctate מבנים של autophagosomes תחת מיקרוסקופ הוא אינדיקציה אינדוקציה autophagy. p62 הוא קולטן מטענים עבור מצעים autophagy (כגון חלבונים ubiquitination), והוא שולב autophagosomes גם כן. מאחר והחלבון נפגע lysosomes יחד עם autophagosomes, רבדיו ניתן להשתמש כדי למדוד את שטף autophagy. כאן אנו מראים כיצד להשתמש סמנים אלה לכמת autophagy ברקמות עכבר שונים המושרה על ידי פעילות גופנית אירובית, כולל פעילות גופנית כפויה (הליכון) ופעילות גופנית מרצון (ריצה גלגלים). אותו הנהלים יכולים לחול גם על in vivo מדידת autophagy לאחר הטיפול של מעוררים אחרים.

<table><tbody><tr><td>הליכון</td><td>קולומבוס מכשירים</td><td>150-RM Exer 3/6</td><td></td></tr><tr><td>גלגל ריצה עכבר</td><td>סופר פט</td><td></td><td>קוטר 100079365 11.4 ס"מ</td></tr><tr><td>מד מרחק</td><td></td><td>פעמון לוח מחוונים 100</td><td></td></tr><tr><td>משאבת מזרק</td><td>KD Scientific</td><td>KDS100</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>ניקון</td><td>דגם: מיקרוסקופ הפוך ECLIPSE</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM 1850UV</td><td></td></tr><tr><td>הומוגנייזר</td><td>IKA</td><td>003737001 / דגם: T10 Basic S1</td><td></td></tr><tr><td>Chloroquine</td><td>CAYMAN CHEMICAL COMPANY</td><td>14194</td><td></td></tr><tr><td>Parafolmaldehye</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P6148</td><td>נדרש ציוד הגנה אישי. מוצר זה עשוי לשחרר גז פורמלדהיד, כימיקל הידוע כגורם לסרטן.</td></tr><tr><td>מדיה הרכבה</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>p62 נוגדן</td><td>BD Biosciences</td><td>610833</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן LC3</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-2220</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הפעלת autophagy ידי פעילות גופנית אירובית בעכברים

Activating Autophagy by Aerobic Exercise in Mice

אוטופגיה היא מסלול פירוק ליזוזומלי החיוני להומאוסטזיס, תפקוד והתמיינות של תאים. בתנאי לחץ, אוטופגיה מושרית ומכוונת למטענים שונים, כגון ציטוזול בתפזורת, אברונים פגומים וחלבונים לא מקופלים, לפירוק בליזוזומים. מולקולות התזונה המתקבלות ממוחזרות בחזרה לציטוזול לצורך סינתזת חלבון חדשה וייצור ATP. להגברת האוטופגיה יש השפעות מועילות נגד פתוגנזה של מחלות רבות, ודווח על אסטרטגיות פרמקולוגיות ופיזיולוגיות להפעלת אוטופגיה. פעילות אירובית זוהתה לאחרונה כגורם יעיל לאוטופגיה באיברים מרובים בעכברים, כולל שרירים, כבד, לב ומוח. כאן אנו מראים נהלים לגרימת אוטופגיה in vivo על ידי תרגיל הליכון מאולץ או ריצת גלגלים מרצון. אנו גם מדגימים שיטות מיקרוסקופיות וביוכימיות לניתוח כמותי של רמות אוטופגיה ברקמות עכבר, תוך שימוש בחלבוני הסמן LC3 ו-p62 המועברים לליזוזומים ומתפרקים בהם יחד עם אוטופאגוזומים.

פרוטוקול זה מתאר שתי שיטות שונות כדי לגרום autophagy ברקמות עכבר על ידי פעילות אירובית: סך של 90 דקות של פעילות גופנית כפויה על הליכון רב-ליין ולפניו ימים של הסתגלות; או שבועות של פעילות גופנית מרצון על גלגל ריצה שמוצג עכברים חד שוכן. בכל פרוטוקול פעילות גופנית, אנו יכולים למדוד את השטף autophagy ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי וניתוח כתם המערבי באיברים שונים. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction...

Autophagy ההפעלה מועילה במניעת מספר מחלות. אחת הגישות הפיזיולוגיות לגרום autophagy in vivo הוא פעילות גופנית. כאן אנו מראים כיצד להפעיל autophagy ידי פעילות אירובית ולמדוד רמות autophagy בעכברים.

הפעלת Autophagy ידי פעילות גופנית אירובית בעכברים

Autophagy is a lysosomal degradation pathway essential for cell homeostasis, function and differentiation. Under stress conditions, autophagy is induced ...

המטרה הכללית של ניסוי זה היא להפעיל פיזיולוגית אוטופגיה בעכברים באמצעות ריצה כפויה או רצונית, ולאחר מכן למדוד את רמות האוטופגיה ברקמות ספציפיות. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח הנוגעות לאוטופגיה, ובמיוחד לאופן שבו אוטופגיה ופעילות תורמות להשפעות המיטיבות המתווכות על ידי פעילות אירובית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שפעילות גופנית מהווה דרך מהירה להשראת אוטופגיה in vivo באמצעות עכברים.עבור ניסוי זה, השתמשו בעכברי C57 black six בני שמונה עד שנים עשר שבועות, הנושאים גן טרנסגני לגילוי אוטופגיה המושרה על ידי פעילות גופנית in vivo, הידוע כ-GFP-LC3. לפרטים על השימוש במכשירי הליכה לעכברים, ראו את פרסום JoVE הבא. הגדירו את הגירוי החשמלי של מכשיר ההליכה לעוצמה נמוכה.בשני המפגשים הראשונים, הגשילו את העכברים להליכון פתוח בשיפייה של עשרה מעלות כלפי מעלה. ביום הראשון, הגשילו את העכברים למשך חמש דקות כאשר ההליכון פועל במהירות של שמונה מטרים לדקה. ביום השני, הגשילו את העכברים למשך עשר דקות, בתחילה במהירות של שמונה מטרים לדקה, ולאחר חמש דקות, הגבירו את המהירות לעשרה מטרים לדקה.ביום השלישי, הרצו את העכברים למשך 90 דקות מלאות. הפעילו את מסוע הריצה במהירות של 10 meters per minute ועודדו את העכברים לרוץ באמצעות דחיפות עדינות כדי למנוע הלמים חשמליים חוזרים בכפות הרגליים. קריטי להשגיח על העכ

activating-autophagy-by-aerobic-exercise-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מודגמת שיטה להערכת סיבולת פעילות גופנית בעכברי מעבדה ללא שימוש ברשת הלם. שיטה זו היא חידוד אנושי שיכול להפחית את ההשפעות המבלבלות של לחץ על פרמטרים ניסיוניים.

הערכה של Murine תרגיל סיבולת ללא השימוש ברשת הלם: אלטרנטיבי לתרגיל בכפייה

Autophagy פעיל קשורה התחדשות שריר פרודוקטיבי, אשר חיוני עבור תא גזע שריר (MuSC) ההפעלה. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לזיהוי באתרה של LC3, סמן autophagy ב MyocS חיובי Myocs של קטעים רקמות שריר מן שליטה ועכברים שנפגעו.

ב Situ Immunofluorescent מכתים של autophagy בתאי גזע שריר

אימון בעצימות גבוהה ב היפוקסיה הוא פרוטוקול כי הוכח לזירוז שעשוי להיות מועיל אצל חלק מהחולים וסקולרית עיבודים וכדי לשפר ספורטאים חזר על יכולת הריצה. כאן, אנו לבחון את הכדאיות של עכברים הדרכה באמצעות פרוטוקול, לזהות את אלה עיבודים לכלי הדם באמצעות ex-vivo הערכת תפקוד כלי הדם.

Supramaximal פעילות גופנית בעצימות ובשפתיים והערכת תפקוד כלי הדם בעכברים

קצר הפעלה (≤10 דקות) גבוה מרווח אימון אינטנסיביות (חבוט) מתגלה כאלטרנטיבה עוד שיטות התרגול, עדיין גרסאות קצרות רק לעתים נדירות הם עוצב במחקרים שנעשו בבעלי חיים. כאן, אנו מתארים ישמשו, 3 ימים בשבוע, הליכון במעלה הגבעה חבוט פרוטוקול זה מגביר את הביצוע הגופני אצל זכר, נקבה בגילאי עכברים.

הפעלה קצר בעוצמה גבוהה מרווח אימון והערכה הליכון בעכברים בגילאי

הליך זה מתאר מודל אימון התנגדות גלגל ריצה טעון פרוגרסיבי הניתן לתרגום בעכברים. היתרון העיקרי של מודל אימון התנגדות זה הוא שהוא התנדבותי לחלוטין, ובכך מפחית את הלחץ על בעלי החיים ואת העומס על החוקר.

דגם גלגל ריצה פשוט וזול לאימוני התנגדות פרוגרסיביים בעכברים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השראת האוטופגיה בגוף השומן של הזחל Drosophila melanogaster באמצעות דלדול חומרי מזון ומנתח שינויים באוטופגיה באמצעות זני זבובים טרנסגניים.

ניתוח אוטופגיה הנגרמת על ידי רעב בגוף השומן של הזחל Drosophila melanogaster

מאמר זה מציג את התגובות המורפומטריות ואת תוצאות ביצועי האימון של פרוטוקול אימון אינטרוולים בעצימות גבוהה (HIIT) במודל של חולדות Sprague-Dawley של השמנת יתר הנגרמת על ידי דיאטה. מטרת פרוטוקול זה הייתה למקסם את עצימות האימון ולקבוע את התגובות הפיזיולוגיות ל-HIIT בחולדות רזות והשמנות.

אימון אינטרוולים כרוני בעצימות גבוהה ומודל השמנת יתר הנגרמת על ידי דיאטה כדי למקסם את מאמץ הפעילות הגופנית ולגרום לשינויים פיזיולוגיים בחולדות

פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה להכנת ציוד אימון סטטי לעכברים. המכשיר שומר על התכווצות איזומטרית שרירים של גפיים של עכברים כדי לאמת את השפעת ההתערבות של פעילות גופנית מסורתית על סוכרת מסוג 2 (T2DM) ומספק טיפול גופני חדש לטיפול קליני בסוכרת סוג 2.

שיטת אימון כוח סטטית לעכברים סוכרתיים מסוג 2

וידאו זה מדגים גישה בסביבה מבוקרת ללמוד השפלה של רקמות הצמח lignocellulosic ידי פטריות אירובית. היכולת לשלוט במקורות מזין לחות היא יתרון המפתח של אגר, לחסום מיקרוקוסמוס, אך הגישה לרוב מניב הצלחה מעורבת. אנו כתובת החסרונות קריטי תשואה לשחזור, השתנות נמוך התוצאות.

אגר-Block מיקרוקוסמוס של פירוק רקמות הצמח מבוקרת על ידי פטריות אירובית

פרוטוקול זה מאפשר החוקרים התמקדו פעילות גופנית וספורט מדעי כדי לקבוע את התרומה היחסית של שלוש מערכות אנרגיה שונות הוצאות האנרגיה במהלך מגוון גדול של תרגילים.

לקבוע את התרומה של מערכות אנרגיה במהלך פעילות גופנית

חקור הפעלת אוטופגיה באמצעות פעילות גופנית אירובית בעכברים. שיטה זו מאפשרת למדוד רמות אוטופגיה ברקמות שונות ולהבין את הקשר בין התעמלות לבריאות תאית.

הפעלת Autophagy ידי פעילות גופנית אירובית בעכברים

גלה סרטונים נוספים