הפעלת Autophagy ידי פעילות גופנית אירובית בעכברים

Autophagy ההפעלה מועילה במניעת מספר מחלות. אחת הגישות הפיזיולוגיות לגרום autophagy in vivo הוא פעילות גופנית. כאן אנו מראים כיצד להפעיל autophagy ידי פעילות אירובית ולמדוד רמות autophagy בעכברים.

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להפעיל פיזיולוגית אוטופגיה בעכברים על ידי ריצה כפויה או רצונית, ולאחר מכן למדוד את רמות האוטופגיה ברקמות ספציפיות. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח לגבי אוטופגיה, בפרט כיצד אוטופגיה ופעולה תורמות להשפעות המועילות של פעילות אירובית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שפעילות גופנית היא נדנוד אירובי מהיר בין אוטופגיה in vivo באמצעות עכברים.

לניסוי זה, התחילו עם שישה עכברים שחורים C57 בני שמונה עד שנים-עשר שבועות, המכילים גן טרנס לזיהוי אוטופגיה המושרה על ידי פעילות גופנית, המכונה GFP-LC3. לפרטים על השימוש בהליכונים של עכברים, עיין בפרסום הבא של JoVE. הגדר את הגירוי החשמלי של ההליכון לעוצמה נמוכה.

בשני המפגשים הראשונים שלהם, התאקלמו העכברים להליכון פתוח של עשר מעלות במעלה הגבעה. ביום הראשון, תרגלו את העכברים במשך חמש דקות כשההליכון פועל במהירות של שמונה מטרים לדקה. ביום השני, הפעל את העכברים במשך עשר דקות, בתחילה בשמונה מטרים לדקה, ולאחר חמש דקות, הגביר את המהירות לעשרה מטרים לדקה.

ביום השלישי, הפעל את העכברים במשך 90 דקות מלאות. התחל את ההליכון במהירות של עשרה מטרים לדקה ועודד את העכברים לרוץ באמצעות דחיפות עדינות כדי למנוע זעזועים חוזרים ונשנים בכף הרגל. זה קריטי להתבונן ולתמרן את העכברים כדי שלא יקבלו יותר מדי מכות חשמל במהלך הריצה של 90 דקות.

במהלך הריצה, השתמש באצבעותיך כדי לעודד את העכברים להישאר על ההליכון. לאחר 40 דקות, 6הגדל את המהירות במטר אחד לדקה. לאחר 50 דקות, הגדל שוב את המהירות במטר אחד לדקה.

לאחר 60 דקות, הגדל את המהירות בעוד מטר לדקה. לאחר 70 דקות, התחל להגביר את המהירות כל חמש דקות כך שחמש הדקות האחרונות של הריצה של 90 דקות יהיו 17 מטר לדקה. לאחר סיום הניסוי, המתת חסד מיד של העכברים לאיסוף רקמות אם תרצה.

לצורך בדיקה זו, יש לשכן את העכברים בנפרד. השתמש באותו זן כפי שתואר קודם לכן. הכן גלגל ריצה של עכבר בקוטר 11.4 ס"מ עם מד מרחק אופניים מחובר.

כל סיבוב צריך למדוד 358 מילימטרים של נסיעה. העבר את העכבר לכלוב המכיל את הגלגל ואפשר לעכבר להשתמש בו בחופשיות במשך שבועיים. כל 24 שעות, רשום את המרחק שעובר העכבר ממד המרחק.

לאחר השבועיים, קצרו רקמות לניתוח לפי הצורך. כדי למדוד את השטף האוטופגי, יש לטפל בעכברים במעכב האוטופגיה, כלורוקווין, למשך שלושה ימים. ממיסים את הכלורוקווין ב-PBS בחמישה מיליגרם למיליליטר ומזריקים אותו לעכברים תוך צפקית במינון של 50 מיקרוגרם לגרם.

תנו לעכברים זריקה אחת ביום במשך שלושה ימים רצופים וקצרו רקמות שלוש שעות לאחר ההזרקה האחרונה. עבור עכברים המתאמנים בהליכון, התחילו את הריצה של 90 דקות 90 דקות לאחר ההזרקה ביום השלישי כך שהריצה תסתיים שלוש שעות לאחר ההזרקה. לאחר מכן המתת חסד של העכברים וקצור מיד את רקמותיהם.

התכוננו לשפע בעל חיים תוך 90 דקות מרגע האימון על ידי הכנת הקיבוע. טען מזרק של 30 מיליליטר עם 15 עד 20 מיליליטר של ארבעה אחוז פרפורמלדהיד טרי וחבר את המזרק עם מחט קטטר בגודל 20. חבר את משאבת המזרק הטעונה והגדר אותה ל-90 מיליליטר לשעה של זרימה רציפה.

כשהחיה על משטח עבודה נקי, במצב שכיבה, פתחו את חלל בית החזה דרך הסרעפת כדי לחשוף את הלב. כעת, הכנס את מחט הצנתר לחדר הימני. לאחר מכן, בצע חתך קטן בכבד כדי לנקז את הדם ולהפעיל את המשאבה.

הזריק את הקיבוע עד שהריאה והכבד מחווירים לחלוטין. בדרך כלל, 15 מיליליטר של קיבוע יספיקו. לאחר השפע, הסר את המחט ואסוף רקמות מעניינות.

כדי לאסוף את שרירי השלד, נתח את ה-vastus lateralis. משוך בקצרה את עור הרגל לאחור כדי לחשוף את השרירים ולמקם את שרירי הארבע ראשי. לאחר מכן, נתח את ה- vastus lateralis, שהוא השריר החיצוני המחובר לחלק העליון של עצם הירך.

לקיבוע והתייבשות נוספים, הניחו את הרקמות שנקטפו בארבעה אחוזים פרפורמלדהיד למשך 24 שעות בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, העבירו את הרקמות ל-15 אחוז סוכרוז PBS ותנו להן להשרות בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה או עד שהן מתייצבות בתמיסה. לאחר מכן, העבירו את הרקמות ל-30 אחוז סוכרוז PBS בארבע מעלות צלזיוס למשך לילה או יותר.

שמור את הטישו בחושך ככל האפשר במהלך אמבטיות אלה. לאחר מכן, הניחו את הרקמות במדיום הטבעה כגון OCT וחתכו אותן לחתיכות קטנות יותר במידת הצורך. לאחר מכן, הניחו להם להתאקלם מספר דקות בצלחת פטרי קטנה.

לאחר מכן, העבירו אותם לתבניות קריו-תבניות עם מספיק OCT לכיסוי. בתבניות, כוונו את משטחי החיתוך לכיוון התחתון והימנעו מהיווצרות בועות. לאחר מכן, הקפיאו את הדגימות במקרר קצף מכוסה מלא בקרח יבש עד שה-OCT הופך ללבן.

כעת, עטפו דגימות בודדות בנייר כסף מסומן, אטמו אותן בשקית ניילון ואחסנו אותן בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס עד שניתן יהיה לעבד אותן. באמצעות GFP שתויג LC3 כמערכת דיווח, נצפתה אינדוקציה אוטופגית בעכברים שתורגלו כמתואר. לאחר גירוי אוטופגיה, LC3 עבר מהציטוזול לאוטופאגוזום במבנים מנוקדים.

לעכברים מתאמנים היו הרבה יותר פונקטה GFP-LC3 הן בשרירי השלד והן בקליפת המוח בהשוואה לעכברים במצב מנוחה. ניתוח כתמים מערביים באמצעות נוגדן LC3 הראה כי פעילות גופנית גרמה באופן משמעותי ליצירת LC3-II מצומד ליפיד, מה שמצביע על כך שהייתה המרה מוגברת של LC3-I ציטוזולי ל-LC3-II. לאחר מכן, נמדדה הפירוק של קולטן המטען האוטופגי, עמ' 62.

90 דקות של פעילות הליכון גרמו לפירוק גבוה יותר של p62 בשרירי השלד מאשר במצב מנוחה. השפעה זו ניצלה על ידי הזרקת כלורוקווין לפני האימון. מכיוון שכלורוקווין הוא מעכב של פירוק ליזוזומלי, נתונים אלה מצביעים על כך שהתופעות שנצפו נובעות משטף אוטופוגגי מוגבר ולא מחסימה בפירוק האוטופאגוזום.

לאחר פיתוחה, לטכניקה זו היו קודמים בתחום האוטופגיה כדי לחקור את ההשפעות על מנגנון הפעילות הגופנית בהתדרדרות חילוף החומרים והתנהגויות של בעלי חיים. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לעקוב אחר העכברים בזמן שהם רצים. בעקבות הליך זה, השיטות כמו מיקרוסקופיה חשמלית.

ניתן לבצע מיקרוסקופיה של בעלי חיים על מנת לענות על שאלות נוספות כמו פעילות גופנית במסלולי אוטופגיה נבחרים, כגון מיטופגיה וליפופגיה.