ניטור אסטרוציט תגובתיות התפשטות במבחנה בתנאים כמו איסכמי
21 באוקטובר 2017
שבץ איסכמי הוא אירוע מורכב שבו התרומה ספציפי של האסטרוציטים לאזור במוח המושפעים נחשפים גלוקוז חוסר חמצן (OGD) הוא קשה ללמוד. מאמר זה מציג מתודולוגיה להשיג האסטרוציטים מבודד וללמוד שלהם תגובתיות והתפשטות בתנאים OGD.
הפרוטוקול הבא נועד להראות את הבידוד של אסטרוציטים ראשוניים ממוחות של חולדות גורים כדי לבצע מחסור בחמצן גלוקוז או OGD. חשיפה של אסטרוציטים מטוהרים, לסביבה נטולת גלוקוז חמצן היא מודול המאפשר לנו לבדוק את התגובה לחלק מהמצבים המצויים בשבץ איסכמי. ניתן לצפות ולמדוד שינויים שיטתיים, לאחר חשיפה למחסור בחמצן גלוקוז, באמצעות סמני אסטרוציטים סלקטיביים כגון GFAP.
לסיכום, תאים מבודדים אלה שנחשפו לתנאים דמויי איסכמיה יכולים לשמש לבדיקת דרכי חלקים חדשות המופעלות במצבים היפוקסיים ותרופות אחרות המגנות מפני שבץ איסכמי. בחלק זה של הפרוטוקול אסטרוציטים יבודדו מקליפת המוח של חולדות גורים. מטרת הליך זה היא להשיג תרבית תאים אסטרוציטית ראשונית לביצוע ניסויים במניעת גלוקוז בחמצן.
החומרים להליך זה הם הבאים, חיטוי כל החומרים לפני השימוש בהם בהליך זה. וחשוף את מכסה המנוע לפחות 20 דקות של נורות UV לפני תחילת הפרוטוקול. כדי להתחיל בהליך זה, פיזר שלושה עד חמישה מיליליטר של מדיה DME שלמה בכל צלחת.
הוא יחולק באופן הבא, אחד לכל מוח של עכבר, שניים לכל קליפות המוח, ושלושה לכל קליפות המוח ללא קרומי המוח. ערפו את ראשו של גור לאחר חיטוי עם אתנול 70%. בצע חתך החל מהחלק האחורי של הראש לכיוון האף.
הסר את הגולגולת בעזרת מלקחיים מעוקלים וגרד בעדינות את המוח הקטן וחושף את קליפת המוח. הסירו את המוחות החשופים בעזרת פינצטה והניחו את המוח בצלחת הפטרי הראשונה עם מדיה. חזור על שלבים אלה עבור כל הגורים האחרים.
הפרד את חצאי המוח על ידי חלוקה עדינה לאורך סדק קו האמצע עם הקצה החד של מלקחיים המיקרו לניתוח. מקלפים את קליפת המוח על ידי הסרת החומר הלבן וההיפוקמפוס באמצעות הפינצטה בתנועת צביטה, ומשאירים אותם מאחור. מעבירים את קליפות הקליפה לצלחת הפטרי המסומנת מספר שתיים.
חזור על ההליך עבור כל המוחות המשלבים את כל קליפות המוח המנותחות בצלחת הפטרי. מנערים בעדינות את המנה כדי להפיץ באופן שווה את המדיה בין כל קליפות העץ. השתמש במיקרוסקופ דיסקציה כדי לזהות את קרומי המוח המצפים את קליפת המוח הקלופה.
קרומי המוח הם שכבה שקופה דקה מאוד שניתן לזהות על ידי חיפוש הנימים האדומים הקטנים המקיפים את הרקמה. בדוק והסר בזהירות את קרומי המוח המרפדים את קליפת המוח וקילף אותם בעדינות מהאונות הבודדות בקליפת המוח באמצעות פינצטה עדינה משני צידי כל קליפת המוח. מניחים את הקליפות הנקיות בצלחת פטרי חדשה המסומנת מספר שלוש.
לפירוק רקמות בשיטת הקיבה או הבלנדר, שפכו את הקליפות הנקיות והקלופות ואת המדיה מצלחת הפטרי לשקית בלנדר סטרילית. והוסף מספיק מדיה כדי להביא את הנפח הכולל של השקית לחמישה מיליליטר. הכניסו את השקית לבטן 80 והשאירו כשני סנטימטרים מהשקית גלויים מעל הדלת הסגורה.
דיסוציאציה של תאים במכשיר זה נעשית לאחר 2.5 דקות במהירות גבוהה. לחלופין, ניתן לבצע דיסוציאציה של רקמות על ידי סגירת השקית הסטרילית וחבטה עדינה של הרקמה עם במכסה המנוע עד שחלקיקי הרקמה הופכים לתרחיף עדין. הקפד להשתמש במטלית בין השקית לכוס כדי למנוע חיכוך ושבירת השקית.
שופכים את מתלה התאים למרכז השרוול עם רשת מספר 60. יוצקים את התאים המסוננים לאמצע רשת מספר 100 ומאפשרים לה לסנן לפי כוח הכבידה. שופכים את מתלה התאים המסונן לצינור חרוטי של 15 מיליליטר.
פוגה מרכזית את מתלה התא ב-200 פעמים G בפוגה מרכזית, רצוי עם נתב דלי נדנדה למשך חמש דקות. הסר את הסופרנטנט והשליך בכוס. הוסף מדיה חדשה מלאה ללוח התאים.
שימוש בפיפט סרולוגי השהה ונתק את פלטת התאים במקסימום חמישה מיליליטר של מדיום. יש להוסיף את הכמות הרצויה של תרחיף תאים על בקבוק ולהשלים עם מדיה. הוסף את הפלטה התלויה לבקבוק עם מדיום.
מחלקים תאים באופן שווה בכל הבקבוק ומניחים אותם בחממה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. זכור להחליף את המדיה כל שלושה ימים. המתודולוגיה הבאה נועדה למנוע מהתאים חמצן וגלוקוז בסביבה מבוקרת.
מטרת המודל הזה היא לחקור את התגובה של אסטרוציטים במצב שבץ איסכמי. החומרים המשמשים להליך זה הם, נקה את המדיום נטול הגלוקוז על ידי החדרת צינור סרולוגי המחובר למערכת הגז. מבעבעים את התמיסה עם תערובת הגז למשך 10 דקות בזרימה של 10 עד 15 ליטר לדקה.
לאחר סיום 10 הדקות, התאם את ה-pH של מדיום ה-OGD ל-7.4. סנן את המדיום נטול הגלוקוז המטוהר באמצעות מערכת סינון הצינורות של 50 מיליליטר. חשוב תמיד להכין מדיום OGD טרי לכל ניסוי.
זה יבטיח שהמדיום יטוהר מחמצן. הסר את מצע האסטרוציטים ושטוף עם PBS סלולרי פעמיים כדי להסיר גלוקוז מהתאים. הוסף את מדיום ה- OGD לבארות.
מניחים את צלחת הרב-באר עם מכסה פתוח בתוך תא ההיפוקסיה. חבר את תערובת הגז לשסתום הכניסה והשאיר את שסתום היציאה פתוח. יש לשטוף את החדר בתערובת הגז בטמפרטורה של 10 עד 15 ליטר לדקה, למשך חמש עד שבע דקות.
עצור את זרימת הגז וסגור תחילה את המהדק על שסתום היציאה. לאחר מכן, סגור את המהדק על צינור שסתום כניסת הגז. הנח את החדר ההיפוקסי בחממת תרבית התאים ב-37 מעלות צלזיוס למשך הזמן הרצוי ב-OGD.
לאחר סיום זמן הדגירה, שאפו את אמצעי ה-OGD והוסיפו בזהירות DMEM מלא לתאים למצב הנורמוקסי. החזר את התאים לחממת התרבות למשך אפס 24 ו -48 שעות של תנאים נורמוקסיים. פרוטוקול זה מתאר בידוד של אסטרוציטים מקליפת המוח של חולדות יילודים.
לאחר אימות טוהר התרביות הראשוניות בוצעו ניסויי OGD. במודל איסכמי זה, מחסור בגלוקוז וחמצן גרם לשינוי פולוגי יותר שנוטר על ידי האימונופלואורסצנציה באמצעות סמנים אסטרוציטים כגון GFAP או סמני התפשטות כגון PCNA. אחד היתרונות של המודל הזה הוא שהוא מאפשר לנו לחקור תגובה ספציפית של סוג תא.
למרות שהמגבלה בטכניקה זו היא היעדר אינטראקציה בין תא לתא עקב בידוד אסטרוציטים. אחת הדרכים האפשריות להתגבר על מגבלה זו היא לחשוף אסטרוציטים למצע תנאי מסוגי תאים אחרים או מתרבית משותפת. לסיכום, שיטת מניעת הגלוקוז בחמצן במערכת תאים מבודדת, מאפשרת לנו לבדוק ישירות את ההשפעות של מולקולות הגנה עצביות או נוירוטוקסיות שונות.
כמו כן, זהו כלי תקף לחקר ביולוגיה של אסטרוציטים. לבסוף, מודל זה מניח בסיס חזק לחקר תרופות התפתחותיות בתנאי ניסוי באמצעות מודלים in vivo.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לבידוד אסטרוציטים ראשוניים ממוחות של גורי חולדה, במטרה לחקור את תגובתם למחסור בחמצן ובגלוקוז (OGD), מצב המדמה שבץ איסכמי. המתודולוגיה מאפשרת לחוקרים להבחין בשינויים ברקטיביות ובשגשוג של האסטרוציטים תחת תנאי OGD.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- מחקר שבץ מוחי
רקע
- שבץ איסכמי כרוך בתגובות תאיות מורכבות.
- אסטרוציטים ממלאים תפקיד מכריע בפגיעה מוחית ובהחלמה.
- חקר של אסטרוציטים בתנאי OGD עשוי לחשוף תובנות חשובות.
- סממנים סלקטיביים כגון GFAP משמשים להערכת שינויים באסטרוציטים.
מטרת המחקר
- לבידוד אסטרוציטים ראשוניים לצורך ניתוח ניסיוני.
- לבדיקת התנהגות אסטרוציטים תחת תנאים דמויי איסכמיה.
- לבחינת תרופות מגנות פוטנציאליות נגד שבץ איסכמי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד של אסטרוציטים ראשוניים מקורטקס של חולדות גורים.
- חשיפת אסטרוציטים למחסור בחמצן ובגלוקוז.
- מדידת תגובתיות של אסטרוציטים באמצעות סמני GFAP.
- הערכת תגובות תאיות לתנאים היפוקסיים.
תוצאות עיקריות
- אסטרוציטים מבודדים מראים שינויים מדידים תחת OGD.
- סמני GFAP מעידים על הפעלת אסטרוציטים.
- ניתן לזהות מסלולים פוטנציאליים המופעלים בתגובה להיפוקסיה.
- התוצאות עשויות לספק מידע לאסטרטגיות טיפוליות לשבץ איסכמי.
מסקנות
- הפרוטוקול מספק שיטה מהימנה לבידוד אסטרוציטים.
- הבנת תגובות האסטרוציטים יכולה לסייע במחקר על שבץ מוחי.
- מחקרים עתידיים יכולים לבחון את יעילותן של תרופות בהגנה על אסטרוציטים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
תגובתיות ושגשוג של אסטרוציטים תחת תנאים דמויי איסכמיה הם קריטיים להבנת המנגנונים התאיים המניעים פגיעה מוחית וריפוי בעקבות שבץ. מודל in vitro זה של OGD מאפשר בחינה מדויקת של תגובות ספציפיות לאסטרוציטים, ובכך תומך בביטחון חיזוי בתיקוף מוקדם של מטרות לנוירופרוטקציה. גישה זו מסייעת לקידום מותאם-סיכונים של מועמדים לנוירו-תרפיה על ידי בידוד של מסלולים המונעים על ידי אסטרוציטים והשפעות של גורמים ממיסים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הפחתת סיכונים מנגשונית על ידי בידוד תגובות של אסטרוציטים ללחץ איסכמי.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות ניתוח כמותי של סמני GFAP ו-PCNA.
- מסייע בחקירת מסלולים עבור סריקת תרכובות נוירופרוטקטיביות או נוירוטוקסיות.
- מספק מערכת מבוקרת להערכה מונחית-השערה של ביולוגיית האסטרוציטים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מודלים מאומתים וניתנים לשחזור in vitro לסריקת תרכובות תחת תנאי OGD.
- מנרמל קריאות כמותיות של תגובתיות ופרוליפרציה של אסטרוציטים לצורך פיתוח בדיקות.
- מאפשר איסוף של מדיה מותנית באסטרוציטים עבור בדיקות נוירונליות המשך.
- תומך ביכולת הרחבה ובשימוש חוזר בפלטפורמה בתוכניות של נוירו-דלקת ונוירו-הגנה.
מחקר תרגומי וטרום-קליני
- מתאימה ממצאים in vitro למנגנונים איסכמיים הרלוונטיים למחלה שנצפו in vivo.
- מאפשרת חקר של ביומרקרים תרגומיים באמצעות ניתוח גורמים מסיסים מתרביות של אסטרוציטים.
- תומכת ברצף מהשלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני של אסטרטגיות לנוירופרוטקציה.
- מספקת הפחתת סיכונים חזויה לבחירת מועמדים לפני מחקרים בבעלי חיים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד (Pipeline)
מודל אסטרוציטים זה, המבוסס על OGD, משתלב ברצף שבין גילוי למחקר פרה-קליני, ומגשר בין מחקרים מכניסטיים מוקדמים למחקר תרגומי בתחומי השבץ והנוירופרוטקציה.
- ביולוגיה של גילוי: מסייעת בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים במערכות מבודדות של אסטרוציטים.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור להערכת תרכובות תחת עקה דמוית איסכמיה.
- אנליזה: מאפשרת מדידה של GFAP, PCNA וגורמים ממיסים לצורך ניתוח השוואתי בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין תגובות אסטרוציטים in vitro לבין תוצאים תפקודיים ובומארקרים in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר עבור צינורות מו"פ של נוירו-דלקת והגנה עצבית.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בגילוי תרופות נוירו-תרפויטיות.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והסקילביליות של בדיקות רלוונטיות לאיסכמיה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות לגבי המשך הפיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון על ידי מתן אפשרות להפחתת סיכונים ביולוגית מוקדמת.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של מועמדים לנוירו-פרוטקציה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בבידוד תאי מקור ובמידול היפוקסיה in vitro.
- דורש גישה לתאי היפוקסיה, למערכות בקרת גזים ולניתוחי אימונופלואורסצנציה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרמטרי חשיפה ל-OGD וכימות סמנים.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור מינים שונים או אזורי מוח שונים, בהתאם לצרכי תיק הפרויקטים.
- מוגבל בשל היעדר אינטראקציות בין-תאיות; ייתכן שיידרשו גישות של תרבית משותפת (co-culture) או שימוש במדיום מותנה (conditioned media) להשגת רלוונטיות תרגומית רחבה יותר.
