Name: ניטור אסטרוציט תגובתיות התפשטות במבחנה בתנאים כמו איסכמי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 8 s
Description: למדו את פרוטוקול הבידוד של אסטרוציטים ראשוניים ממוחות גורי חולדות לבחינת תגובתיות התפשטות בתנאי חסר חמצן וגלוקוז. שיטה זו מאפשרת למחקרי מוח לחקור שינויים ב-GFAP ולפתח תרופות להגנה על מוח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצה להודות Paola לופס Pieraldi לסיוע טכני. A.H.M. הוא אסיר תודה עבור מענקים 8G12MD007600 ו- U54-NS083924 נתמך בפרסום זה. אנו מודים NIH-NIMHD-G12-MD007583 גרנט על התמיכה מתקן. D.E.R.A. הוא אסיר תודה על האחווה שסופקו על-ידי-NIHNIGMS-R25GM110513. אנחנו אסירי תודה על השימוש באזור מכשור המשותף ולהעניק הסיוע של ד ר Priscila Sanabria עבור השימוש במתקן הדמיה אופטית של התוכנית RCMI על ידי G12MD007583. בנוסף, אנו רוצים להודות חוסה פאדילה על תפקידו מצטיינים צילום ועריכה פרוטוקול חזותי.

<ol><li>Goldstein, L. B., Bertels, C., Davis, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrater+reliability+of+the+NIH+stroke+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Neurol%22%5BJournal%5D)">Interrater reliability of the NIH stroke scale.</a> Arch Neurol. 46 (6), 660-662 (1989).</li>
<li>Hinkle, J. L., Guanci, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+ischemic+stroke+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Nurs%22%5BJournal%5D)">Acute ischemic stroke review.</a> J Neurosci Nurs. 39 (5), 285-293 (2007).</li>
<li>Kassner, A., Merali, Z. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26463696">Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke.</a> Stroke. 46 (11), 3310-3315 (2015).</li>
<li>Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+science+of+stroke%3A+mechanisms+in+search+of+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The science of stroke: mechanisms in search of treatments.</a> Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).</li>
<li>Ben Haim, L., Carrillo-de Sauvage, M. A., Ceyzeriat, K., Escartin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elusive+roles+for+reactive+astrocytes+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Elusive roles for reactive astrocytes in neurodegenerative diseases.</a> Front Cell Neurosci. 9, 278(2015).</li>
<li>Broderick, J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/labs/articles/17938297/">Guidelines for the Management of Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Adults 2007 Update: A Guideline From the American Heart Association/American Stroke Association Stroke Council, High Blood Pressure Research Council, and the Quality of Care and Outcomes in Research Interdisciplinary Working Group: The American Academy of Neurology affirms the value of this guideline as an educational tool for neurologists.</a> Stroke. 38 (6), 2001-2023 (2007).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen-glucose+deprivation+induced+glial+scar-like+change+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oxygen-glucose deprivation induced glial scar-like change in astrocytes.</a> PLoS One. 7 (5), e37574(2012).</li>
<li>Sofroniew, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+astrocytes+in+neural+repair+and+protection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">Reactive astrocytes in neural repair and protection.</a> The Neuroscientist. 11 (5), 400-407 (2005).</li>
<li>Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes%3A+biology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Astrocytes: biology and pathology.</a> Acta neuropathologica. 119 (1), 7-35 (2010).</li>
<li>Souza, D. G., Bellaver, B., Souza, D. O., Quincozes-Santos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+adult+rat+astrocyte+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of adult rat astrocyte cultures.</a> PLoS One. 8 (3), e60282(2013).</li>
<li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HB-EGF+affects+astrocyte+morphology%2C+proliferation%2C+differentiation%2C+and+the+expression+of+intermediate+filament+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins.</a> J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).</li>
<li>Robinson, C., Apgar, C., Shapiro, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+Hypertrophy+Contributes+to+Aberrant+Neurogenesis+after+Traumatic+Brain+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Plast%22%5BJournal%5D)">Astrocyte Hypertrophy Contributes to Aberrant Neurogenesis after Traumatic Brain Injury.</a> Neural Plast. , 1347987(2016).</li>
<li>Brekke, E., Berger, H. R., Wideroe, M., Sonnewald, U., Morken, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+and+Intermediary+Metabolism+and+Astrocyte-Neuron+Interactions+Following+Neonatal+Hypoxia-Ischemia+in+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Glucose and Intermediary Metabolism and Astrocyte-Neuron Interactions Following Neonatal Hypoxia-Ischemia in Rat.</a> Neurochem Res. , (2016).</li>
<li>Cekanaviciute, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+transforming+growth+factor-beta+signaling+reduces+subacute+neuroinflammation+after+stroke+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Astrocytic transforming growth factor-beta signaling reduces subacute neuroinflammation after stroke in mice.</a> Glia. 62 (8), 1227-1240 (2014).</li>
<li>Zhu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+cell+cycle+progression+reduces+reactive+astrogliosis+initiated+by+scratch+injury+in+vitro+and+by+cerebral+ischemia+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Inhibiting cell cycle progression reduces reactive astrogliosis initiated by scratch injury in vitro and by cerebral ischemia in vivo.</a> Glia. 55 (5), 546-558 (2007).</li>
<li>Bovolenta, P., Wandosell, F., Nieto-Sampedro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurite+outgrowth+over+resting+and+reactive+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Restor+Neurol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurite outgrowth over resting and reactive astrocytes.</a> Restor Neurol Neurosci. 2 (4), 221-228 (1991).</li>
<li>Anderson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+scar+formation+aids+central+nervous+system+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Astrocyte scar formation aids central nervous system axon regeneration.</a> Nature. 532 (7598), 195-200 (2016).</li>
<li>Hao, C., Richardson, A., Fedoroff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-like+cells+originate+from+neuroepithelium+in+culture%3A+characterization+and+properties+of+the+macrophage-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Macrophage-like cells originate from neuroepithelium in culture: characterization and properties of the macrophage-like cells.</a> Int J Dev Neurosci. 9 (1), 1-14 (1991).</li>
<li>Saura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+cells+in+astroglial+cultures%3A+a+cautionary+note%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Microglial cells in astroglial cultures: a cautionary note.</a> J Neuroinflammation. 4, 26(2007).</li>
<li>Giulian, D., Baker, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+ameboid+microglia+isolated+from+developing+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Characterization of ameboid microglia isolated from developing mammalian brain.</a> J Neurosci. 6 (8), 2163-2178 (1986).</li>
<li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> J Vis Exp. (71), (2013).</li>
<li>Armstrong, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+immature+oligodendrocyte+lineage+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of immature oligodendrocyte lineage cells.</a> Methods. 16 (3), 282-292 (1998).</li>
<li>McCarthy, K. D., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+separate+astroglial+and+oligodendroglial+cell+cultures+from+rat+cerebral+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue.</a> J Cell Biol. 85 (3), 890-902 (1980).</li>
<li>Pont-Lezica, L., Colasse, S., Bessis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+microglia+from+primary+cellular+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Depletion of microglia from primary cellular cultures.</a> Methods Mol Biol. 1041, 55-61 (2013).</li>
<li>Svensson, M., Aldskogius, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+density+of+axotomized+hypoglossal+motorneurons+following+pharmacological+blockade+of+the+microglial+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Synaptic density of axotomized hypoglossal motorneurons following pharmacological blockade of the microglial cell proliferation.</a> Exp Neurol. 120 (1), 123-131 (1993).</li>
<li>Wong, V. K., Shapourifar-Tehrani, S., Kitada, S., Choo, P. H., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+rabbit+ocular+fibroblast+proliferation+by+5-fluorouracil+and+cytosine+arabinoside%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ocul+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of rabbit ocular fibroblast proliferation by 5-fluorouracil and cytosine arabinoside.</a> J Ocul Pharmacol. 7 (1), 27-39 (1991).</li>
<li>Nakatsuji, Y., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Density+dependent+modulation+of+cell+cycle+protein+expression+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Density dependent modulation of cell cycle protein expression in astrocytes.</a> J Neurosci Res. 66 (3), 487-496 (2001).</li>
<li>Reeves, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+amino+acids+by+lysosomes+incubated+with+amino+acid+methyl+esters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Accumulation of amino acids by lysosomes incubated with amino acid methyl esters.</a> J Biol Chem. 254 (18), 8914-8921 (1979).</li>
<li>Thiele, D. L., Kurosaka, M., Lipsky, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+of+the+accessory+cell+necessary+for+mitogen-stimulated+T+and+B+cell+responses+in+human+peripheral+blood%3A+delineation+by+its+sensitivity+to+the+lysosomotropic+agent%2C+L-leucine+methyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Phenotype of the accessory cell necessary for mitogen-stimulated T and B cell responses in human peripheral blood: delineation by its sensitivity to the lysosomotropic agent, L-leucine methyl ester.</a> J Immunol. 131 (5), 2282-2290 (1983).</li>
<li>Hamby, M. E., Uliasz, T. F., Hewett, S. J., Hewett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+improved+procedure+for+the+removal+of+microglia+from+confluent+monolayers+of+primary+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of an improved procedure for the removal of microglia from confluent monolayers of primary astrocytes.</a> J Neurosci Methods. 150 (1), 128-137 (2006).</li>
<li>Corvalan, V., Cole, R., de Vellis, J., Hagiwara, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+modulation+of+calcium+channel+activity+in+cultured+rat+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neuronal modulation of calcium channel activity in cultured rat astrocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (11), 4345-4348 (1990).</li>
<li>Butler, I. B., Schoonen, M. A., Rickard, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+dissolved+oxygen+from+water%3A+A+comparison+of+four+common+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Removal of dissolved oxygen from water: A comparison of four common techniques.</a> Talanta. 41 (2), 211-215 (1994).</li>
<li>Tasca, C. I., Dal-Cim, T., Cimarosti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+oxygen-glucose+deprivation+to+study+ischemic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro oxygen-glucose deprivation to study ischemic cell death.</a> Methods Mol Biol. 1254, 197-210 (2015).</li>
<li>Wu, D., Yotnda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+testing+of+hypoxia+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction and testing of hypoxia in cell culture.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Rivera-Aponte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycemia+reduces+functional+expression+of+astrocytic+Kir4.+1+channels+and+glial+glutamate+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hyperglycemia reduces functional expression of astrocytic Kir4. 1 channels and glial glutamate uptake.</a> Neuroscience. 310, 216-223 (2015).</li>
<li>Berger, R., Garnier, Y., Pfeiffer, D., Jensen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharides+do+not+alter+metabolic+disturbances+in+hippocampal+slices+of+fetal+guinea+pigs+after+oxygen-glucose+deprivation%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+research%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharides do not alter metabolic disturbances in hippocampal slices of fetal guinea pigs after oxygen-glucose deprivation.</a> Pediatric research. 48 (4), 531-535 (2000).</li>
<li>Anderson, T. R., Jarvis, C. R., Biedermann, A. J., Molnar, C., Andrew, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+the+anoxic+depolarization+protects+without+functional+compromise+following+simulated+stroke+in+cortical+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Blocking the anoxic depolarization protects without functional compromise following simulated stroke in cortical brain slices.</a> Journal of neurophysiology. 93 (2), 963-979 (2005).</li>
<li>Jarvis, C. R., Anderson, T. R., Andrew, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anoxic+depolarization+mediates+acute+damage+independent+of+glutamate+in+neocortical+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Anoxic depolarization mediates acute damage independent of glutamate in neocortical brain slices.</a> Cerebral Cortex. 11 (3), 249-259 (2001).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר את ניתוקה של האסטרוציטים מן החולדה cortices. בשיטה זו, חיוני כדי להקטין זיהום עם סוגי הסלולר אחרים כגון מיקרוגלייה, oligodendrocytes להפוך fibroblasts. כדי לצמצם את מספר מיקרוגלייה, ניתן לנקוט בכמה צעדים: לשנות את המדיה מסלולית רועדת, טיפולים כימיים. ברגע טוהר התרבות הוא אישר immunofluorescence באמצעות סמנים הסלולר סלקטיבית או מזהמים הבולטים של התא, ניתן לבצע ניסויים. למשל, נוגדן נגד סידן מיונן מחייבת מתאם מולקולה 1 (רשות השידור-1) יכול לשמש כדי לזהות מיקרוגלייה. המוות עצביים מתחיל בשלב מוקדם של התרבות ה...

קו מוגדר כ- "חריפה נוירולוגיות בתפקוד כלי דם המקור עם התפתחות מהירה או פתאומית של תסמינים וסימנים, התואם מעורבותם של תחומי פעילות במוח"1,2. ישנם שני סוגים של שבץ: hemorrhagic, איסכמי. כאשר תפקוד כלי הדם נגרמת על-ידי מפרצת או תקלה עורקית, מלווה בהיחלשות עם קרע אחורי של עורק, זה נקרא שבץ מדמם3 אשר, ברוב המקרים, מובילה למוות. כאשר כגון או תסחיף מונעת זרימת הדם, גורם זמני מניעת חמצן, גלוקוז לאזור במוח, זה נקרא שבץ איסכמי4. כשל לטפח תאים סביב האזור הנגוע או מוביל איסכמי הליבה איזון homeostatic וחילוף, תפקוד אנרגטי, מוות עצביים ו דלקת5, אשר יכול לגרום נכות לכל החיים עבור חולים6.
שבץ איסכמי הוא פגיעה multifactorial המערבים מספר סוגים של תאים להגיב ולהפעיל את ההשפעות שלהם בנקודות זמן שונות. אינטראקציות רבות ליצור סביבה קשה ללמוד את אופן הפעולה של תאים בודדים. ? אז, איך לומדים את התרומה של סוג תא מסוים תחת סביבה מורכבת? מודל מקובל במבחנה של איסכמיה מורכב של חשיפת תאים כדי מניעת חמצן, גלוקוז (OGD), במשך תקופה מסוימת, ואחריו את השחזור של תאים normoxic לסביבה. מערכת זו מדמה של שבץ איסכמי ואחריו פגיעה reperfusion דם. בשיטה זו, תאים או רקמות נחשפים בתקשורת ללא גלוקוז בסביבה ללא חמצן, באמצעות תא ובשפתיים מיוחדים. זמן הדגירה OGD יכול להשתנות בין מספר דקות עד 24 h, בהתאם ההיפותזה רוצה להיבדק. מחקרים הראו כי בהתאם הזמנים של OGD, normoxic הסביבה, פנוטיפים ספציפי של שבץ (קרי, חריפה או subchronic) יכולה להיות מושגת. ראשי האסטרוציטים מבודד, נחשפים OGD עם שיקום האחורי לתנאים normoxic, הוא מודל הסלולר למד היטב כדי לחקות קו במבחנה7. שימוש OGD אפשרי לחשוף את המנגנונים המולקולריים עצמאית של תאים בודד תחת סביבה דמויי שבץ.
הידע שלנו על ביולוגיה אסטרוציט גודלת, זה הפך ברור כי הם חיוניים עבור שמירה על הסינפסות ומנחם תיקון, ופיתוח פלסטיות עצבית8. בתנאים רגילים, האסטרוציטים לשחרר ולהגיב ציטוקינים, נוגדנים, גורמי גדילה, gliotransmitters, שמירה על איזון מטבולי, הומאוסטזיס בתוך הסינפסות5,9. ב- neuroinflammation חריפה, כגון שבץ איסכמי, תאים אלה יכולים להפוך תגובתי, להראות ביטוי ארוכות טווח של גליה Fibrillary חומצי חלבון (GFAP) ולהציג היפרטרופיה שלהם מורפולוגיה5,10, 11 , 12. כמו אירוע איסכמי מתפתח, הומאוסטזיס שסופקו על-ידי האסטרוציטים הופך להיות מושפעת, לגבי ספיגת גלוטמט נורמלי, חילוף החומרים האנרגיה, חילופי מולקולות פעילים, נוגד חמצון פעילות13.
האסטרוציטים שהופעלה מחדש להתרבות סביב הרקמה לאוטם בזמן לויקוציטים נודדים לכיוון אזור lesioned14. תפוצת astrocytic ניתן למדוד באמצעות סמנים כגון מתרבים תאים גרעיניים אנטיגן (PCNA), Ki67 ו- bromodeoxyuridine (BrdU)15. תגובה proliferative זו נוצרת באופן תלוי-זמן והיא מסייעת ויוצרים את הצלקת גליה, מערך האסטרוציטים בלתי הפיך תגובתי לאורך parenchyma של אתר פגום אחרי הפציעה9. אחת מהפונקציות הראשונית של הצלקת הזאת היא להגביל את extravasation תא החיסון מהאזור הזה. עם זאת, מחקרים הראו כי הצלקת הופך ליקוי פיזי עבור אקסונים להרחיב, כפי הם משחררים מולקולות מעכבות את הצמיחה עצב, וליצור מכשול פיסי מניעת אקסונים הארכת סביב האזור הפגוע ה-16. עם זאת, יש ראיות מדעיות מראה כי לאחר פציעה בחוט השדרה, לגמרי מניעת היווצרות צלקת גליה עלול לפגום לרגנרציה של אקסונים17. לפיכך, ההקשר שבו נמדד התגובה astrocytic ספציפי, יש לקחת בחשבון על המסגרת של הפגיעה למד.
המתודולוגיה שהוצגו יכול להיות מיושם בו הפונקציה תגובותיהם של האסטרוציטים לאחר חוסר חמצן גלוקוזה, שניתן יהיה לשנותה בהתאם השאלות החוקר רוצה לענות. לדוגמה, מלבד שינוי מורפולוגי, את סמני הביע בזמנים שונים, OGD, supernatants מן האסטרוציטים נחשפים OGD ניתן עוד לנתח כדי לזהות גורמים מסיסים שפורסמו על ידי תאים אלה, או משתמשת באמצעי התקשורת ממוזגים להעריך שלה אפקט בתאים אחרים במוח. גישה זו מאפשרת מחקרים על תגובתיות אסטרוציט העלולה להוביל הבהרה של הגורמים ותקנות לווסת את תגובתם בתרחיש של שבץ איסכמי.

<table><tbody><tr><td><מכשירים חזקים>לניתוח - שלב 1</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מספריים ניתוחים 5.5 אינץ'</td><td>חברת רובוז</td><td>RS-6812</td><td>כלים המשמשים לעריפת ראשי החולדות.</td></tr><tr><td>מלקחיים מעוקלים 7 אינץ' &nbsp;</td><td>חברת Roboz</td><td>RS-5271</td><td>מחזיק את עור החולדה בזמן הסרת הגולגולת.</td></tr><tr><td>מספריים מיקרו חיתוך 4 אינץ' &nbsp;</td><td>חברת Roboz</td><td>RS-5882</td><td>חותכת גם את העור וגם את הגולגולת של החולדה.</td></tr><tr><td>מלקחיים מיקרו-מלקחיים בזווית 4 אינץ', חדה עדינה&nbsp;</td><td>חברת Roboz</td><td>RS-5095</td><td>מחזיק את עור החולדה בזמן הסרת הגולגולת.</td></tr><tr><td>מיקרו מלקחיים 4 אינץ' מעוקל מעט 0.8</td><td>Roboz Company</td><td>RS-5135</td><td>כלי המשמש להפרדת קליפות.</td></tr><tr><td>פינצטה מיקרו-מנתחת</td> חברת <td>Roboz RS-4972</td><td>מקלפת את קרומי המוח במוח.</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ דיסקציה</td><td>אולימפוס</td><td>SZX16</td><td>חשוב להסרת קרומי המוח מקליפת המוח.</td></tr><tr><td>הכנת DMEM - שלב 2</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle' s בינוני (DMEM)</td><td>GibCo. חברה</td><td>11995-065</td><td>תומכת בצמיחת תאים.</td></tr><tr><td>תוסף נתרן ביקרבונט</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>S7277</td><td>למדיית תרבית התאים.</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>GibCo. חברה</td><td>10437-010</td><td>תוסף סרום לתרבית התאים.</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין&nbsp;</td><td>ג'יבקו. חברה</td><td>15140-148</td><td>מעכבת צמיחה של חיידקים בתרבית התאים.</td></tr><tr><td>מערכת סינון 1 ליטר עם נקבוביות 0.22um</td><td>קורנינג</td><td>431098</td><td></td></tr><tr><td><חזק>תרבית אסטרוציטים - שלב 3</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנרת סרולוגית 5 מ"ל</td><td>VWR</td><td>89130-896</td><td>לפיפטה DMEM למיכלים עם תאים.</td></tr><tr><td>פיפטות סרולוגיות 10 מ"ל</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td>לפיפטה DMEM למיכלים עם תאים.</td></tr><tr><td>צנרת סרולוגית 25 מ"ל</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td>לפיפטה DMEM למיכלים עם תאים.</td></tr><tr><td>צינור חרוטי צנטריפוגה 15 מ"ל</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-200250</td><td></td></tr><tr><td>צינור נעילה בטוחה 1.5 מ"ל</td> טיפים למחסום <td>022363204</td><td></td><td>אפנדורף</td></tr><tr><td>200 uL</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-201725</td><td></td></tr><tr><td>טיפים למחסום 1 מ"ל</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-201727</td><td></td></tr><tr><td>תיק כתום Biohazard 14 x 19 אינץ'</td> <td>VWR</td><td>14220-048</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי 60 מ"מ</td><td>פלקון</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>רפידות גזה סטריליות</td><td>Honeywell Safety</td><td>89133-086</td><td></td></tr><tr><td>Stomacher 80 Biomaster</td><td>Sewar Lab System</td><td>030010019</td><td>טריטורציה של רקמת המוח.</td></tr><tr><td>Stomacher 80 בלנדר שקיות סטריליות</td><td>Sewar Lab System</td><td>BA6040</td><td>שקית סטרילית להומוגניזטור תאי הקיבה.</td></tr><tr><td>400 מ"ל</td><td>פיירקס</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td>מסננת דיסוציאציה של תאים סטריליים, רשת #60&nbsp;</td><td>חברת סיגמא-אולדריץ'</td><td>S1020</td><td>להשגת מתלה אחיד של תא יחיד.</td></tr><tr><td>מסננת דיסוציאציה של תאים סטריליים, רשת #100</td><td>חברת סיגמא-אולדריץ'</td><td>S3895</td><td>להשגת מתלה אחיד של תא יחיד.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פאזה הפוך</td><td>Nikon</td><td>Eclypse Ti-S</td><td>אמת תאים לזיהום או צמיחת תאים חריגה.</td></tr><tr><td>75 ס"מ צלוחיות סטריליות</td><td>Falcon</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Multi-well Plate</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>משקפי כיסוי מיקרו (כיסויים), 18 מ"מ, עגול</td><td>VWR</td><td>48380-046</td><td></td></tr><tr><td>Bright-Line hemacytometer</td><td>Company Sigma-Aldrich Company</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות פסטר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>אלכוהול אתילי&nbsp;</td><td>חברת Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>L-לאוצין מתיל אסטר הידרוכלוריד 98% (LME)</td><td>חברת Sigma-Aldrich</td><td>L1002</td><td>מקדמת חיסול של תאי מיקרוגליה בתרבות האסטרוציטים הראשונית בקליפת המוח.</td></tr><tr><td>ציטוזין ובטא;-D-arabinofuranoside (Ara-C)</td><td>חברת סיגמא-אולדריץ'</td><td>C1768</td><td></td></tr><tr><td>פולי-D-ליזין הידרוברומיד, מול משקל 70,000-150,000</td><td>חברת סיגמא-אולדריץ'</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין/EDTA</td><td>GibCo. חברה</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>טבליות מלח פוספט (PBS)</td><td>Calbiochem</td><td>524650</td><td></td></tr><tr><td>מים סטריליים</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; OGD הכנה בינונית - שלב 5</צינור</td> חרוטי חזק><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה 50 מ"ל</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s שונה Eagle' s גלוקוז חופשי בינוני</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>D5030</td><td>תומך בצמיחת תאים.</td></tr><tr><td>תוסף נתרן ביקרבונט</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>S7277</td><td>למדיית תרבית התאים.</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין&nbsp;</td><td>ג'יבקו. חברה</td><td>15140-148</td><td>מעכבת צמיחה של חיידקים בתרבית התאים.</td></tr><tr><td>200 מ'M&nbsp; ל-גלוטמין&nbsp;</td><td>ג'יבקו. חברה</td><td>25030-081</td><td>חומצת אמינו המשלימה את צמיחת התאים.</td></tr><tr><td>טבליות מלח מאגר פוספהט (PBS)</td><td>Calbiochem</td><td>524650</td><td></td></tr><tr><td>מערכת סינון 50 מ"ל עם נקבוביות 0.22um</td><td>קורנינג</td><td>430320</td><td></td></tr><tr><td>צינור חרוטי צנטריפוגה 50 מ"ל</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>מד זרימה יחיד&nbsp;</td><td>בילופס-רוטנברג</td><td>SMF3001</td><td>מדידת זרימת הגז בטיהור חמצן.</td></tr><tr><td>תא חממת היפוקסיה&nbsp;</td><td>StemCell</td><td>27310</td><td>מייצר סביבה היפוקסית לתרבית התאים.</td></tr><tr><td>מד חמצן מומס ניתן למעקב</td><td>VWR</td><td>21800-022</td><td></td></tr><tr><td>95% N2 / 5% תערובת גז CO2</td><td>Linde</td><td></td><td>מטהר את הסביבה מחמצן.</td></tr><tr><td><אימונופלואורסצנציה אסטרוציטים חזקה>ראשונית - שלב 6</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>טבליות מלח פוספט (PBS)</td><td>Calbiochem</td><td>524650</td><td></td></tr><tr><td>Formaline Solution Neutral Buffer 10%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>Solution המשמשת לקיבוע תאים.</td></tr><tr><td>מתנול&nbsp;</td><td>פתרון פישר</td><td>A4544</td><td>המשמש לתיקון תאים.</td></tr><tr><td>חומר פעילי שטח לא יוני (Triton X-100)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>GibCo. חברה</td><td>10437-010</td><td>תוסף סרום לתרבית התאים.</td></tr><tr><td>Anti-NeuN</td><td>Cell Signaling</td><td>24307</td><td>מזהה נוירונים בוגרים, משמש לאימות התרבות האסטרוציטית.</td></tr><tr><td>איתות תאים נגד PCNA</td><td></td><td>2586</td><td>מזהה תאים מתרבים.</td></tr><tr><td>Propidium Iodide (PI)</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>P4170</td><td>צביעת אפופטוזיס.</td></tr><tr><td>Anti-Olig1</td><td>Abcam</td><td>AB68105</td><td>מגלה אוליגודנדרוציטים בוגרים.</td></tr><tr><td>Anti-IBA1+</td><td>Wako</td><td>016-20001</td><td>מזהה תאי מיקרוגליה.</td></tr><tr><td>אנטי-GFAP מצומד עם Cy3&nbsp;</td><td>חברת Sigma-Aldrich</td><td>C9205</td><td>מזהה אסטרוציטים תגובתיים בתאים המטופלים.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probe Life Technology</td><td>A1101</td><td>נוגדן משני נגד עכברים.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555</td><td>Molecular Probe Life Technology</td><td>A21428</td><td>נוגדן משני נגד ארנב.</td></tr><tr><td>4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich Company</td><td>D9542</td><td>צביעה גרעינית.</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ניטור אסטרוציט תגובתיות התפשטות במבחנה בתנאים כמו איסכמי

Monitoring Astrocyte Reactivity and Proliferation in Vitro Under Ischemic-Like Conditions

שבץ איסכמי הוא פגיעה מוחית מורכבת הנגרמת על ידי כגון או תסחיף חוסם את זרימת הדם אל חלקים במוח. זה מוביל לקיפוח של חמצן, גלוקוז, אשר גורם אנרגיה ולמוות עצביים. לאחר עלבון שבץ איסכמי, האסטרוציטים הפך תגובתי, להתרבות סביב האתר פציעה כפי שהוא מתפתח. בתסריט הזה, קשה ללמוד את התרומה ספציפי של האסטרוציטים לאזור המוח חשוף איסכמיה. לכן, מאמר זה מציג מתודולוגיה ללמוד אסטרוציט העיקרי תגובתיות והתפשטות תחת מודל במבחנה של סביבה, כמו איסכמיה, שנקרא גלוקוז חוסר חמצן (OGD). האסטרוציטים הם בודדו אותנו מהמתרחש 1-4 ימים-חולדות neonatal הישן, מספר התאים astrocytic שאינם ספציפיים הוערכה באמצעות סמן סלקטיבי אסטרוציט גליה Fibrillary חומצי חלבון (GFAP) וצביעת גרעינית. התקופה שבה האסטרוציטים נחשפים לתנאי OGD יכול להיות מותאם אישית, כמו גם אחוז החמצן שהם נחשפים. גמישות זו מאפשרת למדענים לאפיין את משך התנאי איסכמי כמו בקבוצות שונות של תאים בתוך חוץ גופית. מאמר זה מתאר את מסגרת זמן של OGD זה לגרום אסטרוציט תגובתיות מורפולוגיה היפרטרופית, התפשטות כפי שהיא נמדדת immunofluorescence באמצעות מתרבים תאים גרעיניים אנטיגן (PCNA). מלבד התפשטות, האסטרוציטים עוברים אנרגיה סטרס חמצוני, להגיב OGD על ידי שחרור גורמים מסיסים לתוך התא האמצעי. בינוני יכול להיות ונשתמש בהם כדי לנתח את ההשפעות של מולקולות שפורסמו על ידי האסטרוציטים בתרבויות עצביים ראשי ללא אינטראקציה עם מתא לתא. לסיכום, המודל התרבות התא הראשי ניתן להשתמש ביעילות כדי להבין את התפקיד של האסטרוציטים מבודד על פגיעה.

אחד החששות העיקריים של התרבות astrocytic העיקרי הוא הנוכחות של תאים אחרים כגון נוירונים, oligodendrocytes להפוך, fibroblasts מיקרוגלייה. איור 1, תאים מבודדים מן החולדה cortices היו שינויים מדיה כל 3 ימים והיו גם אינו מטופל או שטופלו עם הוספת LME עבור 1 ה 24 שעות מאוחר יותר, התאים היו immunostained עבור GFAP, counterstained עם דאפי. תאים לא מטופלת הראה ממוצע של 39% הלא-GFAP תאים חיובי, ואילו תאים שטופלו LME הראה 8%. תוצאות אלו מראות איך הטיפול LME ומדיה לשנות ...

שבץ איסכמי הוא אירוע מורכב שבו התרומה ספציפי של האסטרוציטים לאזור במוח המושפעים נחשפים גלוקוז חוסר חמצן (OGD) הוא קשה ללמוד. מאמר זה מציג מתודולוגיה להשיג האסטרוציטים מבודד וללמוד שלהם תגובתיות והתפשטות בתנאים OGD.

Ischemic stroke is a complex brain injury caused by a thrombus or embolus obstructing blood flow to parts of the brain. This leads to deprivation of ...

הפרוטוקול הבא נועד להדגים בידוד של אסטרוציטים ראשוניים ממוחות של גורי חולדות לצורך ביצוע מחסור בחמצן וגלוקוז (oxygen glucose deprivation או OGD). חשיפת אסטרוציטים מנוקים לסביבה של מחסור בחמצן וגלוקוז היא מודל המאפשר לבחון את התגובה לחלק מהתנאים המצויים בשבץ מוחי איסכמי. ניתן להבחין במדדים של שינויים מתודיים לאחר חשיפה למחסור בחמצן וגלוקוז ולמדוד אותם באמצעות סמנים סלקטיביים לאסטרוציטים כגון GFAP.לסיכום, תאים מבודדים אלו שנחשפו לתנאים דמויי איסכמיה יכולים לשמש לבדיקת מסלולים חדשים המופעלים בתנאי היפוקסיה ותרופות אחרות המגנות מפני שבץ איסכמי. בחלק זה של הפרוטוקול יבודדו אסטרוציטים מקליפת המוח של גורי חולדה. מטרת הליך זה היא להשיג תרבית ראשונית של תאי אסטרוציטים לביצוע ניסויי מחסור בחמצן ובגלוקוז (oxygen glucose deprivation).החומרים להליך זה הם הבאים; יש להעביר את כל החומרים באוטוקלבה לפני השימוש בהם בהליך זה. כמו כן, יש לחשוף את מנדף הרחצה לקרינת UV למשך 20 דקות לפחות לפני תחילת הפרוטוקול. כדי להתחיל בהליך זה, יש להעביר בפיפטה 3 עד 5 מיליליטר של מצע DME מלא לכל צלחת.החלוקה תהיה כדלקמן: חלק אחד לכל מוח של עכבר, שניים לכל קליפות המוח (cortices), ושלושה לכל קליפות המוח ללא הקרומים (meninges). בצעו דקפיטציה לגור לאחר חיטוי ב-70% ethanol. בצעו חתך החל מאחורי הראש לכיוון האף.הסר את הגולגולת באמצעות פינצטה קמורה וגרד בעדינות את המוח הקטן כדי לחשוף את קליפת המוח. הסר את המוחות שנחשפו באמצעות פינצטה והנח את המוח בצלחת פטרי ראשונה המכילה מצע גידול. חזור על שלבים אלו עבור כל שאר הגורים.הפרידו את חצאי המוח על ידי חלוקה עדינה לאורך החריץ המרכזי בעזרת הקצה החד של פינצטת המיקרו-דיסקציה. קלפו את קליפות המוח על ידי הסרת החומר הלבן וההיפוקמפוס באמצעות תנועת צביטה של הפינצטה, והשאירו אותם מאחור. העבירו את קליפות המוח שקולפו לצחנת הפטרי המסומנת במספר שתיים.חזור על הפרוצדורה עבור כל המוחות, תוך איחוד כל קליפות המוח שבוצלו בתוך צלחת פטרי. נער בעדינות את הצלחת כדי להפיץ את המצע באופן שווה בין כל קליפות המוח. השתמש במיקרוסקופ דיסקציה כדי לזהות את הקרומים המצפים את קליפות המוח שקולפו.הקרומים הם שכבה שקופה ודקה מאוד שניתן לזהות על ידי חיפוש אחרי נימי דם אדומים קטנים המקיפים את הרקמה. בדקו בקפידה והסירו את הקרומים המצפים לקליפות המוח, וקלפו אותם בעדינות מהאונות הקליפתיות הבודדות באמצעות פינצטה עדינה משני צדי כל קליפה. העבירו את הקליפות הנקיות לכלי פטרי חדש המסומן במספר שלוש.עבור דיסוציאציה של רקמה באמצעות שיטת ה-stomacher או הבלנדר, שפכו את הקורטקסים הנקיים והמקלפים ואת המצע מתוך צלחת הפטרי לתוך שק בלנדר סטרילי. הוסיפו מספיק מצע כדי להביא את הנפח הכולל של השק ל-5 mL. הניחו את השק בתוך ה-stomacher 80, כך שכשני סנטימטרים מהשק יישארו גלויים מעל הדלת הסגורה.פירוק התאים במכשיר זה מתבצע לאחר 2.5 דקות במהירות גבוהה. לחלופין, ניתן לבצע פירוק של רקמה על ידי סגירת השקית הסטרילית ודפיקה עדינה של הרקמה באמצעות כוס כימית (beaker) בתוך המנדף, עד שחלקיקי הרקמה יהפכו לתמיה דקה. יש לוודא שמשתמשים בבד בין השקית לכוס הכימית כדי למנוע חיכוך וקרע של השקית.שפכו את תרחיף התאים למרכז שרוול בעל מספר רשת 60. שפכו את התאים המסוננים למרכז רשת מספר 100 ואפשרו להם להסנן בכוח הכבידה. שפכו את תרחיף התאים המסונן לשפופרת קונית של 15 milliliter.סבבו את תרחיף התאים בצנטריפוגה במהירות של 200 ×g, רצוי בצנטריפוגה עם רוטור של דלייים נדנדים (swing bucket router), למשך חמש דקות. הסירו את הנוזל העליון (supernatant) והשליכו אותו לכוס כימית. הוסיפו מצע גידול טרי ומלא למשקע התאים.באמצעות פיפט סרולוגית, השביה והפרד את משקע התאים בנפח מקסימלי של 5 mL מתוך המצע. הוסף את הכמות הרצויה של תגסוס התאים לבקבוק תרבית והשלם את הנפח במצע. העבר את המשקע שהושבה לבקבוק עם המצע.פזרו את התאים באופן שווה בכל רחבי הבקבוק והניחו אותם באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5% carbon dioxide. זכרו להחליף את המצע כל שלושה ימים. המתודולוגיה הבאה נועדה להחסיר מהתאים חמצן וגלוקוז בסביבה מבוקרת.מטרת מודל זה היא לחקור את תגובת האסטרוציטים במצב של שבץ דמוי איסכמיה. החומרים המשמשים להליך זה הם: יש לנקות את המצע נטול הגלוקוז על ידי הכנסת פיפטה סרולוגית המחוברת למערכת הגז. יש להעביר בועות של תערובת הגז בתוך התמיסה במשך 10 דקות בקצב זרימה של 10 עד 15 litters לדקה.לאחר סיום 10 הדקות, התאימו את ה-pH של מצע ה-OGD ל-7.4. סננו את המצע נטול הגלוקוז שעבר ניקוי גזים באמצעות מערכת סינון של מבחנה בנפח 50 milliliter. חשוב תמיד להכין מצע OGD טרי עבור כל ניסוי.פעולה זו תבטיח כי התווך יהיה נקי מחמצן. הסר את תווך האסטרוציטים ושטוף עם cellular PBS פעמיים כדי להסיר גלוקוז מהתאים. הוסף את תווך ה-OGD לבארות.הניחו את הצלחת בעלת הבארות הרבות כאשר המכסה פתוח בתוך תא ההיפוקסיה. חברו את תערובת הגז לשסתום הכניסה והשאירו את שסתום היציאה פתוח. שטפו את התא בתערובת הגז בקצב של 10 עד 15 litter לדקה, למשך חמש עד שבע דקות.עצור את זרימת הגז וסגור תחילה את התסמיך על שסתום היציאה. לאחר מכן, סגור את התסמיך על צינור שסתום כניסת הגז. הנח את תא ההיפוקסיה בתוך אינקובטור לתרביות תאים בטמפרטורה של 37 °C למשך הזמן הרצוי ב-OGD.בסיום זמן האינקובציה, שאבו את מצע ה-OGD והוסיפו בזהירות DMEM מלא לתאים עבור תנאי הנורמוקסיה. החזירו את התאים לאינקובטור התרביות לפרקי זמן של 0, 24 ו-48 שעות בתנאי נורמוקסיה. פרוטוקול זה מתאר את בידולם של אסטרוציטים מקורטקס של חולדות רב-בשלים (neonatal).לאחר תיקוף טהרת התרביות הראשוניות, בוצעו ניסויי OGD. במודל דמוי-איסכמי זה, חסר בגלוקוז ובחמצן השיג שינוי פיזיולוגי יותר, אשר נוטר באמצעות אימונופלואורסצנציה תוך שימוש במארקרים אסטרוציטיים כגון GFAP או במארקרים של שגשוג כגון PCNA. אחד היתרונות של מודל זה הוא שהוא מאפשר לנו לחקור תגובה של סוג תא ספציפי.אף על פי שהמגבלה בטכניקה זו היא היעדר אינטראקציה בין תאים עקב בידוד האסטרוציטים, אחת הדרכים האפשריות להתגבר על מגבלה זו היא לחשוף את האסטרוציטים למדיום מותנה (conditioned media) מסוגי תאים אחרים או לביצוע תרבית משותפת (co-culture). לסיכום, שיטת הפריבציה של חמצן וגלוקוז במערכת של תאים מבודדים מאפשרת לנו לבחון ישירות את ההשפעות של מולקולות נוירופרוטקטיביות או נוירוטוקסיות שונות.כמו כן, זהו כלי תקף לחקר הביולוגיה של האסטרוציטים. לבסוף, מודל זה מהווה בסיס חזק לחקר תרופות התפתחותיות בתנאים ניסיוניים באמצעות מודלים in vivo.

monitoring-astrocyte-reactivity-proliferation-vitro-under-ischemic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מאמר זה מתאר פרוטוקול מגיב רומן ולהגדיר מיועד מדידה רגישה של ההשפעות הנוירו של תרכובות וטיפולים על שיתוף תרבויות של נוירונים האסטרוציטים באמצעות ניתוח תוכן גבוהה. תוצאות מראים כי ניתוח תוכן גבוהה מהווה טכנולוגיה חדשנית מרגש להערכה neurotoxicity.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

האסטרוציטים הוכרו כתאים צדדיים המשתתפים בתהליכים ביולוגיים בסיסיים שחיוניים להתפתחות המוח ותפקודו תקין, ותיקון מערכת עצבים מרכזי. כאן אנו מציגים הליך מהיר לקבלת תרבויות astrocyte עכבר טהורות ללמוד ביולוגיה בכיתה זו גדולה של תאים במערכת עצבים מרכזיים.

בידוד ותרבות של האסטרוציטים עכבר קליפתיים

אסטרוציטים מסוג פרא פנוטיפי ותאי גזע עצביים שנאספו מעכברים שהונדסו עם אללים אונקוגניים מותנים ומותנים ועברו טרנספורמציה ויראלית יכולים לשמש למודל פתוגנזה של אסטרוציטומה במבחנה ובגוף החי על ידי הזרקה אורתוטופית של תאים שעברו טרנספורמציה למוחם של חברים סינגניים בעלי יכולת חיסונית.

דוגמנות אסטרוציטומה פתוגנזה במבחנה ו בVivo שימוש בקליפת מוח האסטרוציטים או בתאי גזע עצביים מעכברים מותנים, מהונדסים גנטי

אסטרוציטים במערכת העצבים המרכזית משנים את תכונותיהם התפקודיות והמבניות בתגובה לגירויים מזיקים. דוח זה מציג פרוטוקול להערכת מורפולוגיה תלת מימדית של אסטרוציטים במצבי מחלה או לאחר התערבויות טיפוליות.

פרוטוקול לConfocal ניתוח morphometric תלת ממדי של האסטרוציטים

האסטרוציטים הם אחד משחקני המפתח החשובים ביותר במערכת העצבים המרכזית (CNS). כאן אנו מדווחים על שיטה מעשית של פרוטוקול תרבות astrocyte בהיפוקמפוס חרמנית על מנת ללמוד את המנגנונים העומדים בבסיס תפקוד astrocyte גורים הילוד זכר ונקבה לאחר חוץ גופית איסכמיה.

הבדלים בין המינים עכבר בהיפוקמפוס האסטרוציטים לאחר<em&gt; In-Vitro</em&gt; איסכמיה

שמירה על כיסוי מחסום דם מוחי היא המפתח להומיאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול זה מתאר טכניקות חוץ גופית כדי לתמצת את התהליכים הבסיסיים הפתולוגיים כי לווסת דם מוח המכשול הכיסוי.

ב מבחני מבחנה כדי להעריך דם מוח מחסום כמו רשת כלי שיטפון ושיבוש

פרוטוקול AWESAM המתוארים כאן הוא אופטימלי culturing האסטרוציטים מאתר בבידוד מתאי המוח אחרים בצורה מהירה, פשוטה וזולה. AWESAM האסטרוציטים התערוכה ספונטנית Ca2 + איתות, מורפולוגיה, ג'ין ביטוי ופרופילי דומה האסטרוציטים ויוו.

Culturing In Vivo-כמו האסטרוציטים מאתר באמצעות פרוטוקול AWESAM מהירה, פשוטה וזולה

כאן, אנו מציגים גישה פשוטה באמצעות מדיה תרבותית ספציפית המאפשרת הקמת תרבויות מועשרות בנוירון ואסטרוקייט, או תרבויות נוירון-גליה מקליפת המוח העוברית, עם תשואה גבוהה ושחזור.

מודל תרבות תא לחקר התפקיד של אינטראקציות נוירון-גליה באיסכמיה

כאן אנו מתארים פרוטוקול המאפשר התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לאסטרוציטים פונקציונליים ספציפיים למוח הקדמי. זה מאפשר לחקור את תפקידם של תאי גליה בפתוגנזה של הפרעות נוירו-התפתחותיות, כגון תסמונת ה-X השביר, ומודלים של הפרעות מוח אחרות.

יצירה ואפיון של אסטרוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם וחסרים ריבונוקלאופרוטאין שליח X שביר

כאן, אנו מספקים מתודולוגיה מפורטת לבידוד הרשתית מעין העכבר לניסויים ממושכים ex vivo . פרוטוקול זה מדגיש את הנגשת הגישה התובענית מבחינה טכנית לחוקרים המעוניינים לנצל את דרכי המחקר הניתנות על ידי שמירה על גליה ברשתית באתרה ברקמה חיה.

מודל ex vivo explant לחקר אינטראקציות גליה ברשתית העכבר

פרוטוקול זה מספק שיטה משולבת הכוללת העברת ויראלית, השתלת אופטרודה, השראה פוטותרומבוטית, רישום סימולטני של פעילות אסטרוציטים ונוירונים, וגירוי אופטוגנטי של אסטרוציטים. שיטה משולבת זו שואפת לספק חקירה מקבילה של מערכת היחסים בין האסטרוציטים לנוירון בשלבים החריפים ועד הכרוניים של שבץ איסכמי.

שיטה משולבת למידול שבץ פוטוטרומבוטי ורישום אופטרודה ב-vivo של פעילות נוירונית ואסטרוציטית בעכברים מתנהגים

למדו את פרוטוקול הבידוד של אסטרוציטים ראשוניים ממוחות גורי חולדות לבחינת תגובתיות התפשטות בתנאי חסר חמצן וגלוקוז. שיטה זו מאפשרת למחקרי מוח לחקור שינויים ב-GFAP ולפתח תרופות להגנה על מוח.

ניטור אסטרוציט תגובתיות התפשטות במבחנה בתנאים כמו איסכמי

גלה סרטונים נוספים