מיקרוסקופ intravital להערכת סרטניים הקשורים לשימוש מתקדם הגבי צ'יימברס Skinfold חלון על העכברים הטרנסגניים פלורסנט

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להשתמש בתא קמט עור גבי (dorsal skinfold chamber) מתקדם כדי לבחון בפירוט את התפתחות כלי הדם הקשורים לגידול במודל של עכבר. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחום הסרטן, כגון שיפור הטיפול והבנת התקדמות הגידול. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהתהליכים נלמדים בהקשר הנכון, בתנאי חיים אמיתיים, וכי ניתן לחקור תהליכים אלו לאורך זמן.

ההליך יודגם על ידי ד"ר Ann Seynhaeve, החוקרת הבכירה במעבדה שלי. מעכבר תורם שאינו טרנסגני, קצרו פרגמנט גידול שאינו נמקרי בקוטר 10 mm להשתלה בתא חלון הגב של העכבר המקבל. השתמשו בעכבר תורם רגיל עבור גידול סינגנאי או בעכבר תורם בעל חסר חיסוני עבור קסנוגרפט.

העכבר המקבל חייב להיות בן 12 שבועות לפחות ושוקל 20 גרם או יותר. בצע את כל הפרוצדורות הכירורגיות תחת תנאים אספטיים. לדוגמה, בצע עיקור באוטוקלאב לכלי הניתוח ולחומרי התא.

לאחר הרדמת העכבר המקבל, הסר את הפרווה מכל הצד הגבי (dorsal side) באמצעות תספורת חשמלית ולאחר מכן השתמש בג'ל להסרת שיער. שטוף את העור עד לניקיונו ויבש אותו. לבסוף, קרצף את העור לאחר הסרת השיער בעזרת ethanol.

כעת, סמנו קו מרכז אופקי לאורך עמוד השדרה. לאחר מכן, מקמו את חלון התצפית לפחות 2 mm מתחת לקו וסמנו את היקף החלון על העור. בשלב הבא, בעזרת סקלפל ומספריים, הסירו בזהירות את העור בתוך קו ההיקף מבלי לפגוע בפסציה שמתחתיו.

לאחר מכן, הרימו את קפל העור והשתמשו במנקב אוזניים כדי ליצור חורים של 1 mm משני צידי אזור החלון עבור הברגים המחזיקים את החלון במקומו. מקמו את המסגרת האחורית על העכבר ואבטחו את המסגרת על ידי הצבת האומים על הברגים. לאחר מכן, משכו את העור שני עד שלושה מילימטרים מעל המסגרת כדי לוודא שהיא מתאימה.

אם כן, דחפו מחטים בכילוי 23 דרך שני חורי התפירה בחלקו העליון של המסגרת. הדקו את המסגרת על ידי הידוק האומים והחזיקו אותם באמצעות מחזיקי מחטים (clamping needle holders); אין להדק את האומים יתר על המידה כדי למנוע מהעור להסתובב סביב הברגים. לאחר מכן, החליפו את המחטים בתפרים כדי לקבע את המסגרת לעור.

כעת הפכו את העכבר לצדו. מזווית זו הכניסו פיסת זכוכית למילוי עבה וזכוכית כיסוי סטנדרטית של 12 מילימטר. הדקו את שתיהן באמצעות טבעת קיבוע כך שהפציה תהיה צמודה לזכוכית.

השלב הבא הוא להמיס את החלון באמצעות 0.9% sodium chloride. יש להניח מספר טיפות על אזור התצוגה ולספוג את העודפים. כעת, ממש מתחת לחלון, השתמש במחט gauge 25 עם כיפוף של 90 מעלות כדי ליצור כיס עמוק בפסציה שיכול להכיל מילימטר מעוקב של רקמת גידול.

לאחר מכן, הכניסו את רקמת הגידול לתוך התא. לבסוף, סגרו את אזור תצפית החלון באמצעות זכוכית כיסוי סטנדרטית בגודל 12 מילימטר וטבעת קיבוע. בועות אוויר ייעלמו בתוך שעה.

לפני הרדמת העכבר, חמם פלטפורמה בעלת בקרת טמפרטורה המיוצרת בהתאמה אישית ל-37 degrees Celsius. לאחר הרדמת העכבר, מקם אותו על הפלטפורמה המחוממת. חבר מסכת אף להגשת isoflurane, ובמידה וההערכה תימשך יותר מחמש דקות, הנח משחה עינית.

כעת, הצמידו את התא באמצעות ברגי החלון למחזיק שהוכן במיוחד, והדקיו את המחזיק לפלטפורמה. לאחר מכן, נקו את חלון הזכוכית בעזרת מים וכותנה. כעת, במיקרוסקופ, בדקו את התפתחות כלי הדם בגידול באמצעות עדשה של 10x, תחת תאורה בשדה בהיר (bright-field) ותאורה פלואורסצנטית.

לאחר הבדיקה הגסה, הדלק את לייזרים הקונפוקאליים. הגדר את לוח הבקרה של המיקרוסקופ ל-smart gain של 100 volts לסיבוב, smart offset של 10% לסיבוב, זום בינוני, מיקומי X ו-Y בינוניים ו-100 microns של מיקום Z לסיבוב.

הגדירו את מצב הרכישה ל-XYZ או XYZT. בחרו רזולוציה. בחרו מהירות רכישה של 2 או 400 Hertz.

כוון את חור סיכה (pinhole) ליחידה אחת של Airy unit. ובחר באופציית X דו-כיוונית (bidirectional). בעת הערכה של מספר פלואורופורים עם טווח ספקטרלי חופף פוטנציאלי, בחר בסריקה סדרתית בין פרמים (sequential scan inbetween frames) כדי למנוע זליגה (bleedthrough) והגדר את נתיבי הקרן הנכונים.

הגדירו את ממוצע השורות (line average) לארבע, ולבסוף, בחרו סט נתונים חדש עבור הניסוי. כעת, התמקדו ברקמה הרלוונטית; לצורך כך, מומלץ להשתמש בעדשות יבשות בעלות מפתח מספרי (numerical aperture) גבוה יותר. לאחר מכן, השתמשו בסריקה מהירה בזמן אמת (fast live scan) כדי להשיג את יחס אות לרעש הטוב ביותר, וזאת על ידי כיוונון ההגבר (gain) וההיסט (offset) עד לרמה שבה אין חשיפת יתר.

כעת, בחרו ב-Z stack בלשונית acquire. בצעו סריקת Z מהירה. על סמך הסריקה המהירה, קבעו את נקודות ההתחלה והסיום של הסריקה המלאה.

לאחר מכן, הגדירו את גודל צעד ה-Z בהתאם לגודל הפינהול והמשיכו לסריקה מלאה. עכברים מארחים המבטאים סמנים פלואורסצנטיים נסרקו לאחר השתלת הגומור באמצעות הפרוטוקול המתואר. הסמן eNOStag-GFP מתבטא בגולג'י ובקרום התא של תאי אנדותל.

הסימון ROSAmT/mG מבטא פלורסצנציה אדומה באופן גורף ופלורסצנציה ירוקה בתאים המבטאים Cre Recombinase. יישום אחד של טכנולוגיה זו הוא לחקר התפתחות כלי דם, שכן ניתן לראות את כל השלבים בגידולים. לדוגמה, ניתן לראות חזיתים אנדותליאליים המניצים לאזורים שאינם מכילים כלי דם.

לגידולים ישנם גם כלי דם פגומים ומצעים וסקולריים מבוססים עם כלי דם מסועפים ובוגרים. יישום נוסף הוא חקר היווצרות הלומן (lumen), זרימת הדם והנזילה (extravasation) באמצעות סימון הדם, למשל בעזרת ננו-חלקיקים פלואורסצנטיים. כך ניתן להבחין בזרימת הדם בתוך הלומן של צינורות כלי הדם ובסמיכות לתאי קצה אנדותליאליים.

בתאי הקצה, ניתן להבחין בהיווצרות של לומן (lumen). ניתן להשתמש במיקרוסקופיה תוך-חיה (Intra-vital microscopy) גם כדי לחקור את השפעתם של חומרים כימותרפיים. לדוגמה, 24 שעות לאחר הזרקת ננו-חלקיקים לבעל חיים מסוג eNOStag-GFP, הננו-חלקיקים נותרו בכלי הדם עם מעבר מינימלי אל המרווח הבין-תאי של הגידול.

עם זאת, כאשר ננו-חלקיקים הוענקו בשילוב עם TNF, נצפתה נטיפה (extravasation) אל תוך האינטרסטיציום של הגידול. זוהי עדות לעלייה בהובלת התרופה לתוך הגידול. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו מתקינים תא חלון של קפל עור גבי (dorsal skinfold window chamber) וכיצד ללמוד תהליכים הקשורים לגידולים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.