מיקרוסקופ intravital להערכת סרטניים הקשורים לשימוש מתקדם הגבי צ'יימברס Skinfold חלון על העכברים הטרנסגניים פלורסנט

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להשתמש בתא קפל עור גבי מתקדם כדי לבחון בפירוט את התפתחות כלי הדם הקשורים לגידול במודל עכבר. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הסרטן, כגון שיפור הטיפול והבנת התקדמות הגידול. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שתהליכים נלמדים בהקשר הנכון, בחיים האמיתיים וכי ניתן ללמוד תהליכים אלה לאורך זמן.

הליך זה יודגם על ידי ד"ר אן סיינהייב, החוקרת הבכירה במעבדה שלי. מעכבר תורם שאינו טרנסגני, קצור שבר גידול לא נמק בקוטר 10 מ"מ להשתלה בתא החלון הגבי של העכבר המקבל. השתמש בתורם עכבר רגיל לגידול סינגני או בתורם עכבר חסר חיסון לקסנוגרפט

העכבר המקבל חייב להיות בן 12 שבועות לפחות ולשקול עשרים גרם או יותר. בצע את כל ההליכים הכירורגיים בתנאים אספטיים. לדוגמה, חיטוי המכשירים הכירורגיים וחומרי החדר.

לאחר הרדמת העכבר המקבל, הסר את השיער מכל הצד הגבי באמצעות גוזם חשמלי ולאחר מכן השתמש בג'ל להסרת שיער. יש לשטוף את העור ולייבש אותו. לבסוף, שפשפו את העור המנופח באתנול.

כעת, סמן קו מרכז אופקי לאורך עמוד השדרה. לאחר מכן, מקם את חלון התצוגה לפחות 2 מ"מ מתחת לקו וסמן את היקף החלון על העור. לאחר מכן, בעזרת אזמל ומספריים, הסר בזהירות את העור בתוך קו ההיקף מבלי לפגוע בפאשיה הבסיסית.

לאחר מכן, משוך את קפל העור כלפי מעלה והשתמש במנקב אוזניים כדי להכניס חורים של 1 מ"מ משני צידי אזור החלון עבור הברגים המחזיקים את החלון במקומו. מקם את המסגרת האחורית על העכבר ואבטח את המסגרת על ידי הנחת האומים על הברגים. לאחר מכן, משוך את העור שניים עד שלושה מילימטרים מעל המסגרת כדי לוודא שהוא מתאים.

אם כן, תקעו מחטים בגודל 23 דרך שני חורי התפרים בחלק העליון של המסגרת. אבטח את המסגרת על ידי הידוק האומים והחזק אותם עם הידוק מחזיקי מחטים, אל תהדק יתר על המידה את האומים ותמנע מהעור להסתובב סביב הברגים. לאחר מכן, החלף את המחטים בתפרים כדי להדק את המסגרת לעור.

כעת סובב את העכבר הצידה. מזווית זו הכניסו חתיכת זכוכית מילוי עבה וזכוכית כיסוי סטנדרטית של 12 מילימטר. אבטח את שניהם עם טבעת שמירה כך שהפאשיה תהדק כנגד הזכוכית.

השלב הבא הוא לחות החלון באמצעות 0.9% נתרן כלורי. אפשר לכמה טיפות ליפול על אזור הנוף ולספוג את העודפים. כעת, ממש מתחת לחלון, השתמש במחט בגודל 25 עם כיפוף של 90 מעלות כדי ליצור כיס עמוק בפאשיה שיכול להכיל מילימטר מעוקב של רקמת הגידול.

לאחר מכן הכנס את רקמת הגידול לכיס. לבסוף, סגור את אזור התצוגה של החלון באמצעות זכוכית כיסוי סטנדרטית של 12 מילימטר וטבעת תמיכה. כל בועות האוויר יתפזרו תוך שעה.

לפני הרדמת העכבר, יש לחמם פלטפורמה מבוקרת טמפרטורה בהתאמה אישית ל-37 מעלות צלזיוס. לאחר הרדמת העכבר, מקם אותו על הפלטפורמה המחוממת. צרף אף כדי לספק איזופלורן ואם ההערכה תארך יותר מחמש דקות, הגש בקשה לפגישה עם רופא עיניים.

כעת, הברג את החדר באמצעות ברגי החלון למחזיק בהתאמה אישית ואבטח את המחזיק לפלטפורמה. לאחר מכן, נקו את חלון הזכוכית במים וכותנה. כעת, במיקרוסקופ, בדוק אם יש התפתחות כלי דם בגידול באמצעות המטרה פי 10, תחת שדה בהיר ואור פלואורסצנטי.

לאחר הבדיקה הגסה, הפעל את הלייזרים הקונפוקליים. הגדר את לוח הבקרה של המיקרוסקופ לרווח חכם של 100 וולט לסיבוב. היסט חכם של 10% לכל סיבוב, זום בינוני מיקום X ו-Y בינוני ו-100 מיקרון של מיקום Z לכל סיבוב.

הגדר את מצב הרכישה ל-XYZ או XYZT. בחר רזולוציה. בחר מהירות רכישה של שניים או 400 הרץ.

הגדר את חור הסיכה ליחידה אוורירית אחת. ובחר באפשרות X דו-כיוונית. בעת הערכת מספר פלואורופורים עם טווח ספקטרלי חופף אפשרי, בחר סריקה רציפה בין פריימים כדי למנוע דימום ולהגדיר את נתיבי האלומה הנכונים.

הגדר את ממוצע הקו לארבע ולבסוף, בחר ערכת נתונים חדשה עבור הניסוי. כעת, התמקדו ברקמה המעניינת בכך, עדיף להשתמש בעדשות יבשות עם צמצמים מספריים גבוהים יותר. לאחר מכן, השתמש בסריקה החיה המהירה כדי לקבל את יחס האות לרעש הטוב ביותר האפשרי על ידי התאמת הרווח וההיסט למקום בו אין חשיפת יתר.

כעת, בחר את מחסנית Z בכרטיסייה רכישה. בצע סריקת Z מהירה. מהסריקה המהירה, החליטו על מיקומי ההתחלה והסיום של הסריקה המלאה.

לאחר מכן, הגדר את גודל שלב Z בהתאם לגודל חור הסיכה והמשך בסריקה המלאה. עכברים מארחים המבטאים תוויות פלואורסצנטיות צולמו לאחר השתלת הגידול באמצעות הפרוטוקול המתואר. תווית eNOStag-GFP מתבטאת בגולגי ובקרום התא של תאי אנדותל.

תווית ROSAmT/mG מבטאת תפרחת אדומה בכל מקום ותפרחת ירוקה בתאים המבטאים Cre Recombinase. יישום אחד של טכנולוגיה זו הוא לחקר התפתחות כלי הדם שכן כל השלבים נראים בגידולים. לדוגמה, ניתן לראות חזיתות אנדותל נובטות לאזורים לא וסקולריים.

גידולים פגעו גם בכלי דם והקימו מיטות כלי דם עם כלי דם מסועפים בוגרים. יישום נוסף הוא לחקור היווצרות לומן, זרימת דם ואקסטרווזציה על ידי הדבקת תוויות על הדם, כגון ננו-חלקיקים שזוהרים. לפיכך, ניתן לראות זרימת דם בלומן של צינורות כלי הדם וקרוב לתאי קצה האנדותל.

בתאי הקצה, היווצרות לומן ניתן להבחין במלאי. ניתן להשתמש במיקרוסקופיה תוך-חיונית גם כדי לחקור את ההשפעה של חומרים כימותרפיים. לדוגמה, 24 שעות לאחר הזרקת ננו-חלקיקים לחיה eNOStag-GFP, הננו-חלקיקים נשארו בכלי הדם עם אקסטרוואזציה מינימלית לתוך אינטרסטיציום הגידול.

עם זאת, כאשר ננו-חלקיקים ניתנו בשילוב עם TNF, נצפתה אקסטרוואזציה לתוך אינטרסטיציום הגידול. זוהי עדות לעלייה במתן תרופות בין-גידוליות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להתקין תא חלון קפל עור גבי וכיצד לחקור תהליכים הקשורים לגידול באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית.