הלגיונלה pneumophila החיצון ממברנה שלפוחית: בידוד ניתוח של פוטנציאל פרו-דלקתיים שלהם על המקרופאגים

המטרה הכוללת של מחקר זה היא לטהר שלפוחיות ממברנה חיצונית או OMVs מ-Legionella pneumophila בצורה סטנדרטית ולנתח את השפעתם על שכפול חיידקים במקרופאגים אנושיים ועכברים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חקר שלפוחית הממברנה החיצונית. לדוגמה, ההליך הסטנדרטי להכנת OMV עשוי לעזור לחקור את השפעתם על אינטראקציה בין מארח-פתוגן.

היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא תספק פרוטוקול סטנדרטי לחקר ההשפעה של Legionella pneumophila OMV על מקרופאגים אנושיים או עכבריים וזה ישפר את הבנתנו את הפתוגניות של Legionella pneumophila. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר חשבנו על הפוטנציאל הפרו-דלקתי האפשרי של OMV וכיצד זה עשוי להשפיע על מהלך ההדבקה כאשר OMV משתחררים על ידי לגיונלה הן בתוך התא המארח והן מחוץ לתא. ההליך יודגם על ידי קרסטין הופמן, טכנאית מהמעבדה שלי ואנלינה יאנג, חוקרת פוסט-דוקטורט.

כדי להתחיל, תוך כדי עבודה בתנאים סטריליים, יש לפזר את ליבת הזן L.pneumophila B על צלחות אגר BCYE ולדגור ב-37 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים. השתמש ב-L.pneumophila מצלחת טרום תרבית כדי לחסן 10 מיליליטר של מדיה YEB ב-OD600 של 0.3 ולדגור את החיידקים ב-37 מעלות צלזיוס על שייקר מסתובב למשך שש שעות. ודא את טוהר התרבית הנוזלית על ידי פיזור 100 מיקרוליטר של המתלה על צלחת אגר דם.

דגרו על צלחת אגר הדם למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. מוסיפים את התרבות הנוזלית הנותרת ל -90 מיליליטר מדיום YEB טרי ומדגרים את התרבית על שייקר מסתובב עד שהיא מגיעה ל- OD600 של 3.0 עד 3.5. צנטריפוגה את התרבות הנוזלית ב -4, 000 גרם למשך 20 דקות כדי לגלול את החיידקים.

לאחר מכן העבירו את הסופרנטנט לצינורות צנטריפוגה טריים. השליכו את כדורי החיידקים וצנטריפוגה שוב את הדגימות לפני שתחזרו על שלב הצנטריפוגה פעם נוספת. לאחר מכן, יש לסנן לעקר את הסופרנטנט שנותר פעמיים.

לאחר מכן העבירו את הסופרנטנט נטול החיידקים לצינורות אולטרה-צנטריפוגה וסובבו את הדגימות ב-100,000 גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. שפכו את הסופרנטנט והשליכו אותו. לאחר מכן השתמש ב-PBS סטרילי כדי להשעות מחדש את כדורי ה-OMV ולאגד אותם.

חזור על שלב האולטרה-צנטריפוגה כדי להסיר חלבונים מזהמים ושחרר LPS. כעת, השליכו את הסופרנטנט וייבשו את צינור האולטרה-צנטריפוגה בעזרת צמר גפן סטרילי. השעו מחדש את גלולת ה-OMV עם 500 מיקרוליטר PBS סטרילי.

לאחר מכן פס 20 מיקרוליטר כל אחד על צלחות אגר הדם ו-BCYE אגר כדי לא לכלול זיהום חיידקי של השלפוחית המוכנה. דגרו את צלחת אגר הדם למשך הלילה ואת צלחת אגר BCYE למשך שלושה ימים. השתמש בבדיקת BCYE בהתאם להוראות היצרן כדי לכמת את כמות החלבון לתכשיר ה-OMV המתקבל.

לאחר התמיינות תאי THP-1 למקרופאגים על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש ב-500 מיקרוליטר של מדיום טרי כדי להחליף את מדיום ההתמיינות ודגירה על התאים למשך 24 שעות נוספות ב-37 מעלות צלזיוס. כדי לטפל בתאי THP-1 או BMDM של עכברים עם OMVs, יש להפשיר OMV שהוכנו בעבר ולהוסיף את הכמות המתאימה לתאים. דגרו על המקרופאגים עם OMV בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 שעות לפחות כדי להדביק תאי THP-1 שטופלו מראש או לא טופלו בתאי ליבה B או BMDM של עכברים מסוג בר עם מוטציה חסרת דגלים של זן זה מבלי לשנות את המדיום מהתאים.

הוסף חיידקים ב-MOI של 0.5 שמסתכם ב-1 כפול 10 ל-L.pneumophila החמישי לבאר. דגרו על התרבויות למשך 24 ו -48 שעות בהתאמה. כדי לליז את התאים, הוסף ספונין בריכוז סופי של 0.1% ודגירה על התאים למשך חמש דקות.

לאחר מכן השעו מחדש את המקרופאגים הליזים על ידי פיפטינג והעבירו את התרחיף לכלי תגובה. השתמש ב-PBS סטרילי להכנת דילולים סדרתיים של תרחיף L.pneumophila. לאחר מכן פס 50 מיקרוליטר מהדילולים הנדרשים על צלחות אגר BCYE ודגר את הצלחות למשך שלושה ימים.

ספרו חזותית את המושבות שנוצרו בעין ובצעו חישובים על פי פרוטוקול הטקסט. בניסוי זה, שבחן את הפוטנציאל הפרו-דלקתי של L.pneumophila OMVs, תאי THP-1 מובחנים PMA מגיבים עם עלייה תלוית זמן ומינון בהפרשת IL-8 ו-IL-6. כאן, ההשפעה של קולטנים דמויי טול שונים על זיהוי L.pneumophila OMV נותחה ב-BMDM של עכברים עם רקע גנטי שונה באמצעות בדיקת CXCL-1 ELISA.

BMDM של עכברים מעכברים מסוג בר הפרישו CXCL-1 לאחר גירוי OMV בעוד BMDM של עכברים מנוקאאוט כפול TLR2/4 הפרישו פחות באופן משמעותי. כדי לחקור את ההשפעה של L.pneumophila OMVs על שכפול חיידקים במקרופאגים THP-1, התאים הודגרו מראש ב-OMV למשך 20 שעות ולאחר מכן נדבקו בנוסף ב-L.pneumophila. הגירוי המקדים של מקרופאגים שמקורם ב-THP-1 מפחית תחילה את מינון שכפול החיידקים בתלות לאחר 24 שעות של הדבקה, בעוד שהוא מוביל להכפלה בספירת CFU בנקודת הזמן המאוחרת יותר.

כפי שהוצג בניסוי זה, הגירוי המקדים של BMDM של עכברים עם OMV מביא לעלייה של פי עשרה בספירת CFU ב-BMDM של עכברים מחיות בר בעוד שנוקאאוט TLR2 ומקרופאגים TRIF/MyD88 אינם מראים עלייה זו בשכפול L.pneumophila לאחר דגירה מוקדמת של OMV. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לעבוד בתנאים סטריליים ולבדוק אם יש זיהום חיידקי של ה-OMV המטוהרים. אחרת, הניתוח במורד הזרם אינו נותן תוצאות חד משמעיות.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים על מנת לענות על שאלות נוספות כמו איזו מוטציה של לגיונלה מייצרת יותר או פחות OMV או לחקור את ההשפעה של מצבי לחץ שונים על הפרשת OMVs. לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום מחקר OMV לחקור את ההשפעה של OMV על אינטראקציות מארח-פתוגן במבחנה ולאחר מכן in vivo. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לטהר OMV וכיצד להתחיל לנתח את השפעתם על הזיהום הבא של מקרופאגים.

לאחר מכן ניתן ליישם פרוטוקול זה עבור חיידקים גראם-שליליים שונים והתא המארח שלהם לאחר התאמת זמני הדגירה והגידול. אל תשכח שעבודה עם לגיונלה פנאומופילה יכולה להיות מדבקת ביותר עבור בני אדם ולכן יש לבצע תמיד עבודה מתחת לספסל סטרילי בזמן הטיפול בלגיונלה וביצוע הליך זה.