מדידה בו זמנית של סידן מיטוכונדריאלי מיטוכונדריאלי ממברנה פוטנציאלית בתאים חיים באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית

המטרה הכוללת של הליך זה היא לספק שיטה פשוטה למדידה בו זמנית של ספיגת סידן מיטוכונדריאלי ופוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיטוכונדריה, כגון כיצד המיטוכונדריה פועלות כמאגרי סידן מקומיים כדי לווסת באופן הדוק את ריכוז הסידן התוך תאי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן למדוד באופן ספציפי הן את הסידן המיטוכונדריאלי והן את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית בו זמנית בתאי חיים ללא צורך במניפולציה גנטית.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי ויסות סידן בפתולוגיה של מחלות מיטוכונדריאליות, ניתן להשתמש בה גם כדי לחקור מצבים ניווניים חדשים אחרים, כאשר ויסות סידן בשתנה הוא קריטי. בהליך זה, גדל את התאים על צלחות תרבית תאים של עשרה סנטימטרים, או צלוחיות של 75 סנטימטרים רבועים, במצע תרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. כדי לקצור את התאים, הסר מדיה על ידי שאיבה ושטוף את התאים בחמישה מיליליטר PBS.

לאחר מכן, הסר PBS על ידי שאיפה. לאחר מכן הוסיפו 1.5 מיליליטר של טריפסין EDTA, ודגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. לאחר מכן, הקש בעדינות על הצלחת כדי להסיר את התאים.

השעו אותם בחמישה מיליליטר של מדיה תרבותית. לאחר מכן, ספרו את התאים בעזרת המוציטומטר. יום לפני הדמיה קונפוקלית, צלחו את התאים במפגש של 60 עד 70 אחוז בכלים או בהחלקות כיסוי בתא.

לאחר מכן דגרו על התאים למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לתאים להיצמד ולהתאושש. בהליך זה, הכינו את תמיסת צביעת הרשומות עם TMRM, Fluo 4 AM ופעילי שטח. הסר את אמצעי התרבות ושטוף את התאים עם 100 מיקרוליטר PBS.

לאחר מכן, הסר PBS ודגר את התאים ב -100 מיקרוליטר של תמיסת צביעה תקליט למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הסר את תמיסת הצביעה ושטוף את התאים ב-100 מיקרוליטר של HBSS נטול סידן כדי להסיר עודפי Fluo 4 AM ו-TMRM. לאחר מכן הכינו את תמיסת הדמיון התוך-תאית עם digitonin, TMRM ו-thapsigargin.

לאחר מכן הסר את ה-HPSS נטול הסידן והוסף 300 מיקרוליטר של תמיסת הדמיית IM לתאים. השאירו את התאים לשיווי משקל בטמפרטורת החדר למשך עשר דקות לפני הדמיה עם תוספות הסידן הכלורי. השתמש בעוצמת לייזר נמוכה של כ-5 אחוזים כדי למזער כל נזק לצילום לתאים.

השתמש בהגדרה בלייזרי המיקרוסקופ עבור ספקטרום העירור והפליטה של TMRM ו-Fluo 4 AM. השתמש בעוצמת לייזר נמוכה של כחמישה אחוזים עם רווח גבוה כדי למזער את נזקי הצילום של התאים. לאחר מכן, הגדר את המיקרוסקופ לסרוק תמונות כל עשרים וחמש שניות. סרוק את התאים במשך עשר דקות כדי לקבוע את קריאות קו הבסיס עבור אותות TMRM ו-Fluo 4.

לאחר מכן השהה את סריקת התמונה והוסף 3 מיקרוליטר של תמיסת מלאי סידן כלוריד של 40 מילי-מולרי ישירות לתאים ב-300 מיקרוליטר של תמיסת הדמיית IM. מערבבים בעדינות עם פיפטה. בעת הוספת תמיסת סידן לתאים, היזהר לא להזיז את המנה בשלב המיקרוסקופ.

המשך בסריקת תמונות למשך כארבע דקות. לאחר מכן חזור על תוספות סידן כלוריד כל ארבע דקות עד שמגיעים לאותות TMRM או Fluo 4 הרצויים, בדרך כלל בסביבות שמונה עד עשר תוספות. לאחר מכן הוסף דילול של 1 עד 100 של FCCP מילי-מולרי אחד ישירות לתאים כדי לפזר את פוטנציאל הממברנה הפנימית.

לאחר מכן דמו את התאים במשך חמש דקות נוספות לפני סיום הניסוי. לאחר השלמת ההדמיה, קבע את עוצמת אותות Fluo 4 ו-TMRM באמצעות תוכנת ניתוח התמונה. לשם כך, פתח את התמונה, לחץ על כלי הבחירה ובחר אזור עניין המכיל מיטוכונדריה.

ניתן לבחור אזורי עניין מרובים למדידה על ידי פתיחת ניתוח, כלים, מנהל החזר ROI. לחץ על הוסף כדי לכלול את ההחזר על ההשקעה שנבחר למדידת עוצמה. חזור על השלבים הקודמים עד שכל ההחזר על ההשקעה יתווסף למנהל ההחזר על ההשקעה.

מדוד את עוצמת הפלואורסצנט הממוצעת של אותות TMRM ו-Fluo 4 עבור כל אזור עניין על ידי בחירת הפונקציה הרב-מדידה יותר. ודאו שהאפשרות 'מדוד את כל הפרוסות' נבחרה, ושהאפשרות 'שורה אחת לכל פרוסה' אינה מסומנת. לאחר מכן לחץ על אישור כדי לקבל טבלה של עוצמת הפלואורסצנט הממוצעת של אותות TMRM ו-Fluo 4 עבור כל החזר ROI בכל נקודת זמן.

לאחר מכן שלב את הנתונים כדי לחשב את העוצמה הממוצעת וסטיית התקן עבור אותות TMRM ו-Fluo 4. בניסוי זה, תאי 143B הוטענו מראש ב-Fluo 4 AM ו-TMRM לפני חדירה עם דיגיטונין. בעקבות כל תוספת של סידן כלורי, אות TMRM פוחת ככל שזרם יוני הסידן למיטוכונדריה מפזר את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית.

פוטנציאל ממברנה קטן ניכר לאחר מעבר חדירות שכן תוספת של 10 מיקרו-מולרי FCCP עדיין גורמת לקריסה של פוטנציאל הממברנה. כאן ריכוז הסידן המיטוכונדריאלי, המצוין על ידי אות Fluo 4, מתחיל לעלות לאחר תוספת הסידן הכלורי השנייה כאשר הסידן החופשי במדיה מגיע ל-0.32 מיקרומולר. כל תוספת של סידן כלורי לאחר מכן גרמה לעלייה הדרגתית בסידן המיטוכונדריאלי.

מוצגות כאן תמונות של מדידות סימולטניות של פוטנציאל הממברנה בסידן מיטוכונדריאלי. האות האדום מציין TMRM והאות הירוק מציין Fluo 4. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך כשעתיים אם היא מבוצעת כראוי.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד למדוד את רמות הסידן המיטוכונדריאלי ואת פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית בו זמנית במיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות תוספת של סידן אקסוגני לתאים החדירים. אל תשכח שעבודה עם FCCP ודיגיטונין עלולה להיות מסוכנת ביותר, ואמצעי זהירות כמו לבישת PPE תמיד צריכים לנקוט בעת ביצוע הליך זה.