Name: בידוד של עכבר רירית הרחם אפיתל סטרומה תאים עבור במבחנה Decidualization (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: חקור בידוד ותרבות של תאי אפיתל וסטרומה מרירית הרחם בעכברים ללימוד דצידואליזציה במבחנה. שיטה זו מאפשרת חקר אינטראקציות תאיות ומסלולי סיגנלינג ברפואה רבייתית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של הקרן למחקר-פלנדריה (FWO G.0856.13N) ומועצת המחקר של KU Leuven (OT / 13/113). KDC ממומן על ידי בלגיה FWO. AH ממומנת על ידי OT / 13/113. ברצוננו להודות מתקן Core תא הדמיה של KU Leuven (http://gbiomed.kuleuven.be/english/corefacilities/microscopy/cic/cic.htm) לשימושם של המיקרוסקופ confocal.

<ol><li>Cummings, A. M., Yochim, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+the+uterus+in+preparation+for+gestation%3A+a+model+for+the+action+of+progesterone%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of the uterus in preparation for gestation: a model for the action of progesterone.</a> J Theor Biol. 106 (3), 353-374 (1984).</li>
<li>Jabbour, H. N., Kelly, R. W., Fraser, H. M., Critchley, H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+regulation+of+menstruation%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Endocrine regulation of menstruation.</a> Endocr Rev. 27 (1), 17-46 (2006).</li>
<li>Wang, X., Matsumoto, H., Zhao, X., Das, S. K., Paria, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+signals+direct+the+formation+of+tight+junctional+permeability+barrier+in+the+decidualizing+stroma+during+embryo+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Embryonic signals direct the formation of tight junctional permeability barrier in the decidualizing stroma during embryo implantation.</a> J Cell Sci. 117 (Pt 1), 53-62 (2004).</li>
<li>Zygmunt, M., Herr, F., Munstedt, K., Lang, U., Liang, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+and+vasculogenesis+in+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Obstet+Gynecol+Reprod+Biol%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis and vasculogenesis in pregnancy.</a> Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 110 Suppl 1, S10-S18 (2003).</li>
<li>Power, M. L., Schulkin, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPower%2C+ML+%22The+evolution+of+the+human+placenta%22">The evolution of the human placenta</a>. , Johns Hopkins University Press. (2012).</li>
<li>Finn, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initiation+of+the+decidual+cell+reaction+in+the+uterus+of+the+aged+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Fertil%22%5BJournal%5D)">The initiation of the decidual cell reaction in the uterus of the aged mouse.</a> J Reprod Fertil. 11 (3), 423-428 (1966).</li>
<li>Grant, K. S., Wira, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+mouse+uterine+stromal+cells+on+epithelial+cell+transepithelial+resistance+%28TER%29+and+TNFalpha+and+TGFbeta+release+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of mouse uterine stromal cells on epithelial cell transepithelial resistance (TER) and TNFalpha and TGFbeta release in culture.</a> Biol Reprod. 69 (3), 1091-1098 (2003).</li>
<li>De Clercq, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+transient+receptor+potential+channels+in+human+endometrial+stromal+cells+during+the+luteal+phase+of+the+menstrual+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Functional expression of transient receptor potential channels in human endometrial stromal cells during the luteal phase of the menstrual cycle.</a> Hum Reprod. 30 (6), 1421-1436 (2015).</li>
<li>Pieper, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+vimentin+expression+in+cultured+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Regulation of vimentin expression in cultured epithelial cells.</a> Eur J Biochem. 210 (2), 509-519 (1992).</li>
<li>Greaves, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mouse+model+of+endometriosis+mimics+human+phenotype+and+reveals+insights+into+the+inflammatory+contribution+of+shed+endometrium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium.</a> Am J Pathol. 184 (7), 1930-1939 (2014).</li>
<li>Pierro, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal-epithelial+interactions+modulate+estrogen+responsiveness+in+normal+human+endometrium%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Stromal-epithelial interactions modulate estrogen responsiveness in normal human endometrium.</a> Biol Reprod. 64 (3), 831-838 (2001).</li>
<li>Kim, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progesterone-dependent+release+of+transforming+growth+factor-beta1+from+epithelial+cells+enhances+the+endometrial+decidualization+by+turning+on+the+Smad+signalling+in+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Progesterone-dependent release of transforming growth factor-beta1 from epithelial cells enhances the endometrial decidualization by turning on the Smad signalling in stromal cells.</a> Mol Hum Reprod. 11 (11), 801-808 (2005).</li>
<li>Chen, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coculturing+human+endometrial+epithelial+cells+and+stromal+fibroblasts+alters+cell-specific+gene+expression+and+cytokine+production%5BTitle%5D)+AND+%22Fertil+Steril%22%5BJournal%5D)">Coculturing human endometrial epithelial cells and stromal fibroblasts alters cell-specific gene expression and cytokine production.</a> Fertil Steril. 100 (4), 1132-1143 (2013).</li>
<li>Renaud, J., Martinoli, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Insert+Co-culture+System+of+Two+Cellular+Types+in+the+Absence+of+Cell-Cell+Contact%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact.</a> J Vis Exp. (113), (2016).</li>
<li>Arnold, J. T., Kaufman, D. G., Seppala, M., Lessey, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endometrial+stromal+cells+regulate+epithelial+cell+growth+in+vitro%3A+a+new+co-culture+model%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Reprod%22%5BJournal%5D)">Endometrial stromal cells regulate epithelial cell growth in vitro: a new co-culture model.</a> Hum Reprod. 16 (5), 836-845 (2001).</li>
<li>Park, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+well-defined+in+vitro+three-dimensional+culture+of+human+endometrium+and+its+applicability+to+endometrial+cancer+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">A well-defined in vitro three-dimensional culture of human endometrium and its applicability to endometrial cancer invasion.</a> Cancer Lett. 195 (2), 185-192 (2003).</li>
</ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Decidualization הוא הבידול תלוי פרוגסטרון של תאי סטרומה רירית רחם לתאי decidual עגולים והסתרתו. ב אדם, תהליך זה מתרחש באופן ספונטני במהלך שלב הלוטאלי של המחזור והוא יזם בתאים סטרומה סביב תאי כלי הדם כדי ליצור את predecidua. עם זאת, במכרסמים, הנוכחות של הבלסטוציסט היא הכרחית כדי לגרום decidualization. העובדה decidualization מתרחשת רק לאחר מגע עם תאי אפיתל רירית הרחם מרמז כי גורמים חשובים מופרשים על ידי תאי אפיתל לגרום decidualization ב stroma הבסיסית. למרות ההבדל הזה התנעת decidualization ראויה להכרה, העובדה decidualization אדם הופך להיות יותר חזק על השתלת עובר עולה כי מנגנונים דומים יכולים להיות מעורבים. במבחנה בתרביות תאים משמשים לעתים קרובות כדי לחקור את ההשפעה של מולקולות ספציפיות בתהליך decidualization.עם זאת, הזמינות והכמות של רקמה אנושית שניתן לגבות מוגבלת לעתים קרובות ומלווים וריאציות, למשל, מחזור שלב, מספר ההריונות ונוכחות של מחלות גינקולוגיות כמו אנדומטריוזיס או אדנומיוזיס. רבים של בעיות אלה ניתן למנוע על ידי שימוש ברקמה בעכברים כי הוא נגיש ושלב במחזור עצמאית. יתרון חזק נוסף של שימוש רקמות בעכברים הוא ההזדמנות להשתמש מכרסמים מהונדסים גנטי ואפשרות ההתקנה מספר רב של ניסויים. כרגע, פרוטוקולי בידוד שונים תוארו בספרות עם שונות גבוהות בעידן של החיות והתקופה בשלב הייחום ברגע השימוש. מחקר זה מציג שיטה חדשה תרבויות-שיתוף רירית הרחם העיקרי של סטרומה ותאי אפיתל שבו היתרון צולמה של מחזור הייחום מתוקנן זריקה יומית של אסטרוגן לפני הבידוד. יתר על כן, אסטרוגן הוא known לגרום התפשטות בתאי אפיתל סטרומה אשר מגדילה עוד יותר את התשואה לכל בידוד. פרוטוקול הבידוד המתואר במאמר זה התבסס על ואח גרנט. 7, לעומת זאת, צעדים אופטימיזציה נוספים נכללו כדי להגדיל את התשואה, טוהר, ואת הכדאיות של תרביות תאים השונות. ראשית, HBSS תמיד משלים עם אנטיביוטיקה כדי למנוע זיהום של התרבות העיקרית. במהלך הבידוד של MEEC, עיבוד טמפרטורה נעשה (15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס) כדי להגדיל את היבול של תאי אפיתל במהלך העיכול הראשון. הבא, צעד נוסף נכלל למתן הפעילות האנזימטית לאחר עיכול טריפסין על ידי הוספת בינוני המכיל FBS לעכב את פעילותו. יתר על כן, MEECs הועבר דרך פילטר של שבו הרשת הייתה גדולה יותר מה שמתואר בדרך כלל (100 מיקרומטר) כפי שהם באים בדרך כלל באשכולות ויריעות תא. יתר על כן, זיהום על ידי תאי סטרומה הופחת על ידי ביצוע רחבצעד itional שבו MEECs ו MESCs הופרדו מבוסס על שקיעה הכבידה. לבסוף, MEECs היו זורעים על coverslips מצופה קולגן להגדיל את הקובץ המצורף של תאים coverslips זכוכית, כפי שהתברר כי מצורף coverslips זכוכית ללא ציפוי או PLL מצופה היה מספיק. במהלך הבידוד של MESCs, collagenase (1 מ&quot;ג / מ&quot;ל) נוספה כדי לשפר את העיכול. יתר על כן, צעד עיכול זה בוצע בשני עותקים, כדי למנוע זיהום של MEECs נותר. כל פעולות נוספות הבאות הביאו תרבויות טהורות ובת קיימא של אוכלוסיות תאים הומוגנית. טוהר אוכלוסיית התא הוערך עם immunostaining ו qRT-PCR באמצעות vimentin כסמן סטרומה cytokeratin כסמן אפיתל. מובן כי דפוס ביטוי הפוך של vimentin ו cytokeratin נצפה MEEC ו המסקלין. עם זאת, ניתן להבחין כי הביטוי mRNA היחסי של vimentin ו cytokeratin דומה בתרבויות MEEC. similתוצאות ar מתפרסמות על ידי קבוצות מחקר אחרות, שבו תאי אפיתל בביטוי vimentin לרכוש תרבות 9. מה שחשוב יותר הוא ההבדל ביטוי חלבון בין vimentin ו cytokeratin כמו נצפתה stainings immunohistological של אוכלוסיות תאים שונות. immunostaining הזוגי הראה כי EECS היה חיובי עבור cytokeratin ו- ESC היה חיובי עבור vimentin. שימוש סמנים אלה immunostaining הוא שיטה הוקמה standardly משמש כדי לציין את סוגי התאים 10. למרות הרבה מחקר שבוצע על decidualization של המסקלין, אפשרי עדיין כי הנוכחות של תאי אפיתל מודל זה עשויה לשנות את התוצאות של decidualization. ראשית, הוכח שאם MEEC לגדול בשכבה בנוכחות בינוני המסקלין ממוזג או בסביבה שיתוף תרבות, בשכבה יש התנגדות חשמלית משופרת אפיתל תאי transepithelial (TEER), כתוצאה מגורמים המופרשים המסקלין 7. יתר על כן, פיירו et al. 11 סיפקו הוכחות לכך התפשטות אפיתל, מושפע 17β-אסטרדיול, עשוי להיות מתווכת על ידי גורמים המופרשים מתאי סטרומה, ולחילופין, תאי אפיתל יכול לשחרר גורמים לווסת סטרומה decidualization 12, 13. בסך הכל, זה ברור שסביבת שיתוף התרבות-סטרומה אפיתל מספקת מצב פיסיולוגי יותר המאפשר אינטראקציה ותקשורת paracrine. השיטה של culturing שני סוגי תאים שונים באמצעות מערכת שיתוף תרבות כנס שתוארה קודם לכן 14, 15 ו הותאמה לשימוש של תאים ראשוניים בעכברים. על ידי זיהוי של רמות ה- mRNA פרולקטין בתור מחוץ לקרוא decidualization, הטכניקה המתוארת יש לקריאה מתוך לשחזור מאוד עבור decidualization זמין ולאפשרזה ובכך בחקר היחסים אפיתל סטרומה במהלך decidualization. אותות paracrine בתיווך מן MEEC עשויים לשנות את היקף decidualization בתאים סטרומה. יתר על כן, המודל מאפשר אפנון ספציפי של הצד אפיתל ללא ישירות המשפיע על תאי סטרומה. לכן, זו התרבות המשותפת של MEEC ו המסקלין מציעה כלי מושלם כדי להעריך את ההשפעה של הורמונים, ציטוקינים, וכו &#39;על תאי אפיתל עם מחוץ לקרוא על decidualization סטרומה. יתרון נוסף של מערכת שיתוף תרבות זו הוא שהיא מאפשרת לחוקרים לחקור את מעורבותם של חלבון מסוים של תהליך decidualization כלשהי באחד משני אפיתל או תא סטרומה באמצעות תאים מבודדים מבעלי חיים מהונדסים. יתר על כן, טכניקה זו תהיה מועילה מאוד לחקור דבקה הבלסטוציסט להעריך האם גורמי paracrine מופרש מתא אפיתל בנוכחות של הבלסטוציסט מספיקים כדי לגרום decidualization של סטרומה הבסיסיתתאים. צעד חשוב הפלישה trophoblast בקורלציה השפלה מטריקס, אשר מתווכת על ידי פעולה של אנזימים פרוטאוליטים. הטכניקה המוצעת ניתן ליישם מודל במבחנה לחקור את ההצטלבות בין הבלסטוציסט, לתאי האפיתל ואת stroma תומך. עם זאת, כרגע מעט מאוד ידוע על מקורם של תאי אפיתל אשר יכול להיות גם לומינל כפי בלוטות. לכן, אפיון נוסף של הפרופיל הגנטי והמולקולרי של תאי אפיתל נדרש. בנוסף, השיטה המתוארת היא מוגבלת הידע הזמין על הקיטוב של תאי אפיתל. כרגע, הקיטוב של תאי אפיתל לא נלקח בחשבון. עם זאת, ההבדלים בביטוי של חלבונים בממברנה מתוארים ממברנות apical ואת הבסיס. הקיטוב לא ראוי של שכבת האפיתל יכול להשפיע על האינטראקציה paracrine בין epitheliאל ותאי סטרומה. עם זאת, שיטות להשיג תאי אפיתל מקוטבים התואר ויכולות להיכלל הטכניקה המתוארת 15, 16. בסך הכל, הפרוטוקול המתואר מציע טכניקת בהצלחה להקים בתרביות תאים ראשוניות של אפיתל עכבר רירית רחם ותאי סטרומה. טכניקה זו גורמת בתרביות תאים טהורות כפי שאושרה על ידי qRT-PCR ו immunostaining של vimentin ו cytokeratin. בסופו של דבר, גידול אפיתל סטרומה שיתוף תרבות הוצגה המאפשר חקירת אותות paracrine בתיווך או MEEC ו / או המסקלין בתהליך decidualization.

רירית הרחם האנושית הוא הציפוי הפנימי של הרחם עובר מחזורים חודשיים של התמוטטות ותיקון כהכנת הריונות אפשריים. הוא מורכב בשכבה אחת של תאי אפיתל המצפים את לומן הרחם ואת stroma הבסיסית אשר משתנה עובי פי תנודות של אסטרוגן הורמונים בשחלות ופרוגסטרון. בשלב הלוטאלי, עלייתו פרוגסטרון postovulatory תהיה להשרות התמיינות של תאי סטרומה רירית רחם אל, תאי decidual עגולים גדולים, תהליך הנקרא decidualization 1, 2. ב אדם, תופעה זו מתרחשת באופן ספונטני כדי ליצור את predecidua, אבל הופך בולט יותר על השתלת העובר. תוצאה תפקודית של decidualization היא שהרחם זמני הופך פתוח השתלה עוברת. מרווח זה מסומן כמו &quot;החלון של השתלה&quot;. במהלך התקופה המוקדמת של השתלה עוברת, דואר decidualizedתאי ndometrial סטרומה סביב עובר ההשתלה יספקו מחסום למנוע המעבר של חומרים מזיקים לעובר 3. במהלך הריון, decidua זו תספק חומרי הזנה עבור העובר המתפתח לפני placentation שקרה, ובהמשך תהווה את החלק האימהי של השליה 4. שיקולים אתיים ומעשיים להגביל את העיצוב של מחקרים בבני אדם כדי לחקור את תהליך decidualization ו יש הנחיות השימוש במודלים של בעלי חיים. להיות חבר בקבוצת placentation hemochorial, האנדומטריום של מכרסמים יעבור גם decidualization לפני placentation 5. במכרסמים, לעומת זאת, תחילת תהליך decidualization תלוי בנוכחות של blastocysts לומן הרחם, המציין כי גירוי נוסף יש צורך יפעיל את התגובות decidual 6. זה מתווה תקשורת מורכבת שבין הדואר רירית רחם אפיתל תאים שיש קשר ישיר עם הבלסטוציסט, ואת בתאי סטרומה הבסיסיים. אף על פי כן, decidualization יכול להיגרם באופן מלאכותי באמצעות גירויים כמו גירוד מכאני או ההחדרה של שמן רחם דרוך הורמונלית. למרות שמחקרי in vivo באמצעות מודלי decidualization מלאכותיים אפשרו לנו לשפר את תובנה שלנו בתהליך האיתות המורכב של decidualization, המחקרים מעמיקים מכניסטית, למשל, חקירת התקשורת ההכרחית בין תאי אפיתל סטרומה, מוגבלת. לכן, במבחנה מחקרים decidualization ניתן להשתמש כדי לתפעל מסלולים חשובים וללמוד תהליכים בסיסיים. לשם כך, תרביות תאי סטרומה רירית רחם עיקריות ניתן להגדיר מ רירית רחם אדם או מכרסמים. העסקת מכרסמים מסכימה השימוש בבעלי חיים מהונדסים גנטית כדי לחקור את התפקיד של חלבון מסוים של עניין בתהליך decidualization. עם זאת, לא בוגר, prepuberעכברי ty משמשים לעתים קרובות כדי למנוע סיבוכים של מחזור הייחום, בעוד שבמקרים אחרים uteri נאסף מכל שלבי מחזור הייחום, שתוצאתה ההטרוגניות התרבויות. יתר על כן, בתהליך של decidualization נחקר פרוטוקולים שונים, למשל, על ידי (i) הורמונים וישלימו (אסטרוגן, פרוגסטרון או monophosphate אדנוזין המחזורי (cAMP)) למדיום culturing, או על ידי (ii) בידוד של תאי decidual מעכברים בבית יום 4.5 של (פסאודו) הריון, אשר הביקוש להם צורך נוסף לבדיקת תקע וזכרים שעוקרים. מגבלות אלו האחרונות ממחישות את הצורך של שיטה סטנדרטית ללמוד decidualization במבחנה. במחקר זה, מודל פיסיולוגי לבחון במבחנת decidualization החל מבוגר, שאינם (פסאודו) עכברות הרות יוצגו. בשיטה זו, זריקה יומית של 17β-אסטרדיול (E2) תניע תרבות תאים של רירית רחם, ותוצאה היא תשואה מוגברת של הומוגנית pאוכלוסיות תאי יור. יתר על כן, השימוש של מערכת coculturing מאפשר לימוד של crosstalk-סטרומה אפיתל היכולת לתפעל את תהליך decidualization ברמות שונות.

<table><tbody><tr><td>הכנסת תרבית רקמות ThinCert ל-24 צלחות באר; 1 ומיקרו; גודל נקבוביות m; </td> תוספות <td>שקיפות של Greiner Bio-one</td><td>662610</td><td>מסופקות גם עבור צלחות מרובות אחרות ו/או גדלי נקבוביות אחרים. ספקים אחרים: Merck Millipore. https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/ 0110_0110_0090_0030/13408/&nbsp;</td></tr><tr><td>תרבית תאים Nunc טופלה 24 צלחות באר</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/142475</td></tr><tr><td>8-Bromoadenosine 3&prime;,5&prime;-מלח נתרן מונופוספט מחזורי</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B7880</td><td>הכן תמיסת מלאי של 100 מ"מ במי Milli Q. אחסן את הכמות בטמפרטורה של -20 &deg;C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b7880?lang=en&region=BE&nbsp; </td></tr><tr><td>מדרוקסי פרוגסטרון 17-אצטט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>M1629</td><td>הכן תמיסת מלאי של 250 ומיקרו; M באתנול. אחסן את הכמות ב-20 &deg;C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1629?lang=en&region=BE&nbsp; </td></tr><tr><td>שמן ארכיס</td><td>סופרמרקט</td><td></td><td>שמן ארכיס לבישול סטנדרטי שניתן למצוא בכל סופרמרקט משמש</td></tr><tr><td>מגיב כדאיות תאים PrestoBlue</td><td>Thermo Scientific</td><td>A13261</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13261?ICID=cvc-prestoblue-c1t1</td></tr><tr><td>HBSS 1x, ללא סידן, ללא מגנזיום, ללא פנול אדום</td><td>Gibco</td><td>14175-046</td><td>שומרים במקרר זמן רב ככל האפשר. השתמש ב-HBSS+ קר במהלך הפרוטוקול. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14175046&nbsp; </td></tr><tr><td>17-ובטא; אסטרדיול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>E8875</td><td>הכן תמיסת מלאי של 1 מ"ג/מ"ל ב-EtOH לפני דילול בשמן ארכיס (1:1,000). http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e8875?lang=en&amp; region=BE</td></tr><tr><td>מסנן בינוני תא Stericup, 0.22 ומיקרו; m, פוליאתרסולפון, 500 מ"ל,</td><td>Merck Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td>http://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Stericup-GP%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-500%C2%A0mL%2C-radio-sterilized,MM_NF-SCGPU05RE</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (5,000 יח'/מ"ל)</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15070063?ICID=search-15070-063</td></tr><tr><td>DMEM/F12, פנול אדום, L-גלוטמין, HEPES</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11330057?ICID=search-11330-057 סרום בקר עוברי, מאושר, מומת בחום, מאושר על ידי האיחוד האירופי, מקור דרום אמריקה</td><td>Gibco</td><td>10500-056</td><td></td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10500064?ICID=search-10500-064 אמפוטריצין B</td><td>Gibco</td><td>15290-018</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15290018?ICID=search-15290-018</td></tr><tr><td>ג'נטמיצין (50 מ"ג/מ"ל)</td><td>Gibco</td><td>15750-037</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15750037?ICID=search-15750-037</td></tr><tr><td>DMEM, גלוקוז נמוך, פירובט, ללא גלוטמין, ללא פנול אדום</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>D5921</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5921?lang=en&region=BE</td></tr><tr><td>MCDB-105</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6395</td><td>יש לדלל במי Milli Q, להתאים את ה-pH ל-7 עם NaOH ולסנן לפני השימוש. אחסן בחושך. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6395?lang=en&region=BE&nbsp; </td></tr><tr><td>אינסולין מלבלב בקר</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1882</td><td></td></tr><tr><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i1882?lang=en&region=BE כיסויים, זכוכית, 18 מ"מ ואוסלאש;</td><td>Glaswarenfabrik Karl Hecht</td><td>1001/18</td><td>http://www.hecht-assistant.de/187/?L=1&tx_rmproducts_pi1[g]=937 & tx_rmproducts_pi1[p]=3504 & tx_rmproducts_pi1[v]=20088 & cHash=abd12065683fe74b00eaa 5e562824d06</td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p2636?lang=en&region=BE קולגנאז מסוג IA מ-Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2674</td><td></td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2674?lang=en&region=BE-DPBS</tr><tr><td>, ללא סידן, ללא מגנזיום</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14190094?ICID=search-14190-094</td></tr><tr><td>טריפסין מלבלב בקר</td><td>סיגמא אולדריץ</td>' <td>T7409</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7409?lang=en&region=BE</td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.05%), פנול אדום</td><td>ג'יבקו</td><td>25300-054</td><td>יש לחמם לטמפרטורת החדר לפני השימוש. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25300054?ICID=search-25300-054&nbsp; </td></tr><tr><td>מסננת תאים, 40 ומיקרו; m mesh, חד פעמי</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680</td></tr><tr><td>מסננת תאים, 100 ומיקרו; m רשת, חד פעמי</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680</td></tr><tr><td>יחידת מסנן מזרק Millex-GP, 0.22&nbsp; ומיקרו; M, פוליאתרסולפון, 33&nbsp; mm,</td><td>עיקור גמא Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Millex-GP-Syringe-Filter-Unit%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-33%C2%A0mm%2C-gamma-sterilized,MM_NF-SLGP033RS?bd=1</td></tr><tr><td>חומצה אצטית (קרחון) 100%</td> <td>Merck Millipore</td><td>1.00063</td><td>https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Acetic-acid-%28glacial%29-100%25,MDA_CHEM-100063</td></tr><tr><td>קולגן I</td><td>קורנינג&nbsp;</td><td>354236</td><td>מזנב עכברוש. https://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-BR/Shopping/ProductDetails.aspx?categoryname=&amp; productid=354236%28 Lifesciences%29#&nbsp; </td></tr><tr><td>פנקראטין מלבלב חזיר</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3292</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3292?lang=en&region=BE</td></tr><tr><td>35 מ"מ כלי תרבית רקמות, פוליסטירן, בז BD סטרילי</td><td></td><td>353001 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4675630</td><td></td></tr><tr><td>אתנול מוחלט AnalaR NORMAPUR ACS, Reag. Ph. Eur. מגיב אנליטי</td><td>VWR כימיקלים</td><td>20821296</td><td></td></tr><tr><td>https://uk.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=20821.310DP ארנב חד שבטי וימנטין אנטי אנושי (D21H3)&nbsp;</td><td>טכנולוגיית איתות סלולרית</td> <td>#5741</td><td>השתמש ב-1/500. http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/vimentin-d21h3-xp-rabbit-mab/5741 </td></tr><tr><td>עכבר חד שבטי אנטי אנושי ציטוקרטין&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2562</td><td>השתמש ב-1/1,000. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2562?lang=en&amp; region=BE</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde Solution, 4% ב-PBS</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td>http://www.affymetrix.com/catalog/130621/USB/Paraformaldehyde+Solution+4+percent+in+PBS#1_1</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIAL/X100?lang=en&region=BE&gclid= Cj0KEQjwhN-6BRCJsePgxru9iIw BEiQAI8rq 879lESeuIU4N4AEQRLNEXj4f 8z65KkD-q8Xr35sQDRgaAp-k 8P8HAQ</td></tr><tr><td>סרום עיזים</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g9023?lang=en&region=BE עיזים נגד ארנב Alexa Fluor 488</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>A-11034</td><td>http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=488&amp; resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& searchMode=keyword& productTypeSelect=antibody& targetTypeSelect =antibody_secondary& species=ltechall&keyword= 488#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;; generic6:^\%22Oryctolagus%20cuniculus\%22$;; צימודים:^\%22Alexa%20Fluor& reg;%20488\%22$;;</td></tr><tr><td>עיזים נגד עכבר Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-11032</td><td>http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=594&amp; resultPage=1& resultsPerPage=15& autocomplete=& priorSearchTerms=& searchMode=keyword& productTypeSelect=antibody& targetTypeSelect= antibody_secondary& species=ltechall& keyword=594#filters=genericsort2: \%22Capra%20hircus\%22;; כללי6:^\%22Mus%20musculus\%22$;;</td></tr><tr><td>מדיום הרכבה VECTASHIELD עם DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>http://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium-with-dapi.html</td></tr><tr><td>DPBS, עם סידן ומגנזיום</td><td>Gibco</td><td>14040174</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133</td></tr></tbody></table>

בידוד של עכבר רירית הרחם אפיתל סטרומה תאים עבור<em&gt; במבחנה</em&gt; decidualization

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Decidualization הוא תהליך התמיינות תלוי פרוגסטרון של תאי סטרומה רירית רחם הוא תנאי הכרחי להשתלת עובר מוצלחת. למרות מאמצים רבים נעשו כדי לחשוף את המנגנון הבסיסי של decidualization, האיתות המדויקת בין תאי אפיתל כי נמצאים בקשר עם העובר ואת בתאי סטרומה הבסיסיים נותרה הבינה היטב. לכן, לומד decidualization באופן שלוקח הוא אפיתל ותאי סטרומה בחשבון יכול לשפר את הידע שלנו לגבי הפרטים המולקולריים של decidualization. לשם כך, במודלים vivo של decidualization מלאכותית פיזיולוגית הרלוונטי ביותר; עם זאת, מניפולציה של תקשורת בין תאית מוגבלת. נכון לעכשיו, בתרבויות במבחנה של תאי סטרומה רירית רחם נמצא בשימוש כדי לחקור את האפנון של decidualization ידי מספר מולקולות איתות. כמקובל, תאי סטרומה אדם או עכבר רירית רחם הםמְשׁוּמָשׁ. עם זאת, את הזמינות של דגימות אנושיות לעתים קרובות מאוד מוגבלת. יתר על כן, השימוש ברקמות murine מלווה במגוון בשיטת culturing. מחקר זה מציג שיטה תוקפת סטנדרטית להשיג תא רירית רחם אפיתל טהור (EEC) ו- Cell סטרומה (ESC) תרבויות באמצעות עכברים שלמים מבוגרים שטופלו באסטרוגן במשך שלושה ימים רצופים. הפרוטוקול הוא מותאם כדי לשפר את התשואה, כדאיות, וטוהר של התאים הוארך נוסף על מנת ללמוד decidualization בתוך coculture של EEC ו- ESC. מודל זה עשוי להיות מתאים כדי לנצל את החשיבות של שני סוגי תאים decidualization וכדי להעריך את התרומה של מולקולות איתות משמעותי המופרשים EEC או ESC במהלך תקשורת בין תאית.

סקירה כללית של פרוטוקול איור 1 א ממחיש סקירה כללית של הפרוטוקול. זריקה יומית של E2 (100 ng) במשך שלושה ימים רצופים שמשה לסנכרן החיות ולתקנן את השלב של מחזור הייחום. מחזור הייחום ניתן להעריך על ידי lavages בנרתיק מחולק proestrus, ייחום, diestrus והפאזה metestrus. שלב המחזור יכול להיקבע בהתאם ליחס של תאי desquamated ב השטיפה, אשר חשופים לשינויים הורמונליים. הגדלת רמות של אסטרוגן תגרום החיות להתפתח לשלב ייחום. בשלב זה ניתן לאתר בקלות על ידי נוכחות של תאי אפיתל cornified בלעדי והיעדר לויקוציטים (איור 1B). ביום 4, uteri של חיות שנמצאות בשלב ייחום נאספים MEEC ו המסקלין מבודדים (תרשים 1C). ג Decidualizationלהיגרם על ידי הוספת 0.5 מ&quot;מ cAMP ו -1 מיקרומטר MPA למדיום FBS 2% במהלך תקופת הדגירה של 5 ד. בקרת איכות של תרבויות MEEC ו המסקלין טוהר בתרביות תאים ראשוניים ניתן להעריך על ידי ההבדל ביטוי vimentin ו cytokeratin. Vimentin הוא סיבי ביניים אשר באה לידי ביטוי בתאים mesenchymal, ומכאן בתאי סטרומה רירית הרחם. Cytokeratin הוא סיבי ביניים נמצא שלד התא של רקמות אפיתל. איור 2 א מראה את רמת ביטוי mRNA של vimentin ו cytokeratin ב MEEC ו המסקלין הוערכה באמצעות qRT-PCR. רמות vimentin עשירות המסקלין ודלות MEEC (2.2x גבוה, p &lt;0.001), בעוד שרמות cytokeratin עשירות MEEC ודל המסקלין (36x גבוה, p &lt;0.001). Vimentin / צביעה כפולה cytokeratin בוצעה וציינה כי תאי סטרומה להביע vimentin ואילו epitתאים helial להביע cytokeratin (תרשים 2B, C). העדר נוגדן ראשוני שימש כביקורת שלילית עבור immunostaining (איור 2 ד, ה). stainings immunohistological אלה מראים כי הן בתרביות תאים של רירית הרחם (MEEC ו המסקלין) יש טוהר של עד 90%. Decidualization ב MEEC / המסקלין cocultures לאחר בידוד, עכבר תאי רירית רחם סטרומה היו זורעים במערכת שיתוף התרבות לחקות את הסביבה של רירית הרחם. תאים בתרבית עד לתאי האפיתל נוצרו בשכבה של כנס תרבית תאים (ערכי TEER של 800 - 1,000 / טוב), ואת בתאי סטרומה הגיעו למצב תת ומחוברות. Decidualization הושר תאי סטרומה עם היישום של 0.5 המ&quot;מ cAMP ו -1 מיקרומטר MPA. לאחר חמישה ימים של דגירה, רמות ה- mRNA פרולקטין הוערכו בתאים סטרומה ידי qRT-PCR משום אינדיקציה decidualization (איור 3 א). רמות הפרולקטין היו מבוטאות בכמות גבוהה בתאים נתונים ההורמונים nondetectable בתאים מודגרות עם מדיום הביקורת (p &lt;0.01). מאחר ותאי אפיתל קשים לדמיין בתוך מוסיף תרבית תאים, assay כדאית בוצעה מייד לאחר תקופת הדגירה של חמישה ימים (איור 3 ב). שילוב של מדיום גידול רגיל ריאגנט כדאיות נוסף הבארות וטופח במשך תקופה של 8 מינימאלי - h 12. מעבר צבע מכחול ורוד בהיר הצביע על הנוכחות של תאי אפיתל קיימא. ראוי לציין, כי שינוי הצבע יתרחש רק כאשר תאי קיימא נוכחים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55168/55168fig1.jpg" /> איור 1: סקירה כללית של הפרוטוקול. (א) תכנית של פרוטוקול הבידוד מתחילה עם שלושימים רצופים של זריקות אסטרוגן. ביום 3, צריכות להיות מוכנות את ההכנות הדרושות. ביום 4, שלב ייחום מוערך (מסומן על ידי כוכב) על ידי ביצוע שטיפה וגינלית. המסקלין ו MEEC מבודדים באמצעות צעדי עיכול שונים. ביום 6, או כאשר תאים הם ומחובר, יכול להיגרם decidualization במערכת שיתוף התרבות ידי הוספת cAMP ו MPA הבינוני תקופת דגירה של חמישה ימים (יום 6 - 11). (ב) תמונה מייצגת של השלב ייחום מאופיין בנוכחות של תאים cornified אפיתל של שטיפה וגינלית (בהגדלה 10X). (C) תמונה מייצגת של המסקלין ו MEEC (בהגדלה 20X, סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55168/55168fig2.jpg" /> <stron<html> g&gt; איור 2: Immunostaining וכמותי RT-PCR עבור vimentin ו Cytokeratin ב MEEC ו המסקלין. (א) רמות RNA שליח ביטוי vimentin ו cytokeratin כדי לציין את הטוהר של תרבויות. רמות RNA כומתו יחסית לממוצע הגיאומטרי של גנים משק ACTB ו TBP. נתונים הוצגו כממוצע ± SEM. Vimentin / צביעה כפולה cytokeratin על תרבויות המסקלין (B) ותרבויות MEEC (C). הכנס ב משמאל מראה נוף בהגדלה 63X. בקרה שלילית עם נוגדן ראשוני השמיט עבור המסקלין (ד) ו MEEC (E) (סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר). ***: P &lt;0.001 עם ANOVA דו כיוונית עם תיקון Bonferroni למבחנים מרובים. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> EP-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55168/55168fig3.jpg" /> איור 3: תיקוף Decidualization באמצעות RT-PCR. (א) רמות mRNA ביטוי פרולקטין בתאי סטרומה להעריך decidualization. רמות RNA כומתו יחסית לממוצע הגיאומטרי של גנים משק PGK1 ו TBP. השינוי לקפל בתאים בתרבית בשליטה או בינוני decidual מוצג ממוצע ± SEM. (ב) תמונות להמחשה של תאי סטרומה לפני (למעלה) ואחרי גירוי decidualization (למטה). את הכנס מימין ממחיש בהגדלה של תא סטרומה decidualized. Decidualization מאופיין בנוכחות של תאים multinucleated, שמסומן על ידי חיצים שחורים. (ג) נציג תמונות של הערכה של כדאיות התא האפיתל את הכנס לאחר assay. התמונות צולמו מיד לאחר מתן של מגיב הכדאיות (Prestoblue) (0 ח) ואת following הבוקר (אונ). **: P &lt;0.01 עם מאן-ויטני מבחן U. ON: לילה. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55168/55168fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

מחקר זה מציג שיטה סטנדרטית ומאומתים עבור בידוד והתרבות של סטרומה רירית הרחם העכבר העיקרי ותאי אפיתל, אשר ניתן להשתמש בהם במערכת coculture ללמוד decidualization במבחנה.

בידוד של עכבר רירית הרחם אפיתל סטרומה תאים עבור<em&gt; במבחנה</em&gt; Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

המטרות הכלליות של הליך זה הן בידוד ותרבית של תאי אנדומטריום ראשוניים של עכבר, תאי סטרומה ותאי אפיתל, לצורך תרבית משותפת (co-culture) למחקר של דצידואליזציה (decidualization) במבחנה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום רפואת הרבייה, כגון מהו הסיגנלינג הפראקריני בין תאי אפיתל לתאי סטרומה במהלך תהליכים חשובים כמו דצידואליזציה ופלישת טרופובלסט, וכיצד מוסדר נתיב סיגנלינג זה. ניתן להשתמש בטכניקות אלו כדי לחקור את תהליך הדצידואליזציה במערכת של תרבית משותפת של תאי אפיתל וסטרומה.באמצעות מערכת זו, ניתן להעריך האם מולקולות איתות המופרשות על ידי אחד משני התאים יכולות להשפיע על תהליך זה. לפני קצירת הרחם, בצעו בדיקת משטח נרתיקי כדי לבדוק את שלבי המחזור של בעלי החיים, במטרה לבחור רק עכברים שנמצאים בשלב ה-estrus.כפי שמאופיין על ידי נוכחות של תאי אפיתליום של הקרנייה בשטיפת הנרתיק. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה ובמספריים כדי לפתוח את בטן החיה הראשונה בשלב ה-estrus והסיטו את המעיים הצידה כדי להנחית את שתי קרנות הרחם בשדה הראייה. אחזו באחת הקרנות בקצה הדיסטלי ביותר, מתחת לחצורה, והפרידו את רקמת הרחם מהחצורה באמצעות פינצטת דיסקציה ופינצטת Dumont מספר 5 כדי להסיר את הרקמות השומניות והמחברות.לאחר מכן, הסירו את הקרן בקצה הדיסטלי, מעל גוף הרחם. לאחר הסרת קרני הרחם, הניחו אותן בצלחת פטרי של 35 מילימטר עם שלושה מיליליטר של HBSS. כאשר כל קרני הרחם נאספו, העבירו את הצלחת מתחת למיקרוסקופ סטריאוסקומי, והשתמשו בפינצטה כדי להסיר שאריות של רקמות שומן ורקמות חיבור.לאחר מכן, באמצעות פינצטה Dumont מספר 5, פינצטת דיסקציה ומספרי קפיץ קטנים, פתחו את קרני הרחם לאורכן כדי לחשוף את הלומן שלהן, ושטפו את הרקמות בצלחת פטרי חדשה המכילה HBSS טרי. כעת, העבירו את כל הקרניים למבחנה של 15 milliliter המכילה pancreatin ו-trypsin. דגרו את הרקמות במצב אופקי למשך 60 דקות בטמפרטורה של 4 °C ובמהירות של 50 rpm על שייקר אורביטלי.בסיום השעה, העבירו את המבחנה לסביבת העבודה לדגירה אופקית למשך 45 דקות ללא ניעור, ולאחר מכן לדגירה אופקית למשך 15 דקות ללא ניעור במבן מים בטמפרטורה של 37 °C. בסיום הדגירה במבן המים, שפכו בזהירות את הנוזל העליון והעבירו את הרחמים לפטריה המכילה מצע גידול קר לתאי אפיתל של אנדומטריום של עכבר למשך חמש דקות כדי לנטרל את פעילות הטריפסין. לאחר מכן, העבירו את הרקמות למבחנה של 15 mL המכילה 3 mL של HBSS קר, ובצעו וורטקס לרקמות למשך 10 שניות כדי לשחרר את שכבות האפיתל.לאחר מכן, שטפו את הרחמים בצלחת פטרי חדשה המכילה 3 mL של HBSS טרי, ואספו שתי תלויות נוספות של דפי אפיתליום לשתי מבחנות של 15 mL חדשות, כפי שהודגם זה עתה. לאחר ערבול (vortex) שלישי של הרקמה, העבירו את הרחמים למבחנה קונית של 15 mL המכילה תערובת עיכול של תאי סטרומה אנדומטריאליים של עכבר לדגירה של 30 דקות ב-37 °C וב-200 rpm. השגיחו את דפי האפיתליום על ידי העברה עדינה של שלוש תלויות התאים דרך רשת ניילון של 100 micron באמצעות פיפטה כדי להסיר שיירי רקמה, ולאחר מכן בצעו סנטריפוגציה של תליית התאים שהתקבלה.שחזר את המשקע ב-12 מיליליטר של מצע גידול לתאי אפיתל של רירית הרחם בעכבר תוך ערבוב יסודי, ולאחר מכן המתן חמש דקות להסדרת התמיסה כדי להפריד את תאי הסטרומה הנותרים של רירית הרחם של העכבר באמצעות כוח הכבידה. בסיום השקיעה, השתמש בפיפטה של חמישה מיליליטר כדי להסיר בזהירות את שני המיליליטרים העליונים של הנוזל העליון (supernatant), וסבב במרכזפוגה את התאים שנאספו. לאחר מכן, שחזר את משקע תאי האפיתל של העכבר במצע גידול לאפיתל באמצעות פיפוט עדין.העבירו את התאים ל coverslips מצופים בקולגן בצפיפות המתאימה לאנליזה המתוכננת בהמשך. לאחר בידוד התאים האפיתליאליים, המשיכו עם התאים הסטרומליים והוציאו מהאינקובטור את מבחנת עיכול התאים הסטרומליים של העכבר עם הרחמים. לאחר ד incubaton של 30 דקות, כפי שהודגם כעת, נערו בעדינות את המבחנה ביד למשך 10 שניות, והעבירו את הרחמים לפטריה המכילה 3 mL של HBSS בטמפרטורה של 4 °C.שטפו היטב את הרקמות, לאחר מכן הוסיפו שלושה מיליליטר של מצע גידול לתאי סטרומה למבחנת העיכול כדי לנטרל את פעילות ה-trypsin, והעבירו את הרחמיים למבחנה קונית של 15 מיליליטר המכילה שלושה מיליליטר של מצע גידול טרי לתאי סטרומה של אנדומטריום של עכבר. נערו בעדינות את מבחנת הרקמה למשך 10 שניות. לאחר מכן, העבירו את הרחמיים לצלחית עם HBSS קר, ולאחר מכן העבירו אותם למבחנה חדשה של 15 מיליליטר עם מצע גידול לתאי סטרומה.לאחר שטיפה שלישית של הרקמה והעברה, דגרו את רקמות הרחם בתערובת עיכול טרייה של תאי סטרומה של אנדומטריום של עכבר למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 degree celsius. בסיום העיכול, העבירו את תרחיפי התאים משפחור אחת עד שלוש ואת שפחור ה-trypsin דרך רשת ניילון של 40 micron ושטפו את הרשת עם חמישה milliliters נוספים של מצע גידול לתאי סטרומה של אנדומטריום של עכבר. לאחר מכן, אספו את התאים באמצעות סנטריפוגציה.יש להשעות מחדש את המשקע במצע טרי לתאי סטרומה של רירית הרחם של עכבר, לצורך זריעה על לבישי כיסוי מצופים בפוליליזין בצפיפות המתאימה לאניליזה המתוכננת בהמשך. ניתן להעריך את טהרת תרביות התאים הראשוניות על פי ההבדלים בביטוי הווימנטין והציטוקרטין, שכן רמות הווימנטין גבוהות בתאי סטרומה של רירית הרחם של עכבר ונמוכות בתאי אפיתל של רירית הרחם של עכבר, בעוד שרמות הציטוקרטין גבוהות בתאי אפיתל של רירית הרחם של עכבר ונמוכות בתאי סטרומה של רירית הרחם של עכבר.צביעה כפולה של mentin/cytokeratin מדגימה עוד יותר את הביטוי של mentin על ידי תאי הסטרומה, וכן את הביטוי הבלעדי של cytokaratin על ידי התאים האפיתליאליים. השראת דצידואליזציה בתרביות תאי סטרומה באמצעות יישום של cyclic adenosine monophosphate ו-MPA, חושפת כי רמות ה-MRNA של פרולקטין עולות באופן דרמטי לאחר חמישה ימי טיפול בהשוואה לתרביות תאי סטרומה של ביקורת. מכיוון שקשה להדמות את התאים האפיתליאליים במערכות השתלה של תרביות תאים (cell culture inserts), ניתן לבצע בדיקת חיוניות מיד לאחר סימולציית דצידואליזציה של חמישה ימים, כאשר שינוי צבע מכחול לוורוד בהיר מעיד על נוכחותם של תאים אפיתליאליים חיוניים.בעקבות טכניקה זו, ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון בדיקות היצמדות של בלאסטוציסט, כדי להעריך האם גורמים המופרשים על ידי התאים האפיתליאליים בנוכחות בלאסטוציסט יכולים להשרות דצידואליזציה של תאי הסטרומה.

isolation-mouse-endometrial-epithelial-stromal-cells-for-vitro

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

היכולת של תאים עובריים נבטי להתמיין לתאי נבטי קדמוני בשלבי הפיתוח המוקדמים הוא מודל מושלם לכתובת ההשערה שלנו לגבי סרטן פוריות. פרוטוקול זה מראה כיצד לבודד תאים נבטי קדמוני של בלוטות המין המתפתחות 10.5-11.5 ימים coitum עוברים לפרסם העכבר.

בידוד גזירת תאים עובריים בעכבר ז&#39;רמינל

תרבית תאים העיקרית היא טכניקה שימושית לניתוח אוכלוסיות מסוימות של תאים, במיוחד מעוברי עכבר מהונדסים בשלבי התפתחות ספציפיים. בזאת, חדרי לב עובריים הם גזורים וניתקו, וחרוזים נוגדנים מצומדות לזהות ולהפריד את תאי האנדותל לניתוח נוסף.

בידוד של תאי האנדותל חדרית עובריים

הקמת מערכות עיקריות של רירית הרחם סטרומה תא תרבות מדגימות כריתת רחם היא טכניקת ערך ביולוגית וצעד חיוני לקראת רודף מגוון רחב של מחקר שואף. כאן, אנו מתארים שתי שיטות המשמשות להקמת תרבויות סטרומה מרקמות של רירית הרחם שעברו כריתה כירורגית של חולים אנושיים.

שתי שיטות לקביעת אדם תאי רירית הרחם סטרומה ראשיים מדוגמאות כריתת הרחם

פרוטוקול זה מדגים שיטת הבידוד של תאים אנושיים decidual הראשית שנאסף בקרום עוברי של המונח placentae אשר יכול לשמש למגוון רחב של יישומים (קרי immunocytochemistry, cytometry זרימה, וכו ') מכוון ללמוד את התפקיד של אוכלוסיות תאים שונים בסיבוכים בהריון.

בידוד של ראשי תאים Decidual האנושי בקרום עוברי של המונח Placentae

מחקר זה מציג שגרה מאומת וממוטב עבור הבידוד של התרבות האנושית תאי סטרומה רירית הרחם לנהל במבחנה decidualization assay. יתרה מזאת, מחקר זה מספק שיטה מפורט ביעילות תמונות ציפורים גנים ספציפיים באמצעות siRNAs בתאי סטרומה רירית הרחם אדם.

לבידוד של תאי סטרומה רירית הרחם אדם במבחנה Decidualization

במאמר זה נתאר את השיטה ליצירת מודל דצידואליזציה מלאכותית באמצעות עכבר השחלות, ניסוי נשירת רירית הרחם הקלאסי בתחום המחקר של נשירת רירית הרחם.

יצירת מודל דצידואליזציה מלאכותית של עכבר עם כריתת שחלות למחקר דצידואליזציה של רירית הרחם

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיות לביסוס אורגנואידים אפיתליאליים של רירית הרחם של עכברים לביטוי גנים וניתוחים היסטולוגיים.

הקמת אורגנואידים 3D רירית הרחם מרחם העכבר

מחקר זה מציג מודל עכבר חדש שתוכנן במיוחד כדי לדמות אנדומטריומה, תת-סוג משמעותי קלינית של אנדומטריוזיס. על ידי שימוש בעכברי C57BL/6J, המודל שואף להבהיר את המנגנונים הפתופיזיולוגיים העומדים בבסיס אי פוריות הקשורה לאנדומטריומה, ומציע כלי מעודן לגשר על פער הידע הנוכחי ברפואת הרבייה.

הקמת מודל עכברי ניסיוני של אנדומטריומה כדי לחקור את אי הפוריות הקשורה אליה

מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט לייצור רירית רחם דקה אמינה וניתנת לשחזור עם שיעור תמותה נמוך מאוד והידבקויות תוך רחמיות מינימליות על ידי הזרקת 95% אתנול לרחם העכבר תוך 1-3 דקות.

הקמת מודל עכבר של רירית רחם דקה

אנו מתארים שיטות לבידוד תאי סומטיקה של שחלות העכבר מחלק מועשר בסטרומה של השחלה וליצירת אורגנואידים סומטיים של שחלות העכבר בגישה ללא פיגומים.

חקירת מיקרו-סביבת השחלות: שיטות לבידוד, תרבית דו-ממדית ותרבות אורגנואידית של תאי סומטיקה בשחלות בעכברים

חקור בידוד ותרבות של תאי אפיתל וסטרומה מרירית הרחם בעכברים ללימוד דצידואליזציה במבחנה. שיטה זו מאפשרת חקר אינטראקציות תאיות ומסלולי סיגנלינג ברפואה רבייתית.

בידוד של עכבר רירית הרחם אפיתל סטרומה תאים עבור

גלה סרטונים נוספים