בידוד של עכבר רירית הרחם אפיתל סטרומה תאים עבור

המטרות הכלליות של הליך זה הן בידוד ותרבית של תאי אנדומטריום ראשוניים של עכבר, תאי סטרומה ותאי אפיתל, לצורך תרבית משותפת (co-culture) למחקר של דצידואליזציה (decidualization) במבחנה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום רפואת הרבייה, כגון מהו הסיגנלינג הפראקריני בין תאי אפיתל לתאי סטרומה במהלך תהליכים חשובים כמו דצידואליזציה ופלישת טרופובלסט, וכיצד מוסדר נתיב סיגנלינג זה. ניתן להשתמש בטכניקות אלו כדי לחקור את תהליך הדצידואליזציה במערכת של תרבית משותפת של תאי אפיתל וסטרומה.

באמצעות מערכת זו, ניתן להעריך האם מולקולות איתות המופרשות על ידי אחד משני התאים יכולות להשפיע על תהליך זה. לפני קצירת הרחם, בצעו בדיקת משטח נרתיקי כדי לבדוק את שלבי המחזור של בעלי החיים, במטרה לבחור רק עכברים שנמצאים בשלב ה-estrus.

כפי שמאופיין על ידי נוכחות של תאי אפיתליום של הקרנייה בשטיפת הנרתיק. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה ובמספריים כדי לפתוח את בטן החיה הראשונה בשלב ה-estrus והסיטו את המעיים הצידה כדי להנחית את שתי קרנות הרחם בשדה הראייה. אחזו באחת הקרנות בקצה הדיסטלי ביותר, מתחת לחצורה, והפרידו את רקמת הרחם מהחצורה באמצעות פינצטת דיסקציה ופינצטת Dumont מספר 5 כדי להסיר את הרקמות השומניות והמחברות.

לאחר מכן, הסירו את הקרן בקצה הדיסטלי, מעל גוף הרחם. לאחר הסרת קרני הרחם, הניחו אותן בצלחת פטרי של 35 מילימטר עם שלושה מיליליטר של HBSS. כאשר כל קרני הרחם נאספו, העבירו את הצלחת מתחת למיקרוסקופ סטריאוסקומי, והשתמשו בפינצטה כדי להסיר שאריות של רקמות שומן ורקמות חיבור.

לאחר מכן, באמצעות פינצטה Dumont מספר 5, פינצטת דיסקציה ומספרי קפיץ קטנים, פתחו את קרני הרחם לאורכן כדי לחשוף את הלומן שלהן, ושטפו את הרקמות בצלחת פטרי חדשה המכילה HBSS טרי. כעת, העבירו את כל הקרניים למבחנה של 15 milliliter המכילה pancreatin ו-trypsin. דגרו את הרקמות במצב אופקי למשך 60 דקות בטמפרטורה של 4 °C ובמהירות של 50 rpm על שייקר אורביטלי.

בסיום השעה, העבירו את המבחנה לסביבת העבודה לדגירה אופקית למשך 45 דקות ללא ניעור, ולאחר מכן לדגירה אופקית למשך 15 דקות ללא ניעור במבן מים בטמפרטורה של 37 °C. בסיום הדגירה במבן המים, שפכו בזהירות את הנוזל העליון והעבירו את הרחמים לפטריה המכילה מצע גידול קר לתאי אפיתל של אנדומטריום של עכבר למשך חמש דקות כדי לנטרל את פעילות הטריפסין. לאחר מכן, העבירו את הרקמות למבחנה של 15 mL המכילה 3 mL של HBSS קר, ובצעו וורטקס לרקמות למשך 10 שניות כדי לשחרר את שכבות האפיתל.

לאחר מכן, שטפו את הרחמים בצלחת פטרי חדשה המכילה 3 mL של HBSS טרי, ואספו שתי תלויות נוספות של דפי אפיתליום לשתי מבחנות של 15 mL חדשות, כפי שהודגם זה עתה. לאחר ערבול (vortex) שלישי של הרקמה, העבירו את הרחמים למבחנה קונית של 15 mL המכילה תערובת עיכול של תאי סטרומה אנדומטריאליים של עכבר לדגירה של 30 דקות ב-37 °C וב-200 rpm. השגיחו את דפי האפיתליום על ידי העברה עדינה של שלוש תלויות התאים דרך רשת ניילון של 100 micron באמצעות פיפטה כדי להסיר שיירי רקמה, ולאחר מכן בצעו סנטריפוגציה של תליית התאים שהתקבלה.

שחזר את המשקע ב-12 מיליליטר של מצע גידול לתאי אפיתל של רירית הרחם בעכבר תוך ערבוב יסודי, ולאחר מכן המתן חמש דקות להסדרת התמיסה כדי להפריד את תאי הסטרומה הנותרים של רירית הרחם של העכבר באמצעות כוח הכבידה. בסיום השקיעה, השתמש בפיפטה של חמישה מיליליטר כדי להסיר בזהירות את שני המיליליטרים העליונים של הנוזל העליון (supernatant), וסבב במרכזפוגה את התאים שנאספו. לאחר מכן, שחזר את משקע תאי האפיתל של העכבר במצע גידול לאפיתל באמצעות פיפוט עדין.

העבירו את התאים ל coverslips מצופים בקולגן בצפיפות המתאימה לאנליזה המתוכננת בהמשך. לאחר בידוד התאים האפיתליאליים, המשיכו עם התאים הסטרומליים והוציאו מהאינקובטור את מבחנת עיכול התאים הסטרומליים של העכבר עם הרחמים. לאחר ד incubaton של 30 דקות, כפי שהודגם כעת, נערו בעדינות את המבחנה ביד למשך 10 שניות, והעבירו את הרחמים לפטריה המכילה 3 mL של HBSS בטמפרטורה של 4 °C.

שטפו היטב את הרקמות, לאחר מכן הוסיפו שלושה מיליליטר של מצע גידול לתאי סטרומה למבחנת העיכול כדי לנטרל את פעילות ה-trypsin, והעבירו את הרחמיים למבחנה קונית של 15 מיליליטר המכילה שלושה מיליליטר של מצע גידול טרי לתאי סטרומה של אנדומטריום של עכבר. נערו בעדינות את מבחנת הרקמה למשך 10 שניות. לאחר מכן, העבירו את הרחמיים לצלחית עם HBSS קר, ולאחר מכן העבירו אותם למבחנה חדשה של 15 מיליליטר עם מצע גידול לתאי סטרומה.

לאחר שטיפה שלישית של הרקמה והעברה, דגרו את רקמות הרחם בתערובת עיכול טרייה של תאי סטרומה של אנדומטריום של עכבר למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 degree celsius. בסיום העיכול, העבירו את תרחיפי התאים משפחור אחת עד שלוש ואת שפחור ה-trypsin דרך רשת ניילון של 40 micron ושטפו את הרשת עם חמישה milliliters נוספים של מצע גידול לתאי סטרומה של אנדומטריום של עכבר. לאחר מכן, אספו את התאים באמצעות סנטריפוגציה.

יש להשעות מחדש את המשקע במצע טרי לתאי סטרומה של רירית הרחם של עכבר, לצורך זריעה על לבישי כיסוי מצופים בפוליליזין בצפיפות המתאימה לאניליזה המתוכננת בהמשך. ניתן להעריך את טהרת תרביות התאים הראשוניות על פי ההבדלים בביטוי הווימנטין והציטוקרטין, שכן רמות הווימנטין גבוהות בתאי סטרומה של רירית הרחם של עכבר ונמוכות בתאי אפיתל של רירית הרחם של עכבר, בעוד שרמות הציטוקרטין גבוהות בתאי אפיתל של רירית הרחם של עכבר ונמוכות בתאי סטרומה של רירית הרחם של עכבר.

צביעה כפולה של mentin/cytokeratin מדגימה עוד יותר את הביטוי של mentin על ידי תאי הסטרומה, וכן את הביטוי הבלעדי של cytokaratin על ידי התאים האפיתליאליים. השראת דצידואליזציה בתרביות תאי סטרומה באמצעות יישום של cyclic adenosine monophosphate ו-MPA, חושפת כי רמות ה-MRNA של פרולקטין עולות באופן דרמטי לאחר חמישה ימי טיפול בהשוואה לתרביות תאי סטרומה של ביקורת. מכיוון שקשה להדמות את התאים האפיתליאליים במערכות השתלה של תרביות תאים (cell culture inserts), ניתן לבצע בדיקת חיוניות מיד לאחר סימולציית דצידואליזציה של חמישה ימים, כאשר שינוי צבע מכחול לוורוד בהיר מעיד על נוכחותם של תאים אפיתליאליים חיוניים.

בעקבות טכניקה זו, ניתן לבצע שיטות נוספות, כגון בדיקות היצמדות של בלאסטוציסט, כדי להעריך האם גורמים המופרשים על ידי התאים האפיתליאליים בנוכחות בלאסטוציסט יכולים להשרות דצידואליזציה של תאי הסטרומה.