ניתוח Synaptic אפנון של תסיסנית קולטני אור לאחר חשיפה לאור ממושך

המטרה הכוללת של הליך ניסיוני זה היא להבין דינמיקה סינפטית בתא עצב בודד בתנאי הפעלה שונים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הפלסטיות הסינפטית כגון חשיפת שינויים בהרכב המולקולרי של סינפסות עם הבשלת פעילות הנוירון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת ניתוח אוטומטי למחצה של היבטים מרובים של סינפסות, כולל מספרן, תפוצתן ורמת ההעשרה של רכיבים מולקולריים לאחר סינפסות.

לצורך ניסוי זה, אספו את הזבובים לבקבוקונים רגילים תוך שש שעות מרגע האקלוזיה. טען את בקבוקוני האיסוף למתלה אקרילי שקוף. בחממה קטנה המוגדרת ל-25 מעלות צלזיוס, מקם את המתלה במרחק מדויק מלוח LED שבו החשיפה לאור היא בממוצע 1000 לוקס.

לאחר מכן, זבובים מאחור במשך יום עד שלושה ימים תוך שימוש באחד מהתנאים הבאים, או חושך קבוע, 12 שעות אור ואחריהם 12 שעות חושך, או אור קבוע. מאוחר יותר, נתחו וצבעו את המוחות באמצעות טכניקות סטנדרטיות. כדי להרכיב את מוח הזבוב, טען מיקרופיפט עם מדיום הרכבה והפקיד שתי טיפות של 2 מיקרוליטר במרכז שקופית מיקרוסקופ במרחק של כ -2 ס"מ זה מזה.

הנח החלקת כיסוי על כל טיפה ואת הפער בין כ-0.2 מ"מ. לאחר מכן הפקידו 15 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה מעל החלקות הכיסוי ולתוך הפער. תחת מיקרוסקופ מנתח, הפקידו את המוח ברווח מהמיקרופיפט.

ואז מקם את המוח, צד הגחון כלפי מעלה. לבסוף, צרף פתק כיסוי ואטום אותו לאורך הקצוות בעזרת לק שקוף. לאחר מכן ניתן לדמות את המוחות באמצעות טכניקות סטנדרטיות כדי לשחזר תמונות תלת מימד.

במקרה זה, זוהר GFP מתועד בתאים עם ביטוי Brp פעיל בשיטת הכוכב. גם בדוגמה זו, אקסונים קולטני אור R7 ו-R8 עברו חיסון עם אנטיציאופטין, שנצפה באמצעות נוגדנים משניים מתויגים RFP. כדי לכמת את המספר, ההפצה ורמת הדה-לוקליזציה של Brp GFP puncta העומס הראשון שחזר תמונות תלת מימד של המוח שנעשו מערימות תמונות.

Brp puncta מוצגים בלבן. כעת, מצא את אזור העניין. במקרה זה, המסופים של אקסון R8 ממוקמים על ידי מעקב אחר דילול האקסונים החיוביים אנטיציאופטין בנקודת הכניסה לשכבת המדולה M3.

בכל מסוף אקסון R8 זהה את פונקטה Brp GFP באמצעות מודול זיהוי נקודתי. בחר הוסף נקודות חדשות ולאחר מכן בחר אזור עניין של פלח בלבד בהגדרות האלגוריתם. לאחר הגדרת אזור הניתוח, הגדר את ערוץ המקור ל-Brp GFP ולאחר מכן הגדר את קוטר ה-XY המשוער ל-0.35 מיקרון.

ואז, סמן את חיסור הרקע בזיהוי הנקודתי. לאחר מכן, בחר איכות כסוג המסנן, והפונקטה מסוננת אוטומטית. השלם שלב זה על-ידי לחיצה על סיום.

חזור על שיטת זיהוי הנקודה עבור כל האקסונים R8 במערך הנתונים. האזור הבא שיש לזהות הוא ציטופלזמה של האקסון. ראשית, צור אובייקטים על פני השטח עם פונקציית פני השטח.

לאחר מכן, בחר הוסף משטחים חדשים, ותחת הגדרות האלגוריתם, החלף את אזור העניין של פלח השוק בלבד. כעת, בחר ידנית את אזור העניין. לאחר מכן, הגדר את היקפי החישוב.

כדי למצוא את ערוץ קולטני האור כמקור, בחרו באפשרות ההחלקה. עבור הסף, בחר עוצמה מוחלטת. הפעל את האפשרות פיצול נגיעה באובייקטים.

הגדר את קוטר נקודות המושב ל-0.5 מיקרון והשתמש בהגדרות ברירת המחדל של המסנן לאיכות ומספר הווקסלים. לאחר מכן המסנן מוחל אוטומטית. כעת, עבור לעריכה ומחיקה של פיסות המשטח שנוצרו מחוץ לאזור העניין.

במקרה זה, האקסונים האחרים. לאחר חזרה על זיהוי אזור האקסון עבור כל האקסונים R8 במערך הנתונים, כל האקסונים Brp puncta ו-R8 מזוהים כקבוצה של אובייקטים נקודתיים. והאזורים הציטופלזמיים המתאימים מזוהים כאובייקטים על פני השטח.

כעת, המשך על ידי הגדרה ידנית של הכיוון והמרחב של כל אקסון. זה חשוב לכימות מאוחר יותר של צפיפות Brp GFP לאורך כל נוירון בנוירופיל המדולה. לשם כך, הגדר תחילה את נקודות ההתחלה ונקודות הסיום שלהם.

בחרו 'הוסף נקודות מדידה חדשות', ולאחר מכן בחרו 'עריכה' ולאחר מכן בחרו 'בחר משטח של עצם' כדי לעבוד עם החלק העליון של האובייקטים על פני השטח. כדי להגדיר את נקודות ההתחלה, הצב נקודות מדידה על כל אובייקטי פני השטח של אקסוני R בשכבת M1. מקם את הנקודות הללו בסדר שיטתי הניתן לשחזור.

לאחר מכן, הגדירו את נקודות הקצה. בחר הוסף נקודות מדידה חדשות, ערוך ומשטח של אובייקט שוב. לאחר מכן, חוזרים על אותו סדר שיטתי, מקמו נקודות מדידה בתחתית האקסונים R בשכבת M3.

כדי לכמת את עוצמת הרקע של Brp, נתח את האזורים הציטופלזמיים של שני אקסונים R7. בחר הוסף משטחים חדשים והגדר באופן ידני את האזור של אקסון R7 כפי שנעשה עבור אקסוני R8. השתמש בהגדרות זהות למעט אל תפעיל את האפשרות אפשר פיצול נגיעה באובייקטים.

עזוב את זה. לאחר מכן, הוסף אובייקט כתמי דמה בתוך אזור אקסון R7 מוגדר. בחר הוסף נקודות חדשות, ובחר דלג על יצירה אוטומטית וערוך ידנית.

לאחר מכן, בחר מרכז האובייקט ולחץ על אובייקט פני השטח כדי למקם את אובייקט נקודות הדמה בתוך אקסון R7. כעת, חזור על שלבי זיהוי פני השטח והנקודה עבור אקסון R7 שני. ואז הגדר את נקודות ההתחלה והסיום של אקסוני R7 כפי שנעשה עם אקסוני R8.

לצורך ניתוח זה, הקפד להתקין את התוכנה הנכונה. פתח את מערך הנתונים המכיל את נתוני הספוט, נתוני המשטחים ושני אובייקטים של נקודות מדידה, שכל אחד מהם מכיל את אותו מספר נקודות מדידה. בדוק את הנתונים.

שני האובייקטים של נקודת המדידה חייבים להיות בעלי אותו מספר נקודות מדידה כדי שהחישובים יפעלו. לאחר הגדרת הנקודות, אזורי האקסון ונקודות ההתחלה והסיום, הפעל את התוסף. ראשית, בדוק את המטא נתונים, במיוחד את גודל הווקסל.

פתח את מאפייני התמונה מהעריכה, ולאחר מכן בדוק את 3 הממדים של הווקסל והמיקרון תחת קואורדינטות בגיאומטריה. לאחר מכן, בחר ערוץ לניתוח העוצמה. במקרה זה, נבחר הערוץ המציג את Brp GFP.

לאחר מכן הגדר את שם הקובץ עבור התוצאות. לאחר מכן, הגדירו את מספר הסלים כ-10, והגדירו את אורך האקסון ל-100%לאחר מכן הגדירו את אזורי הפונקטה על ידי הגדרת רדיוס הנקודה ל-0.35 מיקרון ואת האזור הציטופלזמי שמסביב ל-50 מיקרון. לבסוף, בצע את פקודת זיהוי הסינפסות, ומאוחר יותר, נתח סטטיסטית את הפלט.

בעקבות הפרוטוקולים המתוארים, נותחו פונקטות Brp GFP בסינפסות R8 של זבובים שנחשפו לחושך קבוע, אור קבוע או מחזור אור/חושך רגיל. מספר הפונקטה של Brp הצטמצם משמעותית בקולטני האור R8 של זבובים שנשמרו באור קבוע. התפלגות הפונקטה חושבה באמצעות תוסף מותאם אישית.

סינפסות R8 היו מפוזרות לאורך כל הפיר האקסונלי מ-M1 לשכבת M3, אך צפיפותן הייתה גבוהה יותר בשכבות M1 ו-M3. באופן דומה, חושבו רמות הדה-לוקליזציה של הפונקטה. הם לא השתנו בכל התנאים, אולם רמות הדה-לוקליזציה של Brp GFP היו שונות מדיווחים אחרים, כמו Brp-short-cherry שנוטרל בבירור באור מתמיד.

יתכן שיש עיבוד לא הולם של השבר הקצר Brp לאחר פירוק מה- AZ. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לנתח תכונות פלסטיות סינפטיות בנוירון יחיד. תכונות פלסטיות כאלה כוללות את מספר הסינפסות, תפוצתן ותווית ההעשרה של רכיב מולקולרי ספציפי לאחר הסינפסות.