הדמיה של תא חי ו 3D הניתוח של אנגיוטנסין קולטן סוג סחר 1a בתאי הכליה טרנספקציה אדם העוברי באמצעות מיקרוסקופ Confocal
27 במרץ 2017
כאן אנו מציגים פרוטוקול תאים התמונה להביע קולטנים 1a סוג אנגיוטנסין-tagged חלבון פלואורסצנטי ירוק במהלך אנדוציטוזה ביוזמת טיפול אנגיוטנסין II. טכניקה זו כוללת lysosomes תיוג עם סמן פלואורסצנטי שני, ולאחר מכן ניצול תוכנה לנתח את שיתוף הלוקליזציה של הקולטן ליזוזום בשלושה ממדים לאורך זמן.
המטרה הכללית של ניסוי זה היא להשיג ראיות מרחביות וזמניות כמותיות לקולוקליזציה של קולט אנגיוטנסין מסוג 1 עם ליזוזומים לאחר טיפול באנגיוטנסין 2. שיטה זו תוכננה כדי לזהות הבדלים בעיבוד התת-תאי של קולטנים מסוג Y לעומת קולטנים מוטגנים, במהלך תהליך ההפנמה המתרחש בתגובה לגירוי של ליגנד. היתרונות של טכניקה זו הם שדימיון של תאים חיים מונע ארטיפקטים הנובעים מתאים מקובעים ומחדירים באמצעות דטרגנטים, וכי ניתן להעריך שינויים דינמיים במיקום הקולטן בזמן אמת.
התחילו בבחירת עדשה מתאימה בעוצמה מספרית של 1.4 ומרכזו של העדשה מעל שולחן המיקרוסקופ. הוסיפו טיפה של שמן טבילה בעל צמיגות גבוהה ופלואורסצנציה עצמית נמוכה על העדשה, והעבירו את התא עם התאים שעברו טרנספקציה אל שולחן המיקרוסקופ. הרימו בעדינות את העדשה עד שהשמן נוגע בבסיס השקופית הראשונה ואתר את התאים העמומים.
כאשר תא בריא בעניין נמצא במרכז שדה הראייה, עברו למצב קונפוקלי ואשרו כי התא פרוס היטב, כאשר הצד הוונטרלי שלו צמוד לשכבת הכיסוי. פתחו את תיבת הדו-שיח Z Stack, לחצו על Live, התמקדו בחלקו העליון של התא, ולאחר מכן לחצו על Begin. לאחר מכן, התמקדו בחלקו התחתון של התה, הזינו גודל צעד Z של 1.00 micrometer, ולחצו על End.
לאחר מכן, בחרו במצב XYZT תחת הגדרות הרכישה (Acquisition settings) בחלק העליון. לבסוף, הגדירו את מרווחי הזמן לסריקה ואת משך זמן הסריקה כדי לצפות במיקוד של Angiotensin Type 1A Receptor המסומן ב-GFP אל הליזוזומים. כדי להתחיל את גירוי הליגנד, הוסיפו שלוש מיקרוליטרים של תמיסת מלאי 100 X של ליגנד לבאר המצולמת, ולחצו על Start כדי לצלם את התגובה בתלת-ממד למשך התקופה ובתדירות הרצויות.
כדי לנתח את תמונות התאים החיים, פתחו את התוכנה המתאימה לכימות תמונות תלת-ממדיות. בפרוטוקול זה, Velocity. לחצו קליק ימני בתוך שדה התמונה ובחרו ב-Properties.
הזינו את מאפייני פיקסלי התמונה המתאימים עבור צירים XY ו-Z ליצירת רצף מדידות לניתוח של עוצמות התא והשלפושיות של הרצפטור המסומן ב-GFP בתגובה לטיפול בליגנד. תחת תפריט ה-2D, בחרו במצב מיקוד מורחב (extended focus) כדי לצפות בתא. לאחר מכן, השתמשו בכלי הגדרת האזור החופשי (freestyle region tool) כדי לצייר אזור עניין סביב התא, ולחצו קליק ימני על התמונה כדי לבחור ב-Crop to Selection.
פריט תמונה חדש ייווצר. לחצו על שם התמונה כדי לבחור את תמונת התא החתוכה ולפתוח את לשונית המדידה. כדי למדוד את ביטוי ה-GFP של הוסיקולות שהופנמו, גררו את Find Objects מתוך Finding אל תיבת הרצף שלמעלה.
הגדירו את ערוץ איתור האובייקטים ל-GFP ופתחו את סמל ההגדרות כדי לקבוע את הסף באמצעות סטיית תקן ואת הגבול התחתון לשש, כדי לבחור אובייקטים בעלי עצימויות ה-GFP הגבוהות ביותר. הגדירו את גודל האובייקט המינימלי לאפס מיקרומטרים מעוקב. לאחר מכן, לחצו על "measure" ובחרו את הערוצים ואת סוגי המדידות.
כדי להגדיר את סף החיתוך (thresholding) והמסננים לזיהוי התא השלם ולמדידת עוצמת ה-GFP הכוללת, גררו תיבת Find Objects שנייה. לאחר מכן, הגדירו את הערוץ של Find Objects ל-GFP והגדירו את סטיית התקן לאפס, כדי לבחור אובייקטים עם כל עוצמת GFP, ואת הגודל המינימלי של האובייקט לשני מיקרומטרים מעוקב. גררו את Filter Population לתיבת Find Objects השנייה של ה-Population ובחרו נפח של מיקרומטרים מעוקב, הגדול מ-100, כדי לבחור את התא השלם ולהסיר את כל האובייקטים הקטנים יותר.
לאחר מכן, בחרו ב-measurements ובפריט Make Measurement, כדי לבצע מדידה בכל נקודות הזמן. כדי לנתח את ביטוי ה-GFP שנמדד בוותיקולות ובכל התא לאורך זמן, לחצו על שם קובץ פריט המדידה מתחת לשם התמונה. כדי לחלץ את הנתונים עבור GFP ווותיקולות מתוך סך הנתונים, פתחו את הלשונית raw ובחרו ב-population one.
לאחר מכן, פתחו את לשונית הניתוח (analyzed), לחצו לחיצה ימנית על הנתונים ובחרו ב-analysis, ולאחר מכן ב-restricting analysis כדי לבחור באוכלוסייה אחת (population one). כדי למדוד את כמות ה-GFP בתא כולו, שנו את שניהם לאוכלוסייה שתיים (population two). תחת Analyze These Data ו-Summarized By, בחרו ב-sum GFP color channel וב-sum.
לאחר מכן, תחת Organize the data by, ובשורת row, בחרו ב-time point. כדי לחלץ את הנתונים עבור כמות ה-GFP בליזוזומים, תחת Find Objects עבור אוכלוסייה אחת, הגדירו את ערוץ find objects לערוץ האדום. בסמל הגלגל בתוך תיבת הדו-שיח, הגדירו את ה-threshold using ל-standard deviation, את הגבול התחתון (lower limit) ל-6, כדי לבחור אובייקטים אדומים בעצימויות הגבוהות ביותר, ואת הגודל המינימלי של האובייקט (minimum object size) ל-0.017 micrometers cubed.
בחרו את המדידות, וצרו פריט מדידה, כדי לבצע מדידה בכל נקודות הזמן. כדי לנתח את ביטוי ה-GFP שנמדד בליזוזומים, לחצו על שם קובץ פריט המדידה מתחת לשם התמונה. בחרו ב-population one תחת לשונית raw, ולאחר מכן בחרו ב-population one, ב-sum GFP color channel וב-sum תחת לשונית analyze, תוך לחיצה ימנית כפי שבוצע קודם לכן, כדי למדוד את כמות ה-GFP בבעבועות האדומות.
לפני גירוי באמצעות ליגנד, קולטני אנגיוטנסין מסוג 1A המסומנים ב-GFP ממוקמים בעיקר בממברנה של הפלזמה. אך בתוך 2.5 דקות מהוספת אנגיוטנסין 2, קולטנים אלו עוברים אינטרנליזציה, יוצרים שלפוחיות בהירות ומאוחר יותר מצטברים לשלפוחיות פרא-נוקליאריות גדולות. ה-ruffling המושרה על ידי אנגיוטנסין 2 מקשה על הכמות של עוצמת ה-GFP הכוללת בשלפוחיות, כפי שנראה בנתוני מדידת ביטוי GFP מייצגים אלה.
סינון לפי גודל אינו מבדיל בין הרפלים (ruffles) הגדולים לבין שלפוחיות בצביריים, אך הוא חושף כי GFP באובייקטים קטנים יותר עולה מוקדם יותר מאשר GFP באובייקטים גדולים יותר. בקו זמן מייצג זה של ביטוי GFP ללא מיקוד אוטומטי, GFP הפנימי נמדד כאחוז מ-GFP התאי הכולל. ניתוח של סך ה-GFP בתוך התא גילה כי בתא זה לא התרחש דהייה פוטוכימית (photo bleach) משמעותית לאורך זמן.
כימות ה-GFP בליזוזומים של תאים שעברו טרנספקציה מעיד גם על כך שהעוצמה של קולטן אנגיוטנסין מסוג 1A (Angiotensin Type 1A Receptor) הנוכח בליזוזומים אינה משתנה עד 24 דקות לאחר מתן אנגיוטנסין 2. במהלך הליך זה, חשוב לזכור לנטר את בריאות התאים לפני ובמהלך ההדמיה; מכיוון שההליך דורש זמן רב, יש להפסיק את הניסוי אם תרביות התאים אינן תקינות בכל דרך שהיא. בעקבות הליך זה, ניתן להשתמש בצביעה אימונוהיסטוכימית וב-FRET או FLIM כדי לזהות ולאשר את הלוקליזציה התת-תאית של הקולטנים.
ניתן לבצע Western blots כדי לבחון את זהותם ואת השינויים במולקולות הסיגנל המעורבות במהלך תנועת הרספטורים (receptor trafficking). לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן ביצוע דימיון ואנליזה של תאים חיים למדידת תהליך התגיימות (targeting) של רספטורים טרנס-ממברנליים המונחים על ידי ליגנד אל ליזוזומים וכן אל תאים תת-תאיים אחרים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לדימוי של תאים המבטאים קולטני אנגיוטנסין מסוג 1a המסומנים בחלבון פלואורסצנטי ירוק במהלך אנדוציטוזה המושרה על ידי טיפול באנגיוטנסין II. השיטה מאפשרת ניתוח בזמן אמת של קולוקליזציה בין הקולטן לליזוזום.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביולוגיה של התא
- מדעי המוח
- מיקרוסקופיית פלואורסצנציה
רקע
- קולטני אנזיוטנסין מסוג 1 ממלאים תפקיד מכריע באיתות תאי.
- הבנת האנדוציטוזה של רצפטורים היא חשובה להבהרת התגובות התאיות לליגנדים.
- טכניקות של דימות בזמן אמת יכולות לספק תובנות לגבי תהליכים תאיים דינמיים.
- שיטות קודמות עלולות להחדיר ארטיפקטים המסיסים את ההתנהגות התאית האמיתית.
מטרת המחקר
- להשגת ראיות מרחביות וזמניות כמותיות לקולוקליזציה של רצפטור-ליזוזום.
- להשוואת תהליכי ההפנמה של רצפטורים מסוג בר (wild-type) ורצפטורים מוטנטיים.
- לשיפור ההבנה של דינמיקת הרצפטורים בתאים חיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דימוי תאים חיים באמצעות עדשה בעלת מפתח מספרי גבוה.
- שימוש בשמן טבילה לשיפור איכות הדימוי.
- סימון פלואורסצנטי של ליזוזומים למעקב אחר מיקום הרצפטורים.
- ניתוח תוכנתי להערכת קו-לוקליזציה תלת-ממדית.
תוצאות עיקריות
- דימוי בזמן אמת לוכד ביעילות את הדינמיקה של הרספטורים.
- נצפו הבדלים בהפנמה (internalization) בין רספטורים מסוג פרא (wild-type) לרספטורים מוטנטיים.
- קו-לוקליזציה של רספטורים וליזוזומים כוונטה באופן מוצלח.
- הטכניקה ממזערת ארטיפקטים הקשורים לתאים מקובעים.
מסקנות
- פרוטוקול זה מספק שיטה חסונה לחקר אנדוציטוזה של רצפטורים.
- דימות בזמן אמת עשוי לחשוף תובנות קריטיות לגבי מנגנוני איתות תאיים.
- לממצאים עשויות להיות השלכות על הבנת תפקוד הרצפטורים בהקשרים ביולוגיים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימוי של תאי חיים של תנועת רצפטורים מאפשר הערכה כמותית ובזמן אמת של דינמיקה סוב-תאית המושרית על ידי ליגנד, ובכך מפחית ארטיפקטים הנובעים מקיבוע ותומך בהסרת סיכונים מכניסטיים בשלבי תיקוף מוקדמים של המטרה. גישה זו מספקת ביטחון חיזוי בהתנהגות הרצפטור, ומסייעת בקבלת החלטות go/no-go בזיהוי מובילים (leads) ובבחירת מודלים פרה-קליניים. באמצעות לכידת נתוני קולוקליזציה מרחביים וזמניים, היא מחזקת את הרציפות התרגומית משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בחינת היפותזות טיפוליות באמצעות ויזואליזציה בזמן אמת של התפנמות קולטנים (receptor internalization) ותעתוע ליזוזומי (lysosomal trafficking) בתגובה לגירוי באמצעות ליגנד.
- ערך תפעולי: ביטול ארטיפקטים של קיבוע המטשטשים את מיקום הקולטנים בממברנה, ובכך שיפור מהימנות הנתונים לצורך תיקוף המטרה (target validation).
- ערך ניבוי: כימות הקולוקליזציה (colocalization) של קולטן-ליזוזום לאורך זמן להערכת קינטיקת התעתוע ותמיכה בבדיקה פנוטיפית של וריאנטים של קולטנים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: הכנת מערכות תאי HEK-293 שעברו תיקוף ומבטאים רצפטורים המסומנים ב-EGFP, עבור תהליכי עבודה סטנדרטיים וניתנים לשחזור של דימוי תאים חיים.
- פלט כמותי: הפקת מדידות מבוססות ווקסל בתלת-ממד של עוצמת הרצפטור בתוך וסיקולות וליזוזומים לאורך זמן, המאפשרות הערכה של השפעת תרכובות.
- יכולת הרחבה: תמיכה בפלטפורמות של דימוי עתיר תוכן (high-content imaging) באמצעות פרמטרי רכישה מוגדרים (Z-step, מרווח זמן, גודל ווקסל) וסגמנטציה אוטומטית.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מידול של תעבורת רצפטורי אנגיוטנסין במערכת תאים אנושית כדי לספק מידע לאסטרטגיות של מודולציה של מטרות קרדיווסקולריות.
- ביומארקר תרגומי: קישור הצטברות ליסוזומלית של רצפטורים לתוצאות של איתות במורד המסלול, לתמיכה במודלים פרה-קליניים המותאמים לביומארקרים.
- קידום מותאם סיכונים: שימוש בקינטיקה של התעבורה כדי לתעדף וריאנטים של רצפטורים או ליגנדים עם פרופילים korzystים של עיבוד סוב-צלול.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה ועד לזיהוי המוליך, ומספקת נתונים כמותיים ודינמיים המנחים את ההערכה הפרה-קלינית המוקדמת של תפקוד הרצפטור.
- ביולוגיה של גילוי: תמיכה בבדיקת השערות לגבי מנגנוני תעבורה של רצפטורים והבהרת מסלולים באמצעות ויזואליזציה בזמן אמת של התפנימיות (internalization) המושרה על ידי Ang II.
- סריקה: הבטחת מוכנות של הבדיקה באמצעות פרמטרים סטנדרטיים של טרנספקציה, צביעה ודימות המבטיחים זיהוי הדיר ושל ליזוזומים באופן הדיר.
- אנליטיקה: אספקת תוצאות כמותיות של עוצמת GFP בתוך וסיקולות של רצפטורים ובליזוזומים, מנורמלות ל-GFP תאי כולל, לצורך השוואת תנאים לאורך נקודות זמן שונות.
- מחקר תרגומי: קישור נתוני דימוי של תאים חיים לרצף פרה-קליני על ידי חיבור מיקום הרצפטור לתוצאות פונקציונליות במערכות רלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: ביסוס פלטפורמת דימוי הניתנת לשימוש חוזר למחקרי תעבורה של GPCR על פני מספר מטרות וקווי תאים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: הגברת הביטחון החזוי בהתנהגות הרספטור על ידי מזעור ארטיפקטים של קיבוע ולכידה של אירועי תעבורה (trafficking) דינמיים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של פרוטוקולי דימוי ואנליזה בין צוותים, לשיפור השחזוריות של נתוני לוקליזציה סוב-צלולרית.
- ערך אסטרטגי: מתן אפשרות לקבלת החלטות go/no-go מבוססות נתונים באופטימיזציה של מובילים (lead optimization), באמצעות חשיפת הבדלים בעיבוד הרספטור בין וריאנטים מסוג בר (wild-type) לווריאנטים מוטנטיים.
- השפעה על הפורטפוליו: תמיכה בתעדוף מותאם סיכונים של מועמדים המכוונים לרספטורים, בהתבסס על קינטיקת תעבורה מאומתת ומעורבות ליזוזומלית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרוסקופיה קונפוקלית, תיוג חלבונים פלואורסצנטיים ופרוטוקולים של דימוי תאים חיים.
- התהליך תלוי בעדשות עם מפתח נומרי גבוה, שמן טבילה ומערכות סריקת לייזר קונפוקליות לצורך גילוי סיגנל אופטימלי.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרמטרי הדימוי (Z-step, מרווח זמן, גודל ווקסל) וספי analyzers לתוצאות עקביות.
- כולל שיקולי התאמה עבור תיוגי רצפטורים שונים, צבעים פלואורסצנטיים וסוגי תאים מעבר ל-HEK-293.
- כולל מגבלות מעשיות כגון סיכון לפוטובליצ'ינג במהירויות דימוי גבוהות ופשרות בין רזולוציה זמנית לאיסוף פוטונים.
