Murine אבי העורקים למחוץ פגיעה: יעיל בויבו מודל של תאים שרירים חלקה תפוצת ו אנדותל פונקציה
June 11th, 2017
Restenosis לאחר הליכים Cardiovascular (ניתוח מעקף, אנגיופלסטיקה, או stenting) היא בעיה משמעותית להפחית את עמידות של נהלים אלה. טיפול אידיאלי יהיה לעכב תפוצת שריר חלקה (VSMC) תוך קידום התחדשות האנדותל. אנו מתארים מודל להערכה סימולטנית של התפשטות VSMC ותפקוד האנדותל in vivo.
המטרה הכוללת של הליך זה היא ליצור מודל בעלי חיים המאפשר הערכה בו-זמנית של התפשטות תאי שריר חלק בכלי הדם וחידושים מחדש. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה של כלי הדם כגון מהו מנגנון הרסטנוזיס לאחר התערבויות בכלי הדם? טכניקה זו מאפשרת הערכה בו-זמנית in vivo של התפשטות תאי שריר חלק בכלי הדם ואנדותליזציה מחדש.
שני אירועי מפתח המעצימים או מחלישים רסטנוזיס לאחר התערבויות בכלי הדם. מי שידגים את ההליך יהיה ד"ר דן יו, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי. לאחר אישור חוסר תגובה לצביטה בבוהן, הסר את השיער על הבטן הגחונית של עכבר C57BL/6 מורדם בן 10 עד 12 שבועות מעצם החזה לאזור המפשעה.
לאחר מכן יש לחטא את אזור הכתפיים עם אתנול 70% ולהשתמש במחט בגודל 25 או קטנה יותר כדי לתת משכך כאבים מתאים. לאחר מכן הניחו את החיה במצב שכיבה על מגש כירורגי המחומם על ידי כרית איזותרמית. שפשפו את כוונת הניתוח עם בטדין או כלורהקסידין ושטיפת אלכוהול.
חזור על שני השלבים פעמיים נוספות. מרחו משחה על עיני החיה. לאחר ביצוע חתך לפרוטומיה חציוני בבטן, יש להחזיר את המעי הדק והתריסריון לרוחב ימינה.
בעזרת אפליקטור חדש עם קצה כותנה, חשוף את הרטרופריטונאום ואת אבי העורקים הבטני מווריד הכליה השמאלי להתפצלות אבי העורקים. לאחר מכן השתמש באפליקטור סטרילי אחר עם קצה כותנה כדי להעביר 30 מעיכות רצופות של חמש שניות לאבי העורקים. לאחר מתן פציעת הריסוק האחרונה, הסר את גליל הצמר גפן ואפשר לקרביים לחזור למקומם הטבעי.
לאחר מכן השתמש בתפר קלוע ונספג כדי לסגור את הפאשיה ואחריו סגירת העור עם תפר מונופילמנט 6-0, שאינו נספג, והנח את בעל החיים בכלוב התאוששות עם מצעים נקיים עם ניטור עד לשכיבה מלאה. כדי לנתח את שלמות האנדותל של רקמת הלב הפגועה, בנקודת הזמן הניסוי המתאימה, הכנס מחט בגודל 21 לחדר השמאלי של הלב הפגוע. יש להזריק PBS עד שהשפכים מהפרוזדור הימני צלולים, ואז לחלחל לבעל החיים חמישה מיליליטר של 0.3% צבע כחול אוונס בלחץ פיזיולוגי במשך חמש דקות ואחריהם חמישה מיליליטר של PBS טרי.
בתום עירוי ה- PBS, פתח את הבטן עם חתך בקו האמצע וגייס את המעי הדק לצד ימין של הבטן, כפי שהודגם זה עתה, כדי לחשוף את אבי העורקים האינפרא כליה. לנתח בחדות את אבי העורקים מהרקמות הסמוכות ולהוציא את הכלי מווריד הכליה השמאלי לפיצול אבי העורקים לאחסון ב-4% פרפורמלדהיד. בתום הקיבוע, פתח את אבי העורקים לאורך והצמד את הרקמה ליריעת שעווה החושפת את כל פני השטח הלומינלי להערכה איכותית של שלמות האנדותל לפי מידת הצבע הכחול של אוונס.
פציעת ריסוק גורמת לעיבוי דופן אבי העורקים בהשוואה לאבי העורקים של בעלי חיים שטופלו בהליך דמה עם עובי הדופן הגדול ביותר שנצפה שלושה ימים לאחר הפציעה. הפגיעה גורמת גם למראה מעוגל בתאים עם קווי מתאר לא סדירים תואמים של פני הלומנל. שילוב EdU מצביע על כך שעיבוי הדופן המוגבר של אבי העורקים הפגוע מתווך לפחות בחלקו על ידי התפשטות מוגברת של תאי שריר חלק בכלי הדם המדיאליים.
ביטוי פוספו-Erk1/2 נצפה ביותר מ-200% יותר מהביטוי הבסיסי שלושה ימים לאחר הפגיעה עם ביטוי מופחת של p27Kip1 שנמדד בנקודות זמן מוקדמות. גם ביטוי phospho-Erk1/2 וגם p27Kip1 חוזרים לרמות הבסיס חודש לאחר הפציעה, מה שמרמז על כך שהעיבוי הנצפה של דופן אבי העורקים נובע בחלקו גם מהתפשטות מדיאלית מוגברת. כפי שהוערך על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, פגיעת ריסוק של פני השטח הלומינליים של אבי העורקים גורמת לשיבוש של תאי האנדותל ולכריתה חלקית של האנדותל.
יתר על כן, פגיעה בתפקוד המחסום של האנדותל מאפשרת צביעה של קרום הבסיס בצבע כחול אוונס בעוד שהאנדותל של עכברים שטופלו בלפרוטומיה בלבד שומר על תפקוד המחסום שלו ועל המראה הלבן שלו. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך 20 דקות אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להיות עקבי עם כמות הכוח המופעלת על אבי העורקים ולעוור את המדען המפעיל למצב הניסוי של העכבר כדי למנוע הטיה.
אל תשכח שעבודה עם צבע כחול של אוונס ופרפורמלדהיד עלולה להיות מסוכנת וכי תמיד יש לנקוט באמצעי זהירות כגון לבישת כפפות בעת השימוש בחומרים אלה.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה כללית
מאמר זה מציג מודל חיות חדש שתוכנן להערכה בו-זמנית של התפשטות תאי שריר חלק בכלי דם (VSMC) ורי-אנדותליזציה. מודל זה נועד לטפל במנגנונים העומדים בבסיס היצרות חוזרת לאחר התערבויות קרדיווסקולריות כגון ניתוח מעקפים ואנגיופלסטיקה.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- ביולוגיה של כלי דם
- התערבויות קרדיווסקולריות
- מנגנוני היצרות חוזרת
רקע
- היצרות חוזרת היא סיבוך עיקרי לאחר פרוצדורות קרדיווסקולריות.
- עיכוב של התפשטות VSMC הוא קריטי לשיפור עמידות הפרוצדורה.
- התחדשות האנדותל היא חיונית לבריאות כלי הדם.
- הבנת הקשר בין התפשטות VSMC לתפקוד האנדותל היא חיונית.
מטרת המחקר
- לפתח מודל להערכת התפשטות VSMC ותפקוד האנדותל in vivo.
- לחקור את המנגנונים של היצרות חוזרת לאחר התערבויות בכלי דם.
- לספק תובנות לגבי אסטרטגיות טיפוליות אפשריות למניעת היצרות חוזרת.
שיטות ששימשו
- יצירת מודל חיות באמצעות עכברים זכרים מסוג C57BL/6.
- הערכה בו-זמנית של התפשטות VSMC ורי-אנדותליזציה.
- שימוש בהרדמה וטכניקות כירורגיות להכנת המודל.
- הערכת תגובות כדי לאשר את יעילות המודל.
תוצאות עיקריות
- המודל מאפשר בהצלחה הערכה בו-זמנית של תהליכי כלי דם מרכזיים.
- הממצאים תורמים להבנת הדינמיקה של היצרות חוזרת.
- השלכות פוטנציאליות לפיתוח טיפולים ממוקדים להפחתת היצרות חוזרת.
מסקנות
- מודל זה הוא כלי חשוב לחקר ביולוגיה של כלי דם.
- הוא משפר את הבנתנו על התנהגות VSMC והתחדשות האנדותל.
- מחקרים עתידיים יכולים לנצל מודל זה כדי לחקור דרכים טיפוליות חדשות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This model enables simultaneous evaluation of vascular smooth muscle cell proliferation and endothelial barrier function in a large vessel, addressing a critical gap in preclinical restenosis research. By capturing both pathological and regenerative processes in vivo, it supports mechanistic de-risking of anti-restenotic strategies. The approach enhances predictive confidence in target validation for vascular intervention durability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses on VSMC proliferation pathways and endothelial recovery mechanisms.
- Operational Value: Provides functional target validation through concurrent measurement of proliferative and barrier phenotypes.
- Strategic Value: Supports predictive confidence and portfolio triage by modeling key restenosis drivers in a translationally relevant vessel.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for assessing compound effects on medial thickening and endothelial integrity.
- Operational Value: Enables assay standardization via quantifiable outputs such as EdU incorporation, wall thickness, and Evans Blue leakage.
- Strategic Value: Enhances screening readiness and platform reuse for dose-response and time-course studies in vascular biology.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers disease-relevant system continuity from discovery through preclinical validation of vascular injury responses.
- Operational Value: Addresses risk-adjusted advancement decisions by linking early proliferative signals to functional endothelial recovery.
- Strategic Value: Focuses on mechanistic de-risking of targets involved in intimal hyperplasia and reendothelialization.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation, enabling seamless transition from mechanistic insight to lead optimization in vascular therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of VSMC proliferation regulators and endothelial dysfunction mediators.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible, quantitative morphometric and biochemical readouts.
- Analytics: Generates measurable outputs including phospho-Erk1/2 levels, p27kip1 expression, and endothelial denudation scores.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via large-vessel relevance and temporal resolution of injury and repair phases.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability across multiple projects targeting vascular healing and restenosis prevention.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in restenosis pathways.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of dual-endpoint assessment in vivo.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in vascular programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on integrated proliferation and barrier function data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine vascular surgery and perioperative care.
- Dependent on instrumentation for Evans Blue perfusion, SEM imaging, and Western blot detection.
- Necessitates cross-team standardization for injury consistency and blinded assessment.
- Involves adaptation considerations when translating to other vascular beds or disease models.
- Limited by the technical demands of aortic exposure and uniform crush application.
