בשדה מקומי מיקרוסקופ פלואורסצנטי: הדמיה איתותי הסלולר לבבות שלמים
8 במרץ 2017
בלב, אירועים מולקולריים לתאם את פונקצית חשמל התכווצות של האיבר. סט של טכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשדה מקומיות הציגו כאן מאפשר ההקלטה של משתני הסלולר לבבות שלמים. זיהוי מנגנונים בהגדרת תפקוד הלב הוא קריטי להבנה כיצד הלב עובד תחת מצבים פתולוגיים.
המטרה הכוללת של טכניקת הדמיה מיקרוסקופית פלואורסצנטית מקומית זו היא להשתמש בבדיקות מולקולריות כדי למדוד את רמות הסידן התוך-תאי, או פוטנציאל ממברנה מאזורי לב שקשה לגשת אליהם ברמת הלב כולה. שיטה זו יכולה לעזור לנו לענות על שאלות לב וכלי דם מרכזיות הקשורות לדום לב ואיסכמיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שתכונות הלב נמדדות מאירועים תאיים באיבר השלם שבו התאים ממשיכים להיות מחוברים חשמלית, מכנית ומטבולית.
ראשית, הכן את מנגנון לנגנדורף האופקי. טען תמיסת Tyrode שהוכנה טרייה למזרקי 60 מיליליטר, והוסף את כל הצינורות הנלווים להתקנה. לאחר המילוי, הסר את כל בועות האוויר.
לאחר מכן, אזנו את התמיסה הטעונה בגז חמצן טהור המועבר מאבן אוויר מפלסטיק שקועה. לאחר מכן, הניחו תפר כירורגי שאינו נספג סביב מחט. זה ישמש כצינורית להחזרת הלב כאשר הוא מחובר למנגנון.
לאחר מכן, אסוף את הלב לאחר הזרקת הפרין והמתת חסד של החיה. ראשית, נקו את החזה עם אתנול. ההדגמה היא עם עכבר, אך אותו נוהל עובד עבור קצירת לב תוכים.
לאחר מכן, בעזרת מספריים לדיסקציה, בצע חתך בבטן התחתונה ואז חתוך את הצדדים לכיוון הצוואר. לאחר מכן, חתוך בזהירות את הסרעפת, הימנע מהלב. כעת, משוך לאחור את הרקמה החתוכה והצמד אותה כלפי מטה.
לאחר מכן, הסר את הריאות והרקמות שמסביב כדי לחשוף את הלב. לאחר החשיפה, השתמש בפינצטה כדי לגרוף את הלב מבלי לסחוט אותו. נתקו אותו מהחיה על ידי חיתוך אבי העורקים, והשאירו כמה שיותר אבי העורקים מחובר ללב.
לאחר מכן, העמיסו את הלב לתוך סירת משקל קטנה עם מיליליטר אחד של תמיסת Tyrode. תחת מיקרוסקופ מנתח, הסר במהירות את הדם ואת רקמת השומן המקיפה את הלב באמצעות פינצטה ומספריים. בעזרת תפר כירורגי שאינו נספג ומחט, חבר את אבי העורקים לחיבור האופקי של מנגנון לנגנדורף.
אבטח את הקשר באמצעות שתי פינצטות עדינות. לאחר מכן, התחל את הרטרופרפוזיה על ידי פתיחת השסתום כדי לשחרר את תמיסת Tyrode. נקה את הרקמה שמסביב ושאב פסולת כדי לשמור על החדר האופקי נקי בזמן שהלב מתייצב למשך 10 דקות.
הפוך את הצבע לרענן. עבור Rhod-2 AM, הוסף 20 מיקרוליטר של 20% פלורוניק ו-DMSO לחבילת הצבע של היצרן בנפח 50 מיקרוגרם. מערבבים על ידי פיפטינג, הימנעות מבועות.
לאחר מכן, העבירו את הצבע הנוזלי לבקבוקון זכוכית שקוף, והוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת Tyrode. ממיסים היטב את הצבע בתערובת זו באמצעות 15 עד 20 דקות של סוניקציה. לאחר מכן, יש לחלחל את הצבע המוכן באמצעות משאבה פריסטלטית בטמפרטורת החדר.
ראשית, טען את הצבע בתא הצבע, ולאחר מכן, הדק את כל קווי הצינורות המחוברים לסעפת, ושמור את המהדקים מעל הסעפת כדי למנוע זרימה חוזרת. לאחר מכן, הפעל את המשאבה וסגור מיד את השסתום התלת-כיווני מתחת למזרק 60 מיליליטר. מקם את הצינור הקטן המחובר לקצה היניקה של המשאבה ליד הלב כדי להחזיר את הצבע לאחר החדרתו.
קח מחט קטנה וצבט אותה דרך הקודקוד כדי להקל על הלחץ. לאחר מכן, הניחו ללב לחלחל בצבע למשך 30 דקות. במהלך תקופה זו, חשוב מאוד להעריך את רמת הצבע על מנת שבועות לא ייכנסו לרקמה, מה שיגרום לאיסכמיה ולנזק לרקמות.
לאחר החדרת הצבע, יש לערבב את הלב בתמיסת Tyrode. הסר את המהדק מעל הסעפת. פתח את השסתום ולאחר מכן אפשר ללב להתייצב למשך 10 דקות.
במהלך הרטרופרפוזיה, מלאו את החדר האופקי בתמיסת Tyrode והפעילו את יחידת Peltier כדי להביא את טמפרטורת האמבטיה ל -37 מעלות צלזיוס. כדי להכין את אור הסיבים האופטיים לניסוי, הנח תחילה את הסיב האופטי בתוך פיפטה של שני מיליליטר. ואז חבר את הפיפטה למיקרומניפולטור.
השתמש במיקרומניפולטור כדי ללחוץ מעט את הסיב האופטי על פני החדר הרוחבי. לאחר מכן, תכנת מחולל גלים כך שיספק דופק מרובע ברוחב של אלפית שנייה אחת. והגדר ממריץ לב שיהיה מסונכרן חיצונית ומחובר למחולל הגלים.
בכל אחת משתי יציאות הממריץ, חבר חוט עם מחט דיקור מולחמת בקצה. חבר שתי מחטי דיקור לקודקוד הלב, במרחק של כשלושה מילימטרים זה מזה. רק לאחר הנחת המחטים, הפעל את הממריץ, ובכך הימנע מזעזועים מקריים.
כעת, כדי להקליט את האות האפיקרדיאלי, התאם את תדר הרכישה בתוכנה ל-10 קילו-הרץ. כדי לאסוף את האות האנדוקרדיאלי, בצע את אותו הליך, אך השתמש במחט בגודל 23 כדי לתקוע חור בחדר הצדדי ליד המחיצה. ואז, באמצעות מיקרומניפולטור, מקם את הסיב האופטי השני לתוך האנדוקרדיום.
כדי לגשת לתפקוד הטרנסמורלי, הושוו המורפולוגיה של פוטנציאל הפעולה שתועדו מהאנדוקרדיום והאפיקרדיום. רישומי הקרינה נעשו לאחר טיפול בלב עם di-8-ANEPPS בטכניקת CLFFM. פוטנציאל הפעולה היה איטי יותר באנדוקרדיום, במיוחד בשלב הראשון.
משך פוטנציאל הפעולה תואר כזמן שלוקח לפוטנציאל הפעולה לעבור רה-פולזציה במידה מסוימת. כאשר משכי הזמן נורמלו והועברו לחפיפה בשלב האפס, ניתן היה להשוות ביניהם. אכן היה הבדל משמעותי בשלב הראשון.
לאחר מכן, נעשה שימוש ב-Rhod-2 AM לניטור סידן תוך תאי. על מנת להשוות הבדלים אזוריים בסידן התוך-תאי, הוערכה הקינטיקה של ארעיות הסידן. לשם השוואה, הזמן לשיא הארעיות היה ארוך בכשתי אלפיות השנייה באנדוקרדיום.
בסך הכל, למעבר הסידן מהאנדוקרדיום הייתה קינטיקה איטית משמעותית מאשר האפיקרדיום. לאחר שליטה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לתעד את חולף הסידן התוך-תאי ופוטנציאל הפעולה באזורים שקשה לגשת אליהם בלב. החלק של לנגנדורף במערך הופך את זה למעשי מאוד להחדיר כימיקלים שונים ללב, ולהעריך את ההשפעות על תכונות הלב.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג טכניקה של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית בשדה מקומי למדידת רמות סידן תוך-תאיים ופוטנציאלי ממברנה בלב. שיטה זו מאפשרת לחקור את התפקוד הלבבי באיברים שלמים, דבר החיוני להבנת מצבים כגון דום לב ואיסכמיה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- פיזיולוגיה של מערכת הלב וכלי הדם
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
- טכניקות של דימות תאי
רקע
- הבנת התפקוד הלבבי חיונית לטיפול במחלות לב.
- שיטות מסורתיות עשויות שלא להגיע לכל אזורי הלב ביעילות.
- מיקרוסקופיית פלואורסצנציה בשדה מקומי מציעה גישה חדשנית לחקר תאי לב.
- טכניקה זו שומרת על שלמות הצימוד התאי בלב.
מטרת המחקר
- למדידת סידן תוך-תאי ופוטנציאלים של ממברנה בלב.
- לבחינת מנגנונים של תפקוד לבבי תחת תנאים פתולוגיים.
- למתן תובנות לגבי אירועים קרדיווסקולריים כגון פסק לב ואיסכמיה.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הכנת מכשיר Langendorff האופקי.
- מילוי תמיסת Tyrode למזרקים.
- סילוק בועות אוויר מהמערכת.
- שימוש במ probes מולקולריים לצורך מדידות.
תוצאות עיקריות
- מדידה מוצלחת של משתנים תאיים בלבבות שלמים.
- הדגמת יעילות הטכניקה בגישה לאזורים קשיים.
- תובנות שנרכשו לגבי התכונות החשמליות והמכניות של תאי לב.
- יישומים פוטנציאליים להבנת פתולוגיות של הלב.
מסקנות
- טכניקת מיקרוסקופיית פלואורסצנציה בשדה מקומי היא בעלת ערך למחקר קרדיאלי.
- שיטה זו משפרת את הבנתנו לגבי תפקוד הלב במצב בריא ובמצב מחלה.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בטכניקה זו כדי להשיג תובנות עמוקות יותר לגבי בריאות קרדיווסקולרית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיקרוסקופיית פלואורסצנציה בשדה מקומי מאפשרת מדידה של סידן תוך-תאי ופוטנציאלי ממברנה בלבבות שלמים, ובכך משמרת את הצימוד התאי החיוני להבנת איסכמיה והפרעות קצב. גישה זו תומכת בתיקוף מטרות על ידי אספקת נתונים רלוונטיים פיזיולוגית מרקמה מצומדת חשמלית ומכנית, מה שמשפר את רמת הביטחון החזויה במודלים פרה-קליניים. הטכניקה מסייעת בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי קישור אותות מולקולריים לתפקוד האיבר השלם במחקר של מחלות קרדיווסקולריות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות על ידי מדידת תנודות סידן ופוטנציאלי פעולה במיוקרדיום שלם תחת צימוד פיזיולוגי.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף תפקודי של מטרות במערכות הרלוונטיות למחלה, שבהן מודלים של תאים מבודדים אינם מצליחים ללכוד את הדינמיקה ברמת הרקמה.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח על ידי זיהוי תרכובות המנרמלות את קינטיקת הסידן התוך-תאית באזורים האנדוקרדיאליים והאפיקרדיאליים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מוכנות הבדיקה: הכנת מערכות ביולוגיות מתוקפות לסריקה המשכית על ידי קביעת אותות פלואורסצנציה בסיסיים בלבבות בפרפוזיה.
- פלט כמותי: הפקת מדידות הדירות של קינטיקת תנודות סידן ומשך פוטנציאל הפעולה לצורך הערכת השפעת תרכובות.
- שימוש חוזר בפלטפורמה: תמיכה במדרגיות בין מודלים של מכרסמים באמצעות פרפוזיית Langendorff, המאפשרת רכישת אותות עקבית ברצפי סריקה קרדיווסקולריים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: מדמה מנגנונים של איסכמיה ואריתמיה על ידי ניטור הבדלים אזוריים בטיפול בסידן ובדה-פולריזציה בלבבות שלמים.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לתיקוף פרה-קליני על ידי שמירה על צימוד אלקטרוטוני ומטבולי במהלך התערבות פרמקולוגית.
- החלטות מותאמות סיכון: מספק מידע לקביעת קריטריונים להתקדמות באמצעות שינויים מדידים במורפולוגיה של פוטנציאל הפעולה ובטרנזיאנט סידן ברקמה חולה לעומת רקמה מטופלת.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת בתהליכי גילוי קרדיו-וסקולריים, החל משלבי בחינת המטרה המוקדמים ועד לתיקוף פרה-קליני, ותומכת בזיהוי מובילים (leads) באמצעות אספקת נתוני איתות בהקשר פיזיולוגי.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת השערות על ידי מדידת סידן ספציפי למדורים (ציטוזולי לעומת הרשת הסרקופלזמית) ופוטנציאל ממברנה ברקמה שלמה.
- סריקה: מספקת תכשירים מוכנים לבדיקה עם קריאות פלואורסצנציה יציבות להערכת השפעות של תרכובות על אלקטרופיזיולוגיה של הלב וטיפול בסידן.
- אנליטיקה: מספקת משתנים תלויים כמותיים, כולל זמן עד לשיא העובר של הסידן, משך פוטנציאל הפעולה ומדדי רפולריזציה ספציפיים לשלב לצורך השוואה בין קבוצות.
- מחקר טרנסלציונלי: מקשר בין מדידות מולקולריות לתפקוד איבר שלם, מה שמאפשר התאמה של ביומרקרים במודלים פרה-קליניים של תפקוד לקוי של הלב.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר להערכת סיכון קרדיווסקולרי בתחומי טיפול שונים באמצעות גילוי פלואורסצנציה סטנדרטי מבוסס Langendorff.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית על ידי מתאם בין אותות תת-תאיים לבין פיזיולוגיה של איבר שלם במודלים של מחלות קרדיווסקולריות.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות טעינת צבע, פרפוזיה ומיקום סיב אופטי סטנדרטיים במערכת Langendorff.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go על ידי זיהוי ליקויי אלקטרופיזיולוגיה וטיפול בסידן בשלב מוקדם, לפני כישלון יקר בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרכובות בהתאם לסיכון, בהתבסס על קינטיקה מנורמלת של פוטנציאל פעולה וטרנזיאנט סידן בלבבות חולים לעומת לבבות שעברו תהליך הצלה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיסקציה של הלב, פרפוזיה בשיטת Langendorff והכנת צבעים פלואורסצנטיים (למשל, Rhod-2 AM, di-8-ANEPPS).
- תלוי בהקמת מיקרוסקופיה מסיב אופטי, מחוללי גלים לעירור ומערכות רכישה בתדר גבוה (10 kHz).
- מחייב סטנדרטיזציה רב-תחומית בין צוותי הפיזיולוגיה, הדימות והפרמקולוגיה להבטחת עקיביות של האותות.
- כולל שיקולי התאמה עבור מינים שונים (עכבר, תוכי) ואזורים ונטריקולריים שונים (אפיקרדיום, אנדוקרדיום) בעת מדידת מדרגות טרנס-מורליות.
- מוגבל על ידי יעילות טעינת הצבע וארטיפקטים של תנועה במהלך הפרפוזיה, אותם יש לשלוט בהם כדי למנוע איסכמיה או שיבוש של האות.
