הכנה תצפית של דגימות ביולוגיות העבה ידי סריקת הילוכים אלקטרונים טומוגרפיה

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשיג שחזור תלת מימדי עם שחזור עומק שדה של דגימה ביולוגית עבה באמצעות טומוגרפיה אלקטרונית של סריקת קרן מתכנסת. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה המבנית לגבי טומוגרפיה אלקטרונית של דגימות ביולוגיות עבות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לרכוש תמונות במצב סיביות מתכנס וניתן לבצע את עיבוד הנתונים ברוב התוכנות המוקדשות לטומוגרפיה.

כדי להתחיל בהכנת דגימת תרבית תאים, צנטריפוגה את הדגימה ב-5000 x גרם למשך חמש דקות. השתמש בפרמטרי צנטריפוגה אלה במהלך הכנת הדגימה. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של PBS מועשר ב-4% פרפורמלדהיד ו-2% גלוטרלדהיד.

דגרו את המתלה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה את התערובת, השליכו את הסופרנטנט ושטפו את הגלולה שלוש פעמים עם מנות מיליליטר אחת של PBS. באמצעות אותם תנאי דגירה והליך כביסה, דגרו את הגלולה במיליליטר אחד של PBS, מועשר ב-1% אוסמיום טטרוקסיד, ובמיליליטר אחד של PBS מועשר ב-2% אורניל אצטט.

לאחר מכן, מצננים את הדגימה לארבע מעלות צלזיוס. לייבש את הגלולה על ידי דגירה רצופה בתמיסות אתנול מרוכזות יותר ויותר. שמירה על טמפרטורת הדגימה של ארבע מעלות צלזיוס לאורך כל הדגירה, הצנטריפוגה והכביסה.

השעו מחדש את הגלולה המיובשת במיליליטר אחד של אתנול טהור, ודגרו למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, אפשר לדגימה להתחמם לטמפרטורת החדר, וצנטריפוגה את הדגימה. דגרו את הגלולה בתמיסות שרף אפוקסי מרוכזות יותר ויותר בטמפרטורת החדר.

לאחר הכביסה הסופית, השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של שרף אפוקסי טהור, ודגרו למשך הלילה בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה את הדגימה, והסר את הסופרנטנט, ולאחר מכן השהה מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של שרף אפוקסי ומקשה. העבירו את המתלה לקפסולה.

דגרו את קפסולת הפלסטיק בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות כדי לפלמר את השרף. הסר את הקפסולה מהחממה וודא פילמור שרף. הוסף שכבה של שרף אפוקסי ומקשיח מעל הדגימה המוטמעת ודגר את הקפסולה שוב באותם תנאים.

הרכיב את הדגימה המוטמעת בשרף הפוך במחזיק דגימה. תקן היטב את הדגימה על בלוק החיתוך של אולטרה-מיקרוטום. חותכים את קפסולת הפלסטיק מהדגימה בשרף.

מעצבים את השרף החשוף לפירמידה. לאחר מכן העבירו את הקפסולה ואת מחזיק הדגימה לזרוע הנעה של האולטרה-מיקרוטום. התקן סכין זמירה ומונחה על ידי מיקרוסקופ, חדד את צורת הפירמידה.

החלף את סכין החיתוך בסכין היסטולוגיה. מתחת למיקרוסקופ, כוונן את זווית גובה הקפסולה כך שהפירמידה תהיה בניצב לקצה הסכין. הגדר את מהירות החיתוך וחתך את המדגם.

לאחר חיתוך הדגימה, העבירו את החלק הנבחר לרשת נחושת מטופלת על נייר סינון. הניחו לדגימה להתייבש ולאחר מכן טענו את הדגימה למיקרוסקופ האלקטרונים. כדי לתכנן את סדרת ההטיה המוקדית, חשב תחילה את עומק השדה של קרן האלקטרונים ואת העובי הנראה המרבי של הדגימה.

בהתבסס על ערכים אלה, בחר מרווח מיקוד וקבע את מספר שלבי המוקד הדרושים כדי לצלם את הדגימה כולה בעובי הנראה המרבי. לאחר מכן, בהגדלה נמוכה, אתר את אזור העניין בתוך המדגם. כוונן את הגובה האוצנטרי כך שהחזר ה-ROI לא ייראה כאילו הוא זז בעת סיבוב הדגימה.

ודא שהחזר ה-ROI נשאר גלוי לאורך כל טווח ההטיה. מלא את הפרמטרים של סדרת הטיית המוקד לאיסוף תמונות אוטומטי ורכוש את התמונות. ייבא את סדרת התמונות לתוכנית עיבוד תמונה, ויישר את התמונות שנאספו באותה זווית הטיה בהיררכיה פירמידלית.

מצא את היישור בכל זווית הטיה על-ידי ערימת התמונות המיושרות. דפדף באוסף כדי לוודא שרק האזור הממוקד עובר מתמונה לתמונה ויישר מחדש את התמונות בהתאם לצורך. לאחר אימות היישור בכל הדגימה, מזג את המידע במיקוד בהגדרות הגבוהות כדי להפיק את הסדרה עם תמונה אחת לכל זווית הטיה.

בצע יישור חיפוש של סדרת ההטיה על סמך מינימום מקומי או סמנים נאמנים. בצע שחזור תלת-ממדי ובדוק את התמונה המתקבלת. אם השחזור נראה מטושטש או מעוות, יישר מחדש את סדרת התמונות המקורית.

דגימה של T. brucei צולמה ונותחה בשיטה זו. בזווית הטיה של אפס מעלות, נראים מספר פרטים של כיס הדגל

בזווית ההטיה הגבוהה יותר של 70 מעלות, רק חלק מכל תמונה שנאספה בסדרת המוקד נמצא בפוקוס. עמדה זו משתנה לאורך הסדרה. על ידי מיזוג הקטעים במיקוד, נוצרת תמונה בודדת עם אזור מיקוד גדול יותר.

אפקט זה בולט עוד יותר כאשר אזורי התדר הגבוה של סדרת הטיית המוקד מודגשים. המידע בתדר גבוה משתרע על פני רוב התמונה המשולבת, מה שמצביע על כך שסדרת ההטיה המוקדית דרך עובדה היטב. לאחר השליטה, ניתן לבצע את חלק עיבוד התמונה תוך כשלוש עד ארבע שעות, בהתאם לפרמטרי היישור והשחזור שנבחרו.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שאיכות השחזור הסופי תלויה מאוד באיכות בדיקות היישור הקודמות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע את האוסף ועיבוד התמונה של סדרת הטיה מוקדית.