Name: הכנה תצפית של דגימות ביולוגיות העבה ידי סריקת הילוכים אלקטרונים טומוגרפיה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: למד הכנת דגימות ביולוגיות עבות לטומוגרפיית אלקטרונים בסריקת הילוכים. השיטה מאפשרת שחזור תלת-ממדי עם החזרת עומק שדה לחקר ביולוגיה מבנית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי שני מענקי ANR (ANR-11-BSV8-016 ו-ANR-10-IDEX-0001-02). אנו גם מודים ל-PICT-IBiSA על מתן גישה לציוד הדמיה כימית.

<ol><li>De Rosier, D. J., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+three+dimensional+structures+from+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of three dimensional structures from electron micrographs.</a> Nature. 217 (5124), 130-134 (1968).</li>
<li>Gan, L., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2491709/">Electron tomography of cells.</a> Q Rev Biophys. 45 (1), 27-56 (2012).</li>
<li>Lucic, V., Rigort, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography%3A+the+challenge+of+doing+structural+biology+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ.</a> J Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).</li>
<li>Al-Amoudi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+microscopy+of+vitreous+sections%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron microscopy of vitreous sections.</a> EMBO J. 23 (18), 3583-3588 (2004).</li>
<li>Koguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+STEM+for+observing+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electron+Microsc+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional STEM for observing nanostructures.</a> J Electron Microsc (Tokyo). 50 (3), 235-241 (2001).</li>
<li>Midgley, P. A., Weyland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+electron+microscopy+in+the+physical+sciences%3A+the+development+of+Z-contrast+and+EFTEM+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">3D electron microscopy in the physical sciences: the development of Z-contrast and EFTEM tomography.</a> Ultramicroscopy. 96 (3-4), 413-431 (2003).</li>
<li>Sousa, A. A., Azari, A. A., Zhang, G., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-axis+electron+tomography+of+biological+specimens%3A+Extending+the+limits+of+specimen+thickness+with+bright-field+STEM+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual-axis electron tomography of biological specimens: Extending the limits of specimen thickness with bright-field STEM imaging.</a> J Struct Biol. 174 (1), 107-114 (2011).</li>
<li>Sousa, A. A., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+STEM+for+the+biological+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Development and application of STEM for the biological sciences.</a> Ultramicroscopy. , 38-49 (2012).</li>
<li>Ercius, P., Muller, D. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/239633484_Incoherent_Bright_Field_STEM_for_Imaging_and_Tomography_of_Ultra-Thick_TEM_Cross-sections">Incoherent bright field STEM for imaging and tomography of ultra-thick TEM cross-sections.</a> Microsc Microanal. 15, (2009).</li>
<li>Hyun, J. K., Ercius, P., Muller, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beam+spreading+and+spatial+resolution+in+thick+organic+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Beam spreading and spatial resolution in thick organic specimens.</a> Ultramicroscopy. 109 (1), 1-7 (2008).</li>
<li>Aoyama, K., Takagi, T., Hirase, A., Miyazawa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STEM+tomography+for+thick+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">STEM tomography for thick biological specimens.</a> Ultramicroscopy. 109 (1), 70-80 (2008).</li>
<li>Biskupek, J., Leschner, J., Walther, P., Kaiser, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+STEM+tomography+acquisition--a+comparison+of+convergent+beam+and+parallel+beam+STEM+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Optimization of STEM tomography acquisition--a comparison of convergent beam and parallel beam STEM tomography.</a> Ultramicroscopy. 110 (9), 1231-1237 (2010).</li>
<li>Hovden, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+Crowther+limit%3A+combining+depth-sectioning+and+tilt+tomography+for+high-resolution%2C+wide-field+3D+reconstructions%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Breaking the Crowther limit: combining depth-sectioning and tilt tomography for high-resolution, wide-field 3D reconstructions.</a> Ultramicroscopy. 140, 26-31 (2014).</li>
<li>Dahmen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+scanning+transmission+electron+microscopy+tilt-+and+focal+series%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Microanal%22%5BJournal%5D)">Combined scanning transmission electron microscopy tilt- and focal series.</a> Microsc Microanal. 20 (2), 548-560 (2014).</li>
<li>Trepout, S., Messaoudi, C., Perrot, S., Bastin, P., Marco, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+transmission+electron+microscopy+through-focal+tilt-series+on+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Scanning transmission electron microscopy through-focal tilt-series on biological specimens.</a> Micron. 77, 9-15 (2015).</li>
<li>Weyland, M., Muller, D. A. <a target="_blank" href="http://muller.research.engineering.cornell.edu/sites/WEELS/summer06/FEI%20nanoSolutions%20Muller.pdf">Tuning the convergence angle for optimum STEM performance.</a> FEI Nanosolutions. 1 (24), (2005).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Forster, B., Van De Ville, D., Berent, J., Sage, D., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+wavelets+for+extended+depth-of-field%3A+a+new+method+for+the+fusion+of+multichannel+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Complex wavelets for extended depth-of-field: a new method for the fusion of multichannel microscopy images.</a> Microsc Res Tech. 65 (1-2), 33-42 (2004).</li>
<li>Messaoudii, C., Boudier, T., Sanchez Sorzano,, O, C., Marco, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TomoJ%3A+tomography+software+for+three-dimensional+reconstruction+in+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy.</a> BMC Bioinformatics. 8, 288(2007).</li>
<li>Sorzano, C. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker-free+image+registration+of+electron+tomography+tilt-series%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Marker-free image registration of electron tomography tilt-series.</a> BMC Bioinformatics. 10, 124(2009).</li>
<li>Messaoudi, C. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://cmib.curie.fr/fr/download/softwares/TomoJ">http://cmib.curie.fr/fr/download/softwares/TomoJ</a> (2016).</li>
<li>Thevenaz, P. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg ">http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg </a> (2016).</li>
<li>Forster, B. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/">http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/</a> (2016).</li>
<li>Kohl, L., Bastin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+flagellum+of+trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev+Cytol%22%5BJournal%5D)">The flagellum of trypanosomes.</a> Int Rev Cytol. 244, 227-285 (2005).</li>
<li>Luft, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+in+epoxy+resin+embedding+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophys+Biochem+Cytol%22%5BJournal%5D)">Improvements in epoxy resin embedding methods.</a> J Biophys Biochem Cytol. 9, 409-414 (1961).</li>
<li>Mielanczyk, L., Matysiak, N., Michalski, M., Buldak, R., Wojnicz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closer+to+the+native+state.+Critical+evaluation+of+cryo-techniques+for+Transmission+Electron+Microscopy%3A+preparation+of+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Histochem+Cytobiol%22%5BJournal%5D)">Closer to the native state. Critical evaluation of cryo-techniques for Transmission Electron Microscopy: preparation of biological samples.</a> Folia Histochem Cytobiol. 52 (1), 1-17 (2014).</li>
<li>Hovden, R., Xin, H. L., Muller, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+depth+of+field+for+high-resolution+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Microanal%22%5BJournal%5D)">Extended depth of field for high-resolution scanning transmission electron microscopy.</a> Microsc Microanal. 17 (1), 75-80 (2011).</li>
<li>Dahmen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ettention+software+package%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">The Ettention software package.</a> Ultramicroscopy. 161, 110-118 (2016).</li>
<li>Murata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+imaging+of+the+budding+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+by+high-voltage+scanning+transmission+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography.</a> Ultramicroscopy. 146, 39-45 (2014).</li>
<li>Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ion+beam+scanning+electron+microscopy+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Focused ion beam scanning electron microscopy in biology.</a> J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).</li>
<li>Kubota, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+developments+in+electron+microscopy+for+serial+image+acquisition+of+neuronal+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles.</a> Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).</li>
<li>Levin, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomaterial+datasets+to+advance+tomography+in+scanning+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Data%22%5BJournal%5D)">Nanomaterial datasets to advance tomography in scanning transmission electron microscopy.</a> Sci Data. 3, 160041(2016).</li>
</ol>

אין לנו ניגוד אינטרסים לחשוף.

במאמר זה, אנו מציגים פרוטוקול הכנת מדגם קונבנציונלי יחד עם מדריך צעד-אחר-צעד לביצוע ניתוח 3D על דגימות ביולוגיות עבות באמצעות STEM באמצעות מוקד טומוגרפיה. הטבעת שרף של דגימות ביולוגיות שמשה במשך עשרות שנתי 26, ופרוטוקולים חלופיים מותאמים מיני מדגמים שונים ניתן למצוא ברחבי בספרות 27. לעומת זאת, דגימות עבות הדמיה ב- STEM בשיטות באמצעות פוקוס היא משימה חדשה, ואת השיטות ביותר תהיינה שיפור סביר כפי שהוא הופך להיות נפוץ יותר. <p class=...

מאז ה -1970 המוקדמות, טומוגרפיה גישות במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכים (TEM) היה בשימוש נרחב על האפיון המבני של דגימות ביולוגיות 1, 2, 3. הערעור של טומוגרפיה אלקטרונים הילוכים היה שזה יכול לשמש כדי לחקור מגוון רחב של מבנים ביולוגיים בקנה מידה ננומטרי, מן הארכיטקטורה של תאים ואת ultrastructure של אברונים למבנה מתחמי וחלבונים macromolecular. אף על פי כן, טומוגרפיה אלקטרוני הילוכים לא יכולה לשמש כדי לחקור דגימות עבות מאוד (יותר מ -0.5 מיקרומטר). ואכן, דגימות עבות לייצר אלקטרונים מפוזרים מדי, שהניבו נמוך יחס אות לרעש תמונות (SNR). בנוסף, טומוגרפיה כרוך האוסף של תמונות של דגימות מוטות, עם העובי לכאורה של המדגם עולה, עם זווית ההטיה. למרות פיזור קשיח ניתן לסנןמתוך באמצעות מסנני אנרגיה, הכמות הקריטית של אלקטרונים דרושים תמונות SNR גבוהות הוא הגיעה בקושי TEM. לפיכך, דגימות ביולוגיות עבות נחקרו רק באמצעות חתך 4. כמה דוגמאות לא יכול להיות פרוס: מסוימים עשויים להתדרדר במידה ולא נחתכים, ואחרים צריכים להיחקר בשלמותם על מנת להבין את המורכבות שלהם. גישה חלופית היא להשתמש TEM סריקה במצב 5, 6, 7, 8. סריקה מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים (STEM), המסלול האופטי של האלקטרונים שונה מזו TEM הקונבנציונלי. אלקטרונים העובר דרך המדגם ללא פיזור ניתן לאסוף על הציר האופטי עם גלאי שדה בהיר (BF) 9, ואילו אלה מפוזרים בצורה אלסטית ניתן לאסוף בזווית מסוימת המצייר האופטי עם גלאי כהה שדה (DF).היתרון השני של גזע הוא כי אלומת האלקטרונים הממוקדת נסרקה על פני השטח של המדגם, המאפשרת פיקסל אחר פיקסל האוסף של התמונות. למרות אלומת אלקטרונים מרחיב תוך שהם מעבירים דרך המדגם 10, ערכת איסוף המסוים הזה רגיש פחות אלקטרונים מפוזרים inelastically מ TEM קונבנציונאלי. יתר על כן, אין עדשה שלאחר הדגימה ב- STEM, ובכך הימנעות עיוותים כרומטיים שיכול להתרחש TEM. אורכו המצלמה יכול להיות מותאם כך גלאי BF בעיקר מזהה אלקטרוני unscattered. באמצעות גלאי DF ללמוד דגימות עבות אינו מומלץ בגלל פיזור מרובה, אשר מפיק תמונות מדויקות. במקום זאת, גלאי BF יכול לשמש 11. בעוד גזע יכול להפיק תמונות SNR גבוהות, יש לו עומק השדה נמוך יחסית בגלל התכנסות קרן גבוהה יחסית TEM, להקטין את כמות מידע מעמיק כי ניתן להשבה מתוך עבהדגימות. במקרה של מיקרוסקופי STEM תקן סטייה, שבו זווית ההתכנסות יכולה להיות גבוהה ככל 30 mrad, העומק של השדה יכול להיות נמוך מספיק כך שהמידע כי היא בפוקוס מקורו במישור מוקד של רק כמה ננומטרים . הגדרת קרן אלקטרונים במצב מקביל משפר את עומק השדה של אלומת אלקטרונים על חשבון הרזולוציה 12. עם זאת, התקנה זו אינה תמיד אפשרית. בכל פעם יש צורך להשתמש אלומת אלקטרונים התכנס, יש להשתמש בטכניקות אשר משפרות את עומק השדה של אלומת האלקטרונים כאשר לומדים דגימות עבות. מחקרים שנעשה לאחרונה דיווחו על רכישת מספר תמונות בבת מטוסים שונים מוקדי ברחבי המדגם לשחזר את הסכום המקסימאלי של מידע פוקוס 13, 14. שני המחקרים מתארים דרכים שונות לטפל במידע מן המטוסים מוקד שונים. Hovden et al.בשילוב בחלל פורה התמונות שנגבו לעבר מטוסים שונים מוקדים, ואת השיקום הסופי הושג ישירות ההופכי 3D התמר 13. לעומת זאת, Dahmen et al. פתח מנוע שחזור הקרן מתכנס לשחזר בחלל אמיתי נפח 3D מן המטוסים השונים מוקדי 14. המעבדה שלנו גם פתחה שיטת הדמית דגימות ביולוגיות עבות. האסטרטגיה שלנו הייתה שונה משתי השיטות שתוארו לעיל בכך שאנו התמזגנו המידע הוא בפוקוס המטוסים השונים מוקדי ושחזרנו את נפח 3D הסופי בחלל אמיתי באמצעות מקרן קרן מקביל 15. המטרה שלנו היתה לפתח שיטה שיכולה להתבצע בקלות בכל מעבדה במיקרוסקופ אלקטרונים. לשם כך, אנו מכוונים כדי לאסוף את התמונות מוקד כמות מוגבלת של זמן, להשוות את מסגרת הזמן של ניסויים טומוגרפיה קונבנציונליים. בנוסף, ג השיטה המוצעת שלנוולד להיות מותאם לשימוש עם סוגים שונים של יישור ותוכנות שחזור. בהקשר של הפרסום שלנו משנת 2015 15, רצינו לדמיין ולאפיין את ההתאוששות של עומק השדה, כך השתמשנו זווית למחצה התכנסות גדולה של 25 mrad. כאן, אנו מציגים צעד-אחר-צעד פרוטוקול לביצוע באמצעות מוקד ההדמיה ב- STEM פי השיטה שפותחה במעבדה שלנו בשנת 2015 15, ואנחנו מציגים כיצד הנתונים משנת 2015 היה מעובד. שיטה זו משחזרת מידע פוקוס ממטוסים כמה מוקדי ברחבי דגימה ביולוגית עבה (750 ננומטר) ומאפשרת שחזורי 3D באיכות גבוהה. במידת הצורך, את ההבדלים מתודולוגיה זו לעומת השיטות שנוקטים קבוצות אחרות גם מוצגים.

<table><tbody><tr><td>פוספט חוצץ</td><td>מלח סיגמא-אולדריץ'</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>2860</td><td></td></tr><tr><td>שרף אפוקסי</td><td>EMS</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P6148</td><td>הוסף אבקת פרפורמלדהיד ל-PBS המחוממת בכ-60 & מעלות צלזיוס הגדל את ה-pH על ידי הוספת 1 N NaOH עד שלא נראית אבקת PFA.</td></tr><tr><td>גלוטראלדהיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G5882&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>אוסמיום טטרוקסיד</td><td>EMS</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>אורניל אצטט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>73943</td><td></td></tr><tr><td>קפסולת ג'לטין</td><td>EMS</td><td>70110</td><td></td></tr><tr><td>סכיני חיתוך והיסטו סכיני</td><td>יהלום הפצת LFG סכיני</td><td></td><td>יהלום מיקרוסקופיה</td></tr><tr><td>אלקטרונית רשת נחושת</td><td>רשת LFG חלוקת</td><td>G200-Cu</td><td></td></tr><tr><td>עט ציפוי רשת</td><td>הפצת LFG</td><td>70624</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק דגימה</td><td>JEOL</td><td>EM-21311 HTR</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אלקטרונים</td><td>JEOL</td><td>JEM-2200FS</td><td></td></tr></tbody></table>

הכנה תצפית של דגימות ביולוגיות העבה ידי סריקת הילוכים אלקטרונים טומוגרפיה

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

דוח זה מתאר פרוטוקול להכנת דגימות ביולוגיות עבות לתצפית נוספת באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק. הוא גם מתאר שיטת הדמיה לחקר המבנה התלת-ממדי של דגימות ביולוגיות עבות על ידי סריקת טומוגרפיה אלקטרונית שידור. פרוטוקול הכנת הדגימה מבוסס על שיטות קונבנציונליות שבהן הדגימה מקובעת באמצעות חומרים כימיים, מטופלת בחומר ניגוד מלח אטומי כבד, מיובשת בסדרה של אמבטיות אתנול ומוטמעת בשרף. לאחר מכן מתוארים תנאי ההדמיה הספציפיים לצפייה בדגימות עבות על ידי סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים שידור. חלקים מהמדגם נצפים בשיטת מיקוד דרך הכוללת איסוף של מספר תמונות במישורי מוקד שונים. זה מאפשר שחזור של מידע ממוקד בגבהים שונים לאורך הדגימה. דפוס איסוף מסוים זה מבוצע בכל זווית הטיה במהלך איסוף נתוני טומוגרפיה. לאחר מכן נוצרת תמונה אחת, הממזגת את המידע במיקוד מכל מישורי המוקד השונים. לאחר מכן נוצר מערך נתונים קלאסי של סדרת הטיה. היתרון של השיטה הוא שניתן לבצע את היישור והשחזור של סדרת ההטיה באמצעות כלים סטנדרטיים. אוסף התמונות דרך המוקד מאפשר שחזור של נפח תלת מימד המכיל את כל הפרטים המבניים של המדגם בפוקוס.

במחקר שלנו, אלקטרונים הואצו עד 200 קילו וולט במיקרוסקופ אלקטרוני הילוכי אקדח פליטת שדה. תמונות נאספו במצב STEM BF באמצעות להתעכב זמן של 20 מיקרו-שניות. לגבי העיצוב של ההטייה סדרה באמצעות מוקד, מצאנו כי מרווחי מוקד 150 ננומטר נתן תוצאות משביעות רצון לחקר ultrastructural של מדגם-אפילו ביולוגי 750 ננומטר בעובי למרות עומק השדה של אלומת אלקטרונים היה רק 3 ננומטר מאז השתמשנו חצי זווית התכנסות גדולה מאוד של 25 mrad. <p class="jove_content" fo:keep-tog...

דוח זה מתאר פרוטוקול הכנת דגימה ותנאי הדמיה ספציפיים לביצוע טומוגרפיה אלקטרונית של שידור סריקה של דגימות ביולוגיות עבות.

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להשיג שחזור תלת מימדי עם שחזור עומק שדה של דגימה ביולוגית עבה באמצעות טומוגרפיה אלקטרונית של סריקת קרן מתכנסת. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה המבנית לגבי טומוגרפיה אלקטרונית של דגימות ביולוגיות עבות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לרכוש תמונות במצב סיביות מתכנס וניתן לבצע את עיבוד הנתונים ברוב התוכנות המוקדשות לטומוגרפיה.כדי להתחיל בהכנת דגימת תרבית תאים, צנטריפוגה את הדגימה ב-5000 x גרם למשך חמש דקות. השתמש בפרמטרי צנטריפוגה אלה במהלך הכנת הדגימה. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של PBS מועשר ב-4% פרפורמלדהיד ו-2% גלוטרלדהיד.דגרו את המתלה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה את התערובת, השליכו את הסופרנטנט ושטפו את הגלולה שלוש פעמים עם מנות מיליליטר אחת של PBS. באמצעות אותם תנאי דגירה והליך כביסה, דגרו את הגלולה במיליליטר אחד של PBS, מועשר ב-1% אוסמיום טטרוקסיד, ובמיליליטר אחד של PBS מועשר ב-2% אורניל אצטט.לאחר מכן, מצננים את הדגימה לארבע מעלות צלזיוס. לייבש את הגלולה על ידי דגירה רצופה בתמיסות אתנול מרוכזות יותר ויותר. שמירה על טמפרטורת הדגימה של ארבע מעלות צלזיוס לאורך כל הדגירה, הצנטריפוגה והכביסה.השעו מחדש את הגלולה המיובשת במיליליטר אחד של אתנול טהור, ודגרו למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, אפשר לדגימה להתחמם לטמפרטורת החדר, וצנטריפוגה את הדגימה. דגרו את הגלולה בתמיסות שרף אפוקסי מרוכזות יותר ויותר בטמפרטורת החדר.לאחר הכביסה הסופית, השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של שרף אפוקסי טהור, ודגרו למשך הלילה בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה את הדגימה, והסר את הסופרנטנט, ולאחר מכן השהה מחדש את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של שרף אפוקסי ומקשה. העבירו את המתלה לקפסולה.דגרו את קפסולת הפלסטיק בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות כדי לפלמר את השרף. הסר את הקפסולה מהחממה וודא פילמור שרף. הוסף שכבה של שרף אפוקסי ומקשיח מעל הדגימה המוטמעת ודגר את הקפסולה שוב באותם תנאים.הרכיב את הדגימה המוטמעת בשרף הפוך במחזיק דגימה. תקן היטב את הדגימה על בלוק החיתוך של אולטרה-מיקרוטום. חותכים את קפסולת הפלסטיק מהדגימה בשרף.מעצבים את השרף החשוף לפירמידה. לאחר מכן העבירו את הקפסולה ואת מחזיק הדגימה לזרוע הנעה של האולטרה-מיקרוטום. התקן סכין זמירה ומונחה על ידי מיקרוסקופ, חדד את צורת הפירמידה.החלף את סכין החיתוך בסכין היסטולוגיה. מתחת למיקרוסקופ, כוונן את זווית גובה הקפסולה כך שהפירמידה תהיה בניצב לקצה הסכין. הגדר את מהירות החיתוך וחתך את המדגם.לאחר חיתוך הדגימה, העבירו את החלק הנבחר לרשת נחושת מטופלת על נייר סינון. הניחו לדגימה להתייבש ולאחר מכן טענו את הדגימה למיקרוסקופ האלקטרונים. כדי לתכנן את סדרת ההטיה המוקדית, חשב תחילה את עומק השדה של קרן האלקטרונים ואת העובי הנראה המרבי של הדגימה.בהתבסס על ערכים אלה, בחר מרווח מיקוד וקבע את מספר שלבי המוקד הדרושים כדי לצלם את הדגימה כולה בעובי הנראה המרבי. לאחר מכן, בהגדלה נמוכה, אתר את אזור העניין בתוך המדגם. כוונן את הגובה האוצנטרי כך שהחזר ה-ROI לא ייראה כאילו הוא זז בעת סיבוב הדגימה.ודא שהחזר ה-ROI נשאר גלוי לאורך כל טווח ההטיה. מלא את הפרמטרים של סדרת הטיית המוקד לאיסוף תמונות אוטומטי ורכוש את התמונות. ייבא את סדרת התמונות לתוכנית עיבוד תמונה, ויישר את התמונות שנאספו באותה זווית הטיה בהיררכיה פירמידלית.מצא את היישור בכל זווית הטיה על-ידי ערימת התמונות המיושרות. דפדף באוסף כדי לוודא שרק האזור הממוקד עובר מתמונה לתמונה ויישר מחדש את התמונות בהתאם לצורך. לאחר אימות היישור בכל הדגימה, מזג את המידע במיקוד בהגדרות הגבוהות כדי להפיק את הסדרה עם תמונה אחת לכל זווית הטיה.בצע יישור חיפוש של סדרת ההטיה על סמך מינימום מקומי או סמנים נאמנים. בצע שחזור תלת-ממדי ובדוק את התמונה המתקבלת. אם השחזור נראה מטושטש או מעוות, יישר מחדש את סדרת התמונות המקורית.דגימה של T. brucei צולמה ונותחה בשיטה זו. בזווית הטיה של אפס מעלות, נראים מספר פרטים של כיס הדגל.בזווית ההטיה הגבוהה יותר של 70 מעלות, רק חלק מכל תמונה שנאספה בסדרת המוקד נמצא בפוקוס. עמדה זו משתנה לאורך הסדרה. על ידי מיזוג הקטעים במיקוד, נוצרת תמונה בודדת עם אזור מיקוד גדול יותר.אפקט זה בולט עוד יותר כאשר אזורי התדר הגבוה של סדרת הטיית המוקד מודגשים. המידע בתדר גבוה משתרע על פני רוב התמונה המשולבת, מה שמצביע על כך שסדרת ההטיה המוקדית דרך עובדה היטב. לאחר השליטה, ניתן לבצע את חלק עיבוד התמונה תוך כשלוש עד ארבע שעות, בהתאם לפרמטרי היישור והשחזור שנבחרו.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שאיכות השחזור הסופי תלויה מאוד באיכות בדיקות היישור הקודמות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לבצע את האוסף ועיבוד התמונה של סדרת הטיה מוקדית.

preparation-observation-thick-biological-samples-scanning

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אנו מציגים פרוטוקול על איך לנצל טומוגרפיה קריו-אלקטרון תפוקה גבוהה כדי לקבוע ברזולוציה גבוהה במבנים באתרו של מכונות מולקולריות. הפרוטוקול מאפשר כמויות גדולות של נתונים לעיבוד, ימנע צווארי בקבוק משותפים ומפחית את זמן ההשבתה משאב, המאפשר למשתמש להתמקד בשאלות ביולוגיות חשובות.

באמצעות Tomoauto: פרוטוקול לתפוקה גבוהה אוטומטית קריו אלקטרון טומוגרפיה

מחקר זה מציג אמין וקל נהלי קבלת טורי ודק במיוחד חלקים מיקרואורגניזם ללא ציוד יקר במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים.

שיטה להשגת טורי זגוגית מקטעים של מיקרואורגניזמים במשחק במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים

כאן, אנו מציגים פרוטוקולי עיבוד מפורטים לדימות דגימות רקמה עדינה באמצעות סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני (SEM). שלוש שיטות עיבוד שונות, כלומר, האודיאתיל disilazana (HMDS) ייבוש כימי, ייבוש אוויר פשוט, וייבוש נקודה קריטית מתוארים להכנת קליפות בביצה נוקשה, עוברים בשלבים התפתחותיים מוקדם, ותרבויות פטרייתי בהתאמה.

עיבוד העובר, קליפת ביצה, ופטרייתי תרבות לסריקת מיקרוסקופ אלקטרוני

אנו מתארים את הכנת רצועות של מקטעים טוריים ואת האוסף שלהם על תמיכה בהעברה גדולה לשימוש כדגימות טומוגרפיה של מערך, יחד עם הליכי הדמיה אוטומטיים במיקרוסקופ אלקטרונים סורק. הפרוטוקול מאפשר סינון, אחזור והדמיה ממוקדת של אירועים מקומיים ונדירים ורכישת אמצעי אחסון גדולים של נתונים.

זרימת עבודה טומוגרפיה של מערך לרכישה ממוקדת של מידע אודות אמצעי אחסון באמצעות סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים

שימוש בכרסום קרן יונים ממוקדת כדי לייצר זגוגית על הרשת מדגימות ביולוגיות קפואות עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונית.

הכנת Lamellae מדגימות ביולוגיות זגוגית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק קרן כפולה עבור טומוגרפיה קריו-אלקטרונים

הביקוש הגובר לאיסוף נתונים בקנה מידה גדול בטומוגרפיה קריוגנית של אלקטרונים דורש שגרת רכישת תמונות בתפוקה גבוהה. מתואר כאן פרוטוקול המיישם את ההתפתחויות האחרונות של אסטרטגיות רכישה מתקדמות שמטרתן למקסם את יעילות הזמן והתפוקה של איסוף נתונים טומוגרפיים.

אסטרטגיות לאופטימיזציה של רכישת נתונים טומוגרפיה אלקטרוגנית

הפרוטוקול הנוכחי מתאר טומוגרפיה קריו-אלקטרונית ברזולוציה גבוהה של קליטת נתונים מרחוק באמצעות Tomo5 ועיבוד נתונים וממוצע תת-טומוגרמה לאחר מכן באמצעות emClarity. אפופריטין משמש כדוגמה להמחשת תהליכים מפורטים שלב אחר שלב להשגת מבנה cryo-ET ברזולוציה של 2.86 Å.

טומוגרפיה של קריו-אלקטרונים איסוף נתונים מרחוק וממוצע תת-טומוגרמה

טומוגרפיה Cryo-STEM מספקת אמצעי לדמיין אברונים של תאים שלמים ללא הטבעה, חתך או תכשירים פולשניים אחרים. הרזולוציה התלת-ממדית המתקבלת נמצאת כיום בטווח של ננומטרים בודדים, עם שדה ראייה של מספר מיקרומטרים ועובי נגיש בסדר גודל של 1 מיקרומטר.

הדמיה של אברונים באתרם על ידי טומוגרפיה Cryo-STEM

פרוטוקול וידאו זה ממחיש כיצד לבצע טומוגרפיה של מיקרוסקופ אלקטרונים של שידור סריקה של דגימות וירולוגיה. לקבלת תוצאות מיטביות, הדגימות מוכנות על ידי הקפאה בלחץ גבוה והחלפת הקפאה לאחר מכן.

סריקת טומוגרפיה של מיקרוסקופ אלקטרונים שידור בווירולוגיה: הדמיה תלת מימדית של דגימות קפואות בלחץ גבוה, שהוחלפו בהקפאה

אנו מציגים פרוטוקול של איך לאסוף ואלקטרון תהליך cryo-tomograms של כל המיטוכונדריה. הטכניקה מספקת מידע מפורט לגבי המבנה, תפקוד, והארגון של קומפלקסי חלבוני קרום גדולים בקרומים ביולוגיים מקומיים.

ויזואליזציה של הדימרים synthase ATP במיטוכונדריה על ידי אלקטרונים קריו טומוגרפיה

למד הכנת דגימות ביולוגיות עבות לטומוגרפיית אלקטרונים בסריקת הילוכים. השיטה מאפשרת שחזור תלת-ממדי עם החזרת עומק שדה לחקר ביולוגיה מבנית.

הכנה תצפית של דגימות ביולוגיות העבה ידי סריקת הילוכים אלקטרונים טומוגרפיה

גלה סרטונים נוספים