Name: חיישן מבוסס-Aptamer עבור Unchelated גדוליניום (III) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 15 s
Description: למדו שיטת זיהוי פלואורסצנטית לגילוי יוני גדוליניום לא מצומדים בתמיסות מימיות באמצעות חיישן מבוסס aptamer. השיטה מאפשרת זיהוי ברגישות גבוהה בריכוזים תת-מיקרומולריים ומבטיחה בטיחות של סוכני ניגוד ל-MRI.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות לד"ר מילאן נ' סטויאנוביץ' מאוניברסיטת קולומביה, ניו יורק, ניו יורק על תרומה מדעית רבת ערך. עבודה זו נתמכת על ידי מימון מאוניברסיטת קליפורניה סטייט איסט ביי (CSUEB) ומענק התמיכה בפקולטה של CSUEB - חוקר פרטני. O.E., T.C. ו-A.L. נתמכו על ידי מלגת מרכז CSUEB למחקר סטודנטים (CSR).

הערה: מי כיתה וביולוגיה מולקולריים משמשים בכל הכנות חיץ פתרון. כל הצינורות הפנויים (microcentrifuge ו- PCR) וטיפי pipet הם DNase- ו RNase חינם. יש להתייעץ עם גיליון נתוני בטיחות חומרים (MSDS) עבור כל הכימיקלים לפני השימוש. שימוש בציוד מגן אישי מתאים (PPE) מומלץ בחום. 1. הכנת פתרונות מניות Aptamer <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכוש 2 קווצות polydeoxynucleotide מסחרית. להזמין שני גדילים עם טיהור באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC). גדיל 1 (-aptamer ה &#39;): 5 &#39;- / 56-FAM / AGGCTCTCGGGACGACCAGTTGGTCCCGCTTTATGTGTCCCGAG-3 &quot; סטרנד 2 (QS): 5&#39;-GTCCCGAGAGCCT / 3Dab / -3 &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים כל קווצה מים לעשות 100 פתרונות מניות בודדות מיקרומטר של aptamer-ה &#39;ואת QS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן פתרונות אלה ב -20 ° C. הפתרונות הם יציבים עד כה, במשך 3 שנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למזער FreeZדואר ההפשרה מחזורים, לאחסן את פתרונות המניות ב 10 aliquots μL. </li></ol> 2. הכנת הפתרון-חיישן ה 2x <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את החיץ assay (20 HEPES מ&quot;מ, 2 מ&quot;מ MgCl 2, 150 מ&quot;מ NaCl, KCl 5 מ&quot;מ). התאם את ה- pH ל ~ 7.4 עם NaOH ו HCl, ולסנן דרך מסננים העליון בקבוק חד פעמי סטרילי עם קרום 0.2 מיקרומטר PES. אחסן בבקבוקים סטריליים. אם מסונן מאוחסן כראוי (בטמפרטורת החדר), למאגר יציב עד כה, עבור 2 שנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 1 μL של פתרון ה-aptamer המניות (משלב 1.2) ו -2 μL של פתרון המניות QS (משלב 1.2) ב 497 μL של חיץ assay. מערבבים היטב בעזרת מערבולת. הריכוזים שלהם בפתרון ה-חיישן 2x הם 200 ננומטר ו 400 ננומטר, בהתאמה. הערה: היקף הפתרון ה-חיישן 2x מוכן בשלב זה הוא 500 μL, וזה מספיק כדי לבדוק 6 - 7 ריכוזים שונים של אלוקים 3+ עבור עקומת הכיול ואת הפתרונות חומר ניגוד(שלב 3). כל דגימה תיתן בארות כפולות צלחת 384 גם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את עוצמת הקול של פתרון 2x אלוקים-החיישן פי מספר פתרונות 3+ האלוקים שצריך להיבדק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפתרון-חיישן ה 2x ל -9 צינורות PCR, עם 50 μL לתוך צינור אחד. מניחים את צינורות Cycler תרמית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תוכנית Cycler התרמית כדי לחמם את הפתרון המוצע עבור צינורות עד 95 מעלות צלזיוס, להחזיק למשך 5 דקות, ואז לאט לאט לקרר את פתרונות ל -25 מעלות צלזיוס מעל ~ 15 דקות (בשיעור של ~ 0.05 - 0.1 ° C / ים). מחזור החימום וקירור הוא להבטיח הכלאה אופטימלית בין aptamer-ה &#39;ואת QS. תוצאות הכלאה חלקית מרווה שלמה קרינת רקע גבוהה של החיישן. אם Cycler תרמית אינו זמין, לבצע את התהליך הזה באמצעות אמבט מים חמים במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מצונן עד 25 מעלות צלזיוס, מיד להשתמש הפתרון, או לשמור Cycler התרמית (עד כ 2 שעות) עד מוכן להיותמְשׁוּמָשׁ. כאשר באמבט מים משמש למערכות החימום, לעזוב את הצינורות באמבטיה כמו המים מתקררים לאט לטמפרטורת חדר. </li></ol> 3. בניית עקומת כיול הקרינה לאיתור נוכחות של הקב&quot;ה Unchelated 3+ בתמיסה של חומר ניגוד אלוקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים GdCl 3 מוצק למאגר assay (אותו למאגר כמו בשלב 2.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות דילול סדרתי, להכין 100 μL כל אחד 6 פתרונות 3+ שוני אלוקים צינורות microcentrifuge ב כפול הריכוזים הרצויים הסופיים עבור עקומת הכיול (2x פתרונות). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדוגמה, כדי לבנות כיול עבור 0 (מאגר בלבד ללא GdCl 3), 50, 100, 200, 400, ו -800 ננומטר של הקב&quot;ה 3+, להכין תמיסות המכילות 0, 100, 200, 400, 800, ו -1,600 ננומטר של היון. הקפד תמיד לכלול את &quot;אטומים&quot; עם 0 ננומטר אלוקים 3+ כמו שליטה שלילית. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את חומר ניגוד להיות מבחןאד למאגר assay. כן 2 או 3 ריכוזים שונים של פתרונות חומר ניגוד דרך דילול סדרתי. הערה: בדיקת 3 ריכוזים שונים של פתרון חומר ניגוד מומלצת. זו היא להבטיח כי ריכוזים אלה נמצאים בטווח ליניארי. אם בדגימות שנבדקו אינו מציג קשר לינארי, הקטינו את הריכוזים של חומר הניגוד בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את צינורות PCR המכיל את פתרון 2x אלוקים-חיישן משלב 2.5 מתוך Cycler התרמית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μL של כל פתרון ה 3+ משלב 3.2 לתוך 6 מתוך 9 צינורות PCR המכיל את פתרון 2x אלוקים-חיישן. מערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה. כל צינור PCR מכיל כעת את הריכוז הרצוי של הקב&quot;ה 3+ להיבדק, 100 ננומטר אלוקים-aptamer, ו -200 ננומטר QS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל צינורות הנותרים PCR המכיל את פתרון 2x אלוקים-חיישן, להוסיף 50 μL של פתרונות חומר ניגוד משלב 3.3. מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה כמה פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה שלolutions בתוך צינורות PCR במשך כ 5 דקות בטמפרטורת החדר. הם עשויים להיות שנותרו לעמוד עד 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 45 μL של כל צינור לתוך צלחת 384 גם. כל צינור PCR ייתן בארות כפולות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את הקרינה של כל אחד גם על קורא צלחת. Fluorophore (FAM) המשמש לעיצוב חיישן-ה &#39;יש מקסימום עירור ופליטה של ​​ננומטר 495 ו -520 בהתאמה, כמפורט באתר האינטרנט של הספק. בחר אורכי גל עירור ופליטה מתאימים או מסנן תלויים אם הצליח-הקורא monochromator- או מסנן מבוסס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שרטט את הגרף של קרינה ביחידות קרינה שרירותיות (עפו) נגד ריכוז של קב&quot;ה 3+. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שרטט את הגרף כמו שינוי לקפל הקרינה נגד ריכוז של הקב&quot;ה 3+. חשב את השינוי לקפל הקרינה על ידי חלוקת עפו של כל ריכוז ידי עפו של הפתרון &quot;אטומים&quot; (עם 0 ננומטר של הקב&quot;ה 3+). השינוי לקפל קרינה יאפשר עבור normalization של התוצאות, צריך התצוגה עפה עת מסוימת (בימים שונים, וכו &#39;) וריאציות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השווה את פליטת הקרינה של תמיסה המכילה חומר הניגוד ו &#39;ריק&#39;, המהווה את התמיסה המכילה 0 ננומטר GdCl 3 (מאגר בלבד). הערה: קרינה גבוהה יותר של פתרון GBCA מרמזת על הנוכחות של unchelated אלוקים 3+, אשר עשוי להצריך טיהור נוספת של חומר הניגוד. הכמות הנוכחית 3+ unchelated האלוקים ניתן להעריך באמצעות עקומת הכיול נבנתה בשלב 3.10 או 3.11. </li></ol>

<ol><li>Shen, C., New, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promising+strategies+for+Gd-based+responsive+magnetic+resonance+imaging+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Promising strategies for Gd-based responsive magnetic resonance imaging contrast agents.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 158-166 (2013).</li>
<li>Cheong, B. Y. C., Muthupillai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephrogenic+systemic+fibrosis%3A+a+concise+review+for+cardiologists%5BTitle%5D)+AND+%22Tex.+Heart+Inst.+J%22%5BJournal%5D)">Nephrogenic systemic fibrosis: a concise review for cardiologists.</a> Tex. Heart Inst. J. 37 (5), 508-515 (2010).</li>
<li>Hao, D., Ai, T., Goerner, F., Hu, X., Runge, V. M., Tweedle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+contrast+agents%3A+basic+chemistry+and+safety%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn.+Reson.+Imaging%22%5BJournal%5D)">MRI contrast agents: basic chemistry and safety.</a> J Magn. Reson. Imaging. 36 (5), 1060-1071 (2012).</li>
<li>Telgmann, L., Sperling, M., Karst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+gadolinium-based+MRI+contrast+agents+in+biological+and+environmental+samples%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Determination of gadolinium-based MRI contrast agents in biological and environmental samples: a review.</a> Anal. Chim. Acta. 764, 1-16 (2013).</li>
<li>Frenzel, T., Lengsfeld, P., Schirmer, H., Hütter, J., Weinmann, H. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+gadolinium-based+magnetic+resonance+imaging+contrast+agents+in+human+serum+at+37+degrees+C%5BTitle%5D)+AND+%22Invest.+Radiol%22%5BJournal%5D)">Stability of gadolinium-based magnetic resonance imaging contrast agents in human serum at 37 degrees C.</a> Invest. Radiol. 43 (12), 817-828 (2008).</li>
<li>Loreti, V., Bettmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+MRI+contrast+agent+Gd-DTPA+by+SEC-ICP-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Determination of the MRI contrast agent Gd-DTPA by SEC-ICP-MS.</a> Anal. Bioanal. Chem. 379 (7), 1050-1054 (2004).</li>
<li>Telgmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speciation+and+isotope+dilution+analysis+of+gadolinium-based+contrast+agents+in+wastewater%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Speciation and isotope dilution analysis of gadolinium-based contrast agents in wastewater.</a> Environ. Sci. Technol. 46 (21), 11929-11936 (2012).</li>
<li>Cleveland, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic+methods+for+the+quantification+of+free+and+chelated+gadolinium+species+in+MRI+contrast+agent+formulations%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chromatographic methods for the quantification of free and chelated gadolinium species in MRI contrast agent formulations.</a> Anal. Bioanal. Chem. 398 (7), 2987-2995 (2010).</li>
<li>Edogun, O., Nguyen, N. H., Halim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+single-stranded+DNA-based+assay+for+detecting+unchelated+gadolinium%28III%29+ions+in+aqueous+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent single-stranded DNA-based assay for detecting unchelated gadolinium(III) ions in aqueous solution.</a> Anal. Bioanal. Chem. 408 (15), 4121-4131 (2016).</li>
<li>Barge, A., Cravotto, G., Gianolio, E., Fedeli, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+determine+free+Gd+and+free+ligand+in+solution+of+Gd+chelates.+A+technical+note%5BTitle%5D)+AND+%22Contrast+Med.+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">How to determine free Gd and free ligand in solution of Gd chelates. A technical note.</a> Contrast Med. Mol. Imaging. 1 (5), 184-188 (2006).</li>
<li>Johansson, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+reporter-quencher+pairs+for+efficient+quenching+through+formation+of+intramolecular+dimers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Choosing reporter-quencher pairs for efficient quenching through formation of intramolecular dimers.</a> Methods Mol. Biol. 335, 17-29 (2006).</li>
<li>Sherry, A. D., Caravan, P., Lenkinski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+on+gadolinium+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson.+Imaging%22%5BJournal%5D)">A primer on gadolinium chemistry.</a> J. Magn. Reson. Imaging. 30 (6), 1240-1248 (2009).</li>
<li>Shakhverdov, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-relaxation+mechanism+of+fluorescence+quenching+in+complexes+of+lanthanide+ions+with+organic+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">A cross-relaxation mechanism of fluorescence quenching in complexes of lanthanide ions with organic ligands.</a> Opt. Spectrosc. 95 (4), 571-580 (2003).</li>
<li>Brittain, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submicrogram+determination+of+lanthanides+through+quenching+of+calcein+blue+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Submicrogram determination of lanthanides through quenching of calcein blue fluorescence.</a> Anal. Chem. 59 (8), 1122-1125 (1987).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

שימוש בחיישן ה-מבוסס aptamer, גידול פליטת קרינה כי היא יחסית ריכוז unchelated אלוקים 3+ הוא ציין. כדי למזער את כמות מדגם, assay ניתן לרוץ microplate 384 גם עם נפח דגימה כולל של 45 μL לכל טוב. בתכנון זה, הבחירה של והעמסה (FAM) ו dabcyl (DAB) התבססה בעיקר על העלות של החומרים הכימיים; כדי לשנות את אורך גל הפליטה, זיווג של fluorophore שונה מרווה ניתן להשתמש 11. חשוב לציין כי על מנת להשיג את התוצ...

החשיבות הגוברת של דימות תהודה מגנטית (MRI) באבחון קליני, אשר מוגבל על ידי רגישות הטבועה של הטכניקה, הביאה את הצמיחה המהירה של המחקר על פיתוח של חומרי ניגוד מבוססי גדוליניום רומן (GBCAs) 1. GBCAs הם מולקולות אשר מנוהלים על מנת לשפר את איכות התמונה, ובדרך כלל יש להם את המבנה הכימי של יון גדוליניום trivalent (ה 3+) מתואם ליגנד polydentate. Complexation זה הוא בעל חשיבות קריטית כפי שהקב&quot;ה unchelated 3+ הוא רעיל; זה כבר לידי ביטוי בהתפתחות של סיסטיק מערכתית nephrogenic בחלק מהחולים עם מחלת כליות או אי ספיקת 2. כתוצאה מכך, הקולט את היון חינם המימי הוא סייע להבטיח את שלומם של GBCAs. הנוכחות של 3+ unchelated הקב&quot;ה בפתרונות GBCA לעתים קרובות היא תוצאה של תגובה מלאה בין ליגנד ואת יון, דיסוציאציה של המתחם, או displacement ידי קטיונים מתכת ביולוגיים אחרים 3. בין מספר טכניקות המשמשות כיום לקביעת הנוכחות של קב&quot;ה 3+, שמסתמך על כרומטוגרפיה ו / או דרגת ספקטרומטריית הגבוהה ביותר מבחינת צדדיות ותחולה 4. בין שאר מעלותיו שלהם גבוהה רגישות ודיוק, היכולת לנתח מטריצות מדגם שונות (כולל בסרום אדם 5, שתן ושיער 6, שפכים 7, ועל ניסוחים חומר ניגוד 8), ואת כימות סימולטני של מתחמי ה 3+ מרובים (הרישום של מחקרים קודמים עד 2013 מתוארת סקירה מקיפה על ידי Telgmann et al.) 4. החסרון היחיד הוא כי כמה שיטות אלה דורשים instrumentations (כגון מצמידי אינדוקטיבי ספקטרומטריית פלזמה המונית) 4 כי מעבדות מסוימות עשויות לא תהיינה גישה. במסגרת גילוי GBCA רומן על מחקר הוכחה של קונספט רמות, arelatively יותר נוחה, מהירה, וחסכוני שיטה מבוססת ספקטרוסקופיות (כגון ספיג או קרינת UV-Vis) עשויה לשמש אלטרנטיבה יקרה. בעזרת יישומים אלה בחשבון, חיישן פלורסנט מבוסס aptamer עבור מימיית אלוקים 3+ פותח 9. Aptamer (חס-aptamer) הוא מולקולת DNA חד-גדילי ארוך 44-בסיס עם רצף של בסיסים כי היה מבודד בתהליך האבולוציה שיטתית של ligands על ידי העשרה מעריכי (Selex) 9. כדי להתאים את aptamer לתוך חיישן ניאון, fluorophore מחוברת התחנה הסופית &#39;5 של גדיל, אשר הוא הכלאה ואז עם גדיל מרווה (QS) באמצעות 13 בסיסים משלימים (איור 1). QS מתויג עם מולקולת מרווה בחושך ב 3 התחנה הסופית &#39;. בהיעדר ה 3+, החיישן (חס-חיישן), מורכב ביחס של 1: 2 חפרפרת של הקב&quot;ה-aptamer ו QS בהתאמה, יהיה t בשל פליטת קרינה מינימאליתo העברת אנרגיה מן fluorophore אל מרווה. התוספת של מימית אלוקים 3+ יהיה לעקור את QS מן הקב&quot;ה-aptamer, וכתוצאה מכך גידול פליטת הקרינה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55216/55216fig1.jpg" /> איור 1. החיישן (חס-חיישן) שמורכב של aptamer הארוך 44-הבסיס (-aptamer ה &#39;) מתויג עם והעמסה (א fluorophore) ואת גדיל המרווה ארוך 13-בסיס (QS) מתויג עם dabcyl (א מרווה כהה) . בהעדר unchelated אלוקים 3+, הקרינה של החיישן היא מינימלית. עם תוספת של הקב&quot;ה 3+, עקירה של QS מתרחשת וגידול פליטת הקרינה הוא ציין. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55216/55216fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> יש כרגע, אחד נפוצה מבוסס ספקטרוסקופיות שיטה לזהותing 3+ אלוקים מימי. Assay זו משתמשת תפוז xylenol מולקולה, אשר עוברת שינוי אורך הגל קליטה מקסימלית מפני 433 עד 573 ננומטר על קלאציה אל יון 10. יחס מקסימום ספיגת שני אלה יכולים לשמש כדי לכמת את כמות unchelated אלוקים 3+. חיישן aptamer מהווה חלופה (יכול להיות גם משלים) אל assay הכתום xylenol, כמו שתי השיטות יש תנאי תגובה שונים (כגון pH ורכב של תמיסות בופר בשימוש), selectivities היעד, טווח ליניארי של כימות, ואופני זיהוי 9.

<table><tbody><tr><td>Gd-aptamer</td><td>IDTDNA</td><td>רצף קלט ושינוי פלואורופור בצורת הסדר</td><td>ניתן להשתמש בפלואורופור עם אורך גל פליטה שונה. ניתן להזמין את האפטמר גם מחברה אחרת.</td></tr><tr><td>גדיל מרווה</td><td>IDTDNA</td><td>רצף קלט ושינוי מרווה בצורת הסדר</td><td>ניתן להשתמש במרווה שונה להעברת אנרגיה אופטימלית מהפלואורופור. ניתן להזמין את האפטמר גם מחברה אחרת.</td></tr><tr>מים <td></td><td></td><td>בדרגת ביולוגיה מולקולרית</td><td>אין יצרן ספציפי, גם DEPC וגם לא מטופל DEPC עובדים באותה מידה</td></tr><tr><td>גדוליניום (III) כלוריד נטול מים</td><td>Strem</td><td>936416</td><td>HEPES רעיל</td></tr><tr><td></td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד נטול מים</td><td>MP ביומדיקל</td><td>0520984480 - 100 גרם</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>אקרוס אורגני</td><td></td><td></td>327300025</tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>P333-500</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד, כדורים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP359</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td> קורוזיבית <td>פישר סיינטיפיק</td><td>SA49</td><td>רעיל וקורוזיבי</td></tr><tr><td>384 בארות אוגן נמוך שחור שטוח תחתון פוליסטירן NBS לוחות</td><td>קורנינג</td><td>3575</td><td>המתאימות לפלואורסצנטיות נדרשת קריאה.</td></tr><tr><td>מסנן עליון בקבוק חד פעמי סטרילי של Nalgene Rapid-Flow</td><td>Thermo Scientific</td><td>5680020</td><td>החלק העליון של הבקבוק מצויד בקרום PES 0.2 מיקרון</td></tr><tr><td>בקבוקים סטריליים חד פעמיים 250 מ"ל</td><td>קורנינג</td><td>430281</td><td>ניתן להשתמש בבקבוק גדול או קטן יותר</td></tr> צינורות <tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td></td><td></td> של 1.5 מ"ל <td>אין יצרן ספציפי, כל עוד הם צינורות PCR 0.2 מ"ל נטולי</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>DNA ו-RNAseאין יצרן ספציפי, כל עוד הם</td>Micropipets</tr><tr><td></td><td></td><td></td> נטולי DNAse ו-RNAse <td>אין יצרן ספציפי</td></tr><tr><td>טיפים ל-Pipet (לא מסנן) בגדלים</td><td></td><td></td> מתאימים <td>אין יצרן ספציפי, כל עוד הם נטולי DNAse ו-RNAse</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plate</td><td>Reader Biotek Synergy H1</td><td></td><td>קוראי צלחות של יצרנים אחרים יעבדו באותה מידה</td></tr></tbody></table>

חיישן מבוסס-aptamer עבור unchelated גדוליניום (iii)

An Aptamer-based Sensor for Unchelated Gadolinium(III)

מודגמת שיטה לקביעת נוכחותו של יון גדוליניום תלת-ערכי לא כלאטי (Gd3+) בתמיסה מימית. Gd3+ קיים לעתים קרובות בדגימות של חומרי ניגוד מבוססי גדוליניום כתוצאה מתגובות לא שלמות בין הליגנד ליון, או כתוצר דיסוציאציה. מכיוון שהיון רעיל, יש חשיבות קריטית לגילויו. כאן מתוארים התכנון והשימוש בחיישן מבוסס aptamer (חיישן Gd) עבור Gd3+. החיישן מייצר שינוי פלואורסצנטי בתגובה להגדלת הריכוזים של היון, ויש לו מגבלת זיהוי בתחום הננו-מולרי (~100 ננומטר עם יחס אות לרעש של 3). ניתן להפעיל את הבדיקה במאגר מימי ב-pH הסביבה (~7 - 7.4) במיקרו-פלטה של 384 בארות. החיישן אינו מגיב יחסית כלפי יוני מתכת רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית כגון יוני נתרן, אשלגן וסידן, אם כי הוא אינו ספציפי ל-Gd3+ על פני לנתנידים תלת-ערכיים אחרים כגון יורופיום (III) וטרביום (III). עם זאת, הלנתנידים אינם נמצאים בדרך כלל בחומרי ניגוד או במערכות הביולוגיות, ולכן ניתן להשתמש בחיישן כדי לקבוע באופן סלקטיבי Gd3+ בתנאים מימיים.

שינוי קרינה אופייני הפתרון ה-החיישן בנוכחות unchelated אלוקים 3+ מוצג באיור 2. הפליטה ניתן להתוות כשינוי לקפל פלואורסצנטי (איור 2 א) או את קרינת הגלם לקרוא (תרשים 2B) ביחידות כלשהן (עף). מגרשי שני להניב עקומות כיול דומות מאוד עם מגוון ליניארי לריכוזי ה 3+ מתחת ל -1 מיקרומטר ו רוויה של האות ב&gt; 3 מיקרומטר. המגבלה של זיהוי היא ~ 100 ננומטר עם יחס אות לרעש של 3. <p class="j...

מתואר השימוש במולקולות פולידאוקסינוקלאוטיד (44-mer aptamer) לחישת יון גדוליניום (III) בתמיסה מימית. נוכחות היון מתגלה באמצעות עלייה בפליטת הקרינה של החיישן.

חיישן מבוסס-Aptamer עבור Unchelated גדוליניום (III)

A method for determining the presence of unchelated trivalent gadolinium ion (Gd3+) in aqueous solution is demonstrated. Gd3+ is often present in samples ...

המטרה הכללית של בדיסה מבוססת פלואורסצנציה זו היא לזהות נוכחות של יוני גדוליניום רעילים שאינם קלואטיים בתמיסות מימיות המכילות חומרי ניגוד לצילומי תהודה מגנטית (MRI). שיטה זו עשויה לסייע בבדיקת חומרי ניגוד ל-MRI המבוססים על גדוליניום, על ידי אספקת אמצעי להבטחת רמה גבוהה של טוהר עבור החומרים המסונתזים. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת לזהות ריכוזים סב-מיקרומולריים של גדוליניום רעיל שאינו קלואטי, עם סלקטיביות גבוהה יחסית ביחס לקטיונים של מתכות ביולוגיות אחרות.כדי להתחיל בהליך זה, הכין את באפר המדידה כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. בעזרת נתרן הידרוקסיד וחומצה כלורית, כוון את ה-pH ל-7.4. לאחר מכן, סנן את הבאפר באמצעות מסנן חד-פעמי סטרילי המותקן על פיית הבקבוק עם ממבנה PES של 0.2 מיקרון.בשלב הבא, העבירו 497 µL של באפר המערך (assay buffer) לתוך מבחנה נקייה למיקרו-צנטריפוגה. הוסיפו 1 µL של תמיסת מלאי מוכנה של אפטמר גדולניום (gadolinium aptamer) ו-2 µL של תמיסת מלאי מוכנה של QS. העבירו 50 µL מתמיסת חיישן הגדולניום 2X זו לתוך כל אחת מתשע מבחנות PCR.לאחר מכן, העבירו את המבחנות למכשיר תרמו-סייקליסט (thermal cycler). הגדירו את התרמו-סייקליסט לחימום הדגימות ל-95 °C למשך חמש דקות, ולאחר מכן קירור הדרגתי של התמיסות ל-25 °C במשך 15 דקות. חשוב לזכור לחמם את תמיסות חיישן הגדוליניום בריכוז 2X ל-95 °C, ולאחר מכן לבצע קירור איטי לטמפרטורת החדר לפני הוספת תמיסת יוני הגדוליניום.בתחילה, המיסו gadolinium trichloride מוצק בבופר מדידה (assay buffer) כדי להכין תמיסת סטוק של gadolinium three בריכוז הרצוי. באמצעות דילול סדרתי, הכינו שש תמיסות gadolinium three בנפח 100 µL כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, המיסו את חומר הניגוד לבדיקה בבופר מדידה.השתמשו בדילול סדרתי כדי להכין שלושה ריכוזים שונים. לאחר מכן, הוציאו מהסייקלר התרמי את מבחנות ה-PCR המכילות את תמיסת חיישן הגדוליניום בריכוז 2X. העבירו 50 µL מכל אחת משלוש תמיסות הגדוליניום למבחנות PCR נפרדות.שאוב כל תמיסה למעלה ולמטה עם הפ pipette מספר פעמים כדי לערבב. לאחר מכן, העבר 50 µL מכל תמיסת חומר הניגוד בנפרד לשאריות מבחנות ה-PCR. ערבב על ידי שאיבה למעלה ולמטה מספר פעמים.דגרו את כל תשעת התמיסות למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבירו 45 µL מכל תמיסה לפלטה בעלת 384 בארות, בשניחולים. לאחר מכן, רשמו ונתחו את נתוני הפלואורסצנציה כפי שפורט בפרוטוקול הכתוב.במחקר זה, מזוהה יון גדוליניום טריוולנטי שאינו כלובי (unchelated) בתמיסה מימית באמצעות שיטה מבוססת פלואורסצנציה. החיישן הפלואורסצנטי פותח על ידי חיבור פלואורופור לאפטמר. לאחר מכן, החיישן עובר היברידיזציה עם גדיל כיבוי (quenching strand), המסומן במולקולת כיבוי כהה (dark quencher).הוספה של gadolinium three דוחקת את גדיל המכבה (quenching strand) מהאפטמר, דבר הגורם לעלייה בפליטת הפלואורסצנציה. עקומי כיול מתקבלים באמצעות 100 nanomolar של aptamer לגדוליניום ו-200 nanomolar של QS, ומוצגים כפלואורסצנציה גולמית או כשינוי של מכפלה בפלואורסצנציה (fluorescence fold change). שתי העקומות מראות טווח ליניארי עבור ריכוזי gadolinium three נמוכים מ-1 micromolar ורוויה של האות בריכוזים מעל 3 micromolar.שתי מנות שונות של gadoteric acid מנותחות לאחר מכן עבור ריכוזים הנעים בין אפס millimolar ל-20 millimolar. בעוד שפליטת הפלואורסצנציה של הדגימה ברמת הטהרה הגבוהה אינה עולה באופן ניכר בטווח זה, נראה שינוי משמעותי בדגימה המכילה gadolinium three לא קלטורי בריכוזים נמוכים עד חמישה millimolar. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לוודא שאין בועות אוויר בבארות של המיקרופלטה, שכן הדבר ישנה את קריאת הפלואורסצנציה.באמצעות פרוצדורה זו, עשוי להיות לנו אפשרות לזהות אפילו כמויות קטנות של יוני gadolinium מחושבים בתמיסות המכילות חומרי ניגוד. זו תהיה שיטה טובה לקביעת טוהרם של החומרים. עבודה עם כימיקלים עלולה להיות מסוכנת, ולכן נקיטת אמצעי זהירות, כגון לבישת ציוד מיגון אישי, היא חשובה בעת ביצוע פרוצדורה זו.

an-aptamer-based-sensor-for-unchelated-gadolinium-iii

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

אנו מדגימים את metalation, טיהור, ואפיון של מתחמי lanthanide. מתחמי המתואר כאן יכול להיות מצומדת כדי מקרומולקולות כדי לאפשר מעקב של המולקולות הללו באמצעות דימות בתהודה מגנטית.

, טיהור הכנה, אפיון של מכלולים Lanthanide לשימוש בתור סוכנים בניגוד עבור דימות תהודה מגנטית

כדי להדגים הדמיה מולקולרית סרטן MR עם פפטיד קטן ממוקד חומר ניגוד MRI ספציפי לחלבוני פלזמה קרוש בstroma גידול במודל עכבר של סרטן ערמונית.

MR הדמיה המולקולרית של סרטן הערמונית עם חומר ניגוד ממוקד המולקולרי קטן CLT1 פפטיד

פרוטוקול מסופק לבחירת אפטמרים ממתגי מבנה עבור מטרות מולקולות קטנות בהתבסס על שיטת בחירת חרוזים מגנטיים קפדנית ניתנת לכוונון. אפטמרים שנבחרו עם תכונות מיתוג מבנה מועילים לבדיקות הדורשות שינוי קונפורמציה כדי לאותת על נוכחות מטרה, כגון בדיקת ננו-חלקיקי הזהב המתוארת.

שיטה לבחירת Aptamers מיתוג מבנה יישומית לColorimetric זהב Nanoparticle Assay

פרוטוקול זה מתאר את הסינתזה של ננו-חלקיקים כחולים פרוסיים ביו-פונקציונליים ואת השימוש בהם כסוכני הדמיה מולקולרית רב-מודאליים. לננו-חלקיקים יש עיצוב מעטפת ליבה שבו יוני גדוליניום או מנגן בתוך ליבת הננו-חלקיקים יוצרים ניגודיות MRI. המעטפת הביו-פונקציונלית מכילה פלואורופורים להדמיה פלואורסצנטית וליגנדים ממוקדים למיקוד מולקולרי.

Biofunctionalized הכחול פרוסים חלקיקים ליישומי הדמיה מולקולריים Multimodal

העיצוב והפיתוח של assay colorimetric nanoparticle aptamer-זהב לצורך זיהוי של מולקולות קטנות עבור in-the-שדה יישומים נבדק. בנוסף, יישום colorimetric חכם-התקן (אפליקציה) קיבלה תוקף ו אחסון לטווח ארוך של assay הוקמה לשימוש בתחום.

עיצוב ופיתוח של מבוסס Nanoparticle Aptamer-זהב מדד-צבע מבחנים עבור יישומי in-the-השדה

הליך הבידוד של EOB-DTPA ואת complexation הבא עם Ga הטבעי (III) ו -68 Ga מוצגת במסמך זה, כמו גם ניתוח מעמיק של כל התרכובות והחקירות יעילות תיוג, היציבות במבחנה ומי octanol / n- מקדם חלוקה של מתחם רדיואקטיבי.

חקירות על קומפלקס Ga (III) של EOB-DTPA ו שלה<sup&gt; 68</sup&gt; Ga radiolabeled Analogue

פרוטוקול זה מתאר את ההכנה ואפיון של תהודה מגנטית dendrimeric חומר ניגוד (MRI) שנושא chelates macrocyclic המבוסס cyclen תיאום יוני גדוליניום פאראמגנטיים. בסדרת ניסויי MRI במבחנה, סוכן זה מיוצר אות MRI מוגברת בהשוואה האנלוגית monomeric הזמין המסחרי.

הכנה<em&gt; במבחנה</em&gt; אפיון חומרי ניגוד מבוססי dendrimer עבור דימות תהודה מגנטית

פרוטוקול כדי להפוך את הבחירה במבחנה אפיון של חומצה פתלית המיועדות לקבוצות אסתר-איגוד ה-DNA aptamers מוצג. היישום של aptamer שנבחר ב aptasensor אלקטרוכימי נכלל גם.

חומצה פתלית אסתר מחייב DNA Aptamer ובחירת, אפיון, ליישום Aptasensor אלקטרוכימי

כאן, אנו מציגים את פרוטוקול כדי להשיג68Ga מסטול-הליבה תחמוצת ברזל חלקיקים באמצעות מונחי מיקרוגל מהר סינתזה. המתודולוגיה רינדור PET/חלקיקים MRI (T1) עם radiolabeling יעילות גבוהה יותר 90% וטוהר רדיוכימי 99% ב- 20-מין סינתזה.

סינתזה של 68המשחק מסטול-הליבה תחמוצת ברזל חלקיקים עבור כפול טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים/דימות תהודה מגנטית (T1)

הפרוטוקול הנוכחי מדגים את השימוש בבדיקת הגברה מעריכית מהירה, תלת שלבית, מבוססת אפטמר כדי לזהות מטרות. הכנת דגימות, הגברת אותות ופיתוח צבע מכוסים כדי ליישם מערכת זו כדי לזהות נוכחות של תיאופילין על פני זה של קפאין.

זיהוי מטרות מבוסס Aptamer המתאפשר על ידי תגובת הגברה מעריכית איזותרמית G-Quadruplex תלת-שלבית

אנו מתארים בדיקה פלואורסצנטית שיכולה לאשר במהירות ובזול את היכולת של תרכובות חדשות לכלאט ברזל. הבדיקה מודדת את יכולתן של תרכובות להתחרות בפעילות קשירת הברזל של הגשושית הפלואורסצנטית החלשה Calcein, וכתוצאה מכך עלייה ניתנת לכימות בפלואורסצנטיות כאשר מתרחשת כלציה.

שיטה פלואורסצנטית ניתנת לכימות וזולה ללא תאים כדי לאשר את היכולת של תרכובות חדשות לכלאט ברזל 

למדו שיטת זיהוי פלואורסצנטית לגילוי יוני גדוליניום לא מצומדים בתמיסות מימיות באמצעות חיישן מבוסס aptamer. השיטה מאפשרת זיהוי ברגישות גבוהה בריכוזים תת-מיקרומולריים ומבטיחה בטיחות של סוכני ניגוד ל-MRI.

חיישן מבוסס-Aptamer עבור Unchelated גדוליניום (III)

גלה סרטונים נוספים