חיישן מבוסס-Aptamer עבור Unchelated גדוליניום (III)
9 בינואר 2017
מתואר השימוש במולקולות פולידאוקסינוקלאוטיד (44-mer aptamer) לחישת יון גדוליניום (III) בתמיסה מימית. נוכחות היון מתגלה באמצעות עלייה בפליטת הקרינה של החיישן.
המטרה הכוללת של בדיקה מבוססת פלואורסצנטיות זו היא לזהות נוכחות של יון גדוליניום רעיל בתמיסות מימיות המכילות חומרי ניגוד הדמיית תהודה מגנטית. שיטה זו יכולה לעזור להקל על חומרי הניגוד MRI מבוססי גדוליניום על ידי מתן אמצעי להבטיח שוויון גבוה של חומרים מסונתזים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מסוגלת לזהות ריכוז תת-מיקרומולרי של גדוליניום רעיל ללא כלאט עם סלקטיביות גבוהה יחסית על פני קטיוני מתכת ביולוגיים אחרים.
כדי להתחיל בהליך זה, הכן את מאגר הבדיקה כמתואר בפרוטוקול הטקסט. בעזרת נתרן הידרוקסיד וחומצה הידרוכלורית, התאם את ה-pH ל-7.4. לאחר מכן, סנן את המאגר דרך מסנן בקבוק חד פעמי סטרילי עם קרום PES של 0.2 מיקרון.
לאחר מכן, העבירו 497 מיקרוליטר של מאגר הבדיקה לצינור מיקרו צנטריפוגה טרי. הוסף מיקרוליטר אחד של תמיסת מלאי גדוליניום אפטמר מוכנה ושני מיקרוליטר של תמיסת מלאי QS מוכנה. העבר 50 מיקרוליטר של פתרון חיישן גדוליניום 2X זה לכל אחד מתשעה צינורות PCR.
לאחר מכן, הנח את הצינורות למחזור תרמי. הגדר את המחזורי התרמי לחמם את הדגימות ל-95 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות, ולאחר מכן לקרר לאט את התמיסות ל-25 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. חשוב לזכור לחמם את פתרונות חיישן הגדוליניום 2X ל-95 מעלות, ולאחר מכן קירור איטי לטמפרטורת החדר לפני הוספת תמיסת יוני הגדוליניום.
כדי להתחיל, ממיסים גדוליניום טריכלוריד מוצק במאגר הבדיקה כדי ליצור תמיסת גדוליניום שלוש מלאי בריכוז הרצוי. באמצעות דילול סדרתי, הכינו שש גדוליניום של 100 מיקרוליטר שלוש תמיסות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, ממיסים את חומר הניגוד שייבדק במאגר הבדיקה.
השתמש בדילול סדרתי להכנת שלושה ריכוזים שונים. לאחר מכן, הסר את צינורות ה-PCR המכילים את תמיסת חיישן גדוליניום 2X מהמחזור התרמי. מעבירים 50 מיקרוליטר מכל תמיסת גדוליניום שלוש לצינורות PCR נפרדים.
פיפטה כל תמיסה למעלה ולמטה מספר פעמים לערבוב. לאחר מכן, העבירו 50 מיקרוליטר מכל תמיסת חומר מנוגד בנפרד לצינורות ה-PCR הנותרים. מערבבים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה מספר פעמים.
דגרו על כל תשע התמיסות למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבירו 45 מיקרוליטר מכל תמיסה לצלחת באר 384 בכפילויות. לאחר מכן, רשום ונתח נתוני פלואורסצנטיות כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
במחקר זה, יון גדוליניום תלת-ערכי לא כלאטי מזוהה בתמיסה מימית בשיטה מבוססת פלואורסצנטיות. חיישן הפלואורסצנט פותח על ידי הצמדת פלואורופור לאפטמר. לאחר מכן החיישן עובר הכלאה עם גדיל מרווה, המתויג במולקולת מרווה כהה.
התוספת של גדוליניום שלוש מעבירה את גדיל המרווה מהאפטמר, וגורמת לעלייה בפליטת הקרינה. עקומות כיול מתקבלות באמצעות אפטמר גדוליניום ננו-מולרי ו-200 QS ננו-מולרי ומתווים פלואורסצנטיות גולמית או שינוי קפל פלואורסצנטי. שתי העקומות מראות טווח ליניארי לגדוליניום שלושה ריכוזים מתחת למיקרומולר אחד ורוויה של האות בריכוזים מעל שלוש מיקרומולר.
לאחר מכן מנותחים שתי קבוצות שונות של חומצה גדוטרית לריכוזים הנעים בין אפס מילימולר ל-20 מילימולר. בעוד שפליטת הקרינה של דגימת הטוהר הגבוה אינה עולה באופן ניכר בטווח זה, נצפה שינוי משמעותי בדגימה המכילה גדוליניום לא כלאט שלוש בריכוזים נמוכים עד חמישה מילימולר. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לוודא שאין בועות אוויר בבארות של המיקרופלייט, מכיוון שהדבר ישנה את קריאת הפלורסנט.
באמצעות הליך זה, אנו עשויים להיות מסוגלים לזהות אפילו כמויות קטנות של יוני גדוליניום מחושבים בתמיסות המכילות חומרי ניגוד. זו תהיה שיטה טובה לקביעת טוהר הסוכנים. עבודה עם כימיקלים עלולה להיות מסוכנת ונקיטת אמצעי זהירות כגון לבישת ציוד מגן אישי חשובה בעת ביצוע הליך זה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג בדיקה מבוססת פלואורסצנציה לזיהוי יוני גדוליניום(III) רעילים שאינם כלוט בתמיסות מימיות. השיטה משתמשת במולקולות פולידיאוקסינוקלאוטיד (אפטמר 44-mer), המפגינות פליטת פלואורסצנציה מוגברת בנוכחות יוני גדוליניום.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- ביוכימיה
- כימיה אנליטית
רקע
- יוני גדוליניום(III) משמשים כחומרי ניגודיות ב-MRI.
- יוני גדוליניום שאינם כלוטים עלולים להיות רעילים במערכות ביולוגיות.
- בדיקות פלואורסצנציה מספקות שיטה רגישה לזיהוי.
- סלקטיביות גבוהה היא חיונית להבחנה בין גדוליניום לבין קטיונים של מתכות אחרות.
מטרת המחקר
- פיתוח בדיקה מהימנה לזיהוי יוני גדוליניום שאינם קלוצים.
- הבטחת הבטיחות של חומרי ניגוד ל-MRI המבוססים על גדוליניום.
- השגת זיהוי בריכוזים סוב-מיקרו-מולריים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת בופר למסאיי עם התאמת pH ל-7.4.
- סינון של הבופר באמצעות מסנן סטרילי.
- שימוש באפטמרים מסוג polydeoxynucleotide לצורך חישה.
- מדידת שינויים בפליטת פלואורסצנציה בנוכחות יוני gadolinium.
תוצאות עיקריות
- הבדיקה מזהה בהצלחה יוני gadolinium בריכוזים נמוכים.
- הושגה סלקטיביות גבוהה ביחס לקטיונים של מתכות ביולוגיות אחרות.
- פליטת הפלואורסצנציה עלתה באופן משמעותי בנוכחות gadolinium.
- השיטה יכולה לשפר את הבטיחות בשימוש בחומרי ניגוד ל-MRI.
מסקנות
- בדיסה זו, המבוססת על פלואורסצנציה, יעילה לניטור רמות של יוני gadolinium.
- היא מספקת אמצעי להבטחת האיכות של חומרים המבוססים על gadolinium.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול ניטור סביבתי וביולוגי נרחב יותר.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
גילוי של יוני gadolinium(III) שאינם כלוביים הוא קריטי להבטחת הבטיחות והאיכות של חומרי ניגוד ל-MRI מבוססי gadolinium המשמשים באבחון קליני. חיישן פלואורסצנציה מבוסס-אפטמר זה מאפשר גילוי של Gd³⁺ רעיל בריכוזים סוב-מיקרומולריים בבופר מימי, ותומך בפיתוח בדיקות בשלבים מוקדמים לבדיקת טוהר של חומרי ניגוד. השיטה מספקת קריאה סלקטיבית וניתנת לשחזור המסייעת בהפחתת סיכונים מנגנוניים במהלך זיהוי מובילים (lead identification) וסינון פורמולציות פרה-קליניות.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של יציבות קומפלקסי גדוליניום-כלט ויעילות קישור ליגנדים בפיתוח חומרי ניגוד.
- ערך תפעולי: תומך בתיקוף פונקציונלי של כימיית הכלציה על ידי זיהוי תוצרי דיסוציאציה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר קריאות פלואורסצנציה כמותיות להערכת טוהר של חומרי ניגוד לאורך דילולות סדרתיות.
- ערך תפעולי: תואם לפורמטים של מיקרו-פלטה בעלת 384 בארות, מה שמאפשר סריקה בעלת תפוקה גבוהה של מנות חומרי ניגוד.
- ערך תפעולי: מדגים סלקטיביות ביחס ליונים פיזיולוגיים (Na⁺, K⁺, Ca²⁺), ובכך מפחית תוצאות חיוביות שגויות במטריצות מורכבות.
מחקר טרנסלציונלי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מספק מערכת רלוונטית למחלה לצורך ניטור שחרור גדוליניום בתנאים ביולוגיים מדומים.
- ערך תפעולי: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי כימות Gd³⁺ ששאר ללא קילציה בסריקת פורמולציות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל מסריקה מוקדמת של חומרי ניגוד ועד להערכת בטיחות פרה-קלינית, שבה זיהוי יוני מתכות שיוריים מספק מידע לאופטימיזציה של הפורמולציה ולהחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go).
- ביולוגיה של תגליות: תומך בבדיקת היפותזות לגבי יציבות קלטים ועוצמת האינטראקציה בין ליגנד ליון בסביבות מימיות.
- סריקה: מאפשרת מוכנות של הבדיקה ויכולת שחזור לצורך השוואת טוהר של חומרי ניגוד בין סדרות ייצור.
- אנליטיקה: מספקת מדידות כמותיות של משתנים תלויים (שינוי פי Fluorescence) המאפשרות השוואה של ריכוזי Gd³⁺ בין דגימות.
- מחקר תרגומי: מקשר לרצף פרה-קליני על ידי סימולציה של תנאים ביולוגיים שבהם עשוי להתרחש דיסוציאציה של גדוליניום.
- שימוש חוזר ארגוני: מייצג יכולת אנליטית ניתנת לשימוש חוזר לצורך בקרת איכות בייצור חומרי ניגוד ובבדיקות יציבות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בבטיחות חומרי ניגודיות על ידי זיהוי Gd³⁺ רעיל ברמות ננו-מולריות.
- ערך תפעולי: מציע סטנדרטיזציה והדירות באמצעות מדידות פלואורסצנציה מיוצבות pH ונשלטות בבופר.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות ה-go/no-go על ידי זיהוי מנות עם שאריות של גדוליניום לא קלט לפני שחרור לקליניקה.
- השפעה על פורט폴יו: מאפשר תיעדוף מבוסס סיכון של מועמדים לחומרי ניגודיות על בסיס יעילות הקילציה ושימור יוני מתכת.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בחומצות גרעין, היברידיזציה של אפטמרים וגילוי פלואורסצנציה.
- תלוי בציוד למחזורי תרמי עבור חיבור (annealing) של גדילי כיבוי לאפטמר ובקוראי מיקרו-פלטות לכימות פלואורסצנציה.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת באפר, כיוון pH וסינון.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבה ללנתידים אחרים בשל תגובתיות צולבת חלקית עם Eu³⁺ ו-Tb³⁺.
- מוגבל בשל חסרון בספציפיות מוחלטת ל-Gd³⁺ על פני לנתידים טריוולנטיים אחרים, דבר המצריך אישור אורתוגונלי בדגימות מורכבות.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:05
Title
4:33
Conclusion
0:36
Preparation of Aptamer Stock Solutions and 2x Gd-sensor Solution
1:52
Constructing the Fluorescence Calibration Curve and Detecting the Presence of Unchelated Gd3+ in a Solution of Gd Contrast Agent
3:15
Results: Changes in the Fluorescence Emission of the Aptamer-based Sensor in the Presence of Gadolinium(III)
