Name: אפיון Biophysical של פונקציות flagellar Motor (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: חקור את מנגנוני הסיבוב של חרוטי הדגל בחיידקי E. coli באמצעות מעקב בזמן אמת של חרוזי מדידה. שיטה זו מאפשרת הבנה מעמיקה של מכניקת מנועים מולקולריים ומאפיינים ביופיזיקליים של התא החי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים להווארד ברג על תרומת המיקרוסקופ/מכפילי הפוטו העוקבים אחר חרוזים ותחנת הניסויים ההנדסיים של טקסס A&M עבור מימון.

1. תא הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תרבויות לילה של המתח הרצוי נושאת את Flic דביק אלל 15,22 ב Tryptone מרק (TB, 1% Peptone, 0.5% NaCl) ואחריו חיסון ב 1: 100 דילול ב 10 TB מ&quot;ל טריים. לגדול התרבות ב 33 מעלות צלזיוס חממה שייקר עד OD 600 = 0.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה התאים ב 1500 XG במשך 5 - 7 דקות מחדש לפזר את גלולה במרץ ב 10 מ&quot;ל של חיץ תנועתיות מעוקר מסנן (MB; חיץ פוספט 10 מ&quot;מ: 0.05-0.06 M NaCl, 10 -4 M EDTA, 1 מיקרומטר מתיונין, pH 7.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 1.2 פעמים נוספות מחדש לפזר את הגלולה הסופית 1 MB המ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזירה ההשעיה על ידי עובר הלוך ושוב ~ 75 פעמים בין שני מזרקים עם 21 עד 23 מתאמי מד מחובר על ידי צינורות פוליאתילן (7 - 12 ס&quot;מ אורך, 0.58 מ&quot;מ פנימי קוטר). הגבל את הזמן הכולל עבור הגז כדי 30 - 45 s. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה תאים הטעונים ב 1500 XG במשך 5-7 דקות מחדש לפיזורגלולה ב 100 - 500 μL של MB. </li></ol> 2. שקופיות כנות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין תא הדמיה על ידי הרבדה שנייה דבק דו צדדי בין תלוש-כיסוי שקופיות מיקרוסקופ. עבור מבחני chemotaxis, להעסיק כל תא microfluidic המאפשר חילופי MB וממריצים כימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 0.01% הפתרון פולי- L- ליזין בתא ואחרי 5 דקות בעדינות ולשטוף את המשטחים עם MB (80 - 100 μL). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μL של ההשעיה תא לתא ולאפשר מספיק זמן עבור התקשרות אל משטח זכוכית (7 - 8 דקות). לזרום החוצה תאים לקלף ידי הוספת 100 μL MB בצד אחד של החדר, תוך פתילת הפתרון עם נייר סינון מהצד השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 - 15 μL של חרוזי לטקס לתוך התא ולאפשר החרוזים זמן לפרוע באמצעותם ולצרף אל התאים (7 - 8 דקות). לשטוף בעדינות עם 100 μL של MB, כמתואר בשלב 2.3, להסיר לקלף חרוזים. להשתמש במגוון של חרוז-סיzes עבור הניסויים כל עוד ניגוד טוב זמין. </li></ol> 3. מעקב חרוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את המדגם על במה מיקרוסקופ ולסרוק את השטח עבור חרוזים מצורפים מנועים. השתמש מטרת שלב 40X לבצע תצפיות למרות מיקרוסקופיה שלב לא הכרחית. לחלופין, להעסיק הדמית שדה בהיר כל עוד ניגוד ראוי נשמר להבחין חרוז בהיר בבירור על רקע כהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעם חרוז נבחרת, להזיז את הבמה רוחבית כדי למקם את החרוז בפינה שנקבעה מראש כפי שמוצג באיור 1 ב. חרוזים עמדו באותו בפינה כדי להבטיח כי כיוון הסיבוב של החרוז ידוע כראוי. מסלולו החרוז האידיאלי הוא כ עגול אבל מסלולי אליפטי הם קבילים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על תדר דגימה גבוה יותר מפי שניים את תדירות הסיבוב של המנוע, כדי למנוע טעויות הקשורות aliasing. בעבודה זו, להשתמש במנוע שהיה מסתובב50 הרץ ו מדגם בתדרים שהיו היה גבוה פי 10 (500 הרץ), כדי לקבל אות חלקה. </li></ol> ניתוח 4. נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרכז ולהתאים את מתחי מוצא PMT ונכון סְגַלגַלוּת ב המסלולים עם טרנספורמציות המאוחד במידת צורך 23. השתמש ניתוח כוח ספקטרום לקבוע שיעורי סיבוב 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע זוויות קוטב, θ (t) = atan (y (t) / x (t)). קבע את הווריאציות במהירויות מנוע ומיתוג לאורך זמן על ידי חישוב ω <img alt="משוואה 1" src="/files/ftp_upload/55240/55240eq1.jpg" /> 14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעסיק מסנן חציון להחליק את הנתונים מהירי מנוע. חלון מסנן מעל שני סיבובים מלאים מומלץ 23,24. </li></ol>

<ol><li>Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+factors+of+uropathogenic+Echerichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Antimicrob.+Ag%22%5BJournal%5D)">Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli.</a> Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).</li>
<li>Lane, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+motility+in+the+colonization+of+uropathogenic+Escherichia+coli+in+the+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract.</a> Infect Immun. 73 (11), 7644-7656 (2005).</li>
<li>Kao, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+interplay+among+bacterial+motility+and+virulence+factors+in+different+Escherichia+coli+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Clin+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">The complex interplay among bacterial motility and virulence factors in different Escherichia coli infections.</a> Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (12), 2157-2162 (2014).</li>
<li>Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rotary+motor+of+bacterial+flagella%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">The rotary motor of bacterial flagella.</a> Annu Rev Biochem. 72, 19-54 (2003).</li>
<li>McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellar+Dynamometer+Controls+Swarmer+Cell+Differentiation+of+V.+parahaemolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Flagellar Dynamometer Controls Swarmer Cell Differentiation of V. parahaemolyticus.</a> Cell. 54 (3), 345-351 (1988).</li>
<li>Lele, P. P., Hosu, B. G., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+mechanosensing+in+the+bacterial+flagellar+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of mechanosensing in the bacterial flagellar motor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11839-11844 (2013).</li>
<li>Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+sensing+in+Vibrio+parahaemolyticus+triggers+a+programme+of+gene+expression+that+promotes+colonization+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence.</a> Mol Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).</li>
<li>Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+field+guide+to+bacterial+swarming+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A field guide to bacterial swarming motility.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).</li>
<li>Belas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%2C+flagella%2C+and+mechanosensing+of+surfaces+by+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria.</a> Trends Microbiol. 22 (9), 517-527 (2014).</li>
<li>Silverman, M., Simon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flagellar+rotation+and+the+mechanism+of+bacterial+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Flagellar rotation and the mechanism of bacterial motility.</a> Nature. 249, 73-74 (1974).</li>
<li>Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+Kinetics+in+Bacterial+Chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Adaptation Kinetics in Bacterial Chemotaxis.</a> J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).</li>
<li>Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+comparisons+in+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Temporal comparisons in bacterial chemotaxis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 8987-8991 (1986).</li>
<li>Blair, D. F., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+torque+in+defective+flagellar+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Restoration of torque in defective flagellar motors.</a> Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).</li>
<li>Ryu, W. S., Berry, R. M., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque-generating+units+of+the+flagellar+motor+of+Escherchia+coli+have+a+high+duty+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Torque-generating units of the flagellar motor of Escherchia coli have a high duty ratio.</a> Nature. 403, 444-447 (2000).</li>
<li>Yuan, J., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resurrection+of+the+flagellar+rotary+motor+near+zero+load%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1182-1185 (2008).</li>
<li>Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Switching+of+the+bacterial+flagellar+motor+near+zero+load%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Switching of the bacterial flagellar motor near zero load.</a> J Mol Biol. 390 (3), 394-400 (2009).</li>
<li>Sowa, Y., Hotta, H., Homma, M., Ishijima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque-speed+Relationship+of+the+Na%2B-driven+Flagellar+Motor+of+Vibrio+alginolyticus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Torque-speed Relationship of the Na+-driven Flagellar Motor of Vibrio alginolyticus.</a> J Mol Biol. 327 (5), 1043-1051 (2003).</li>
<li>Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque-speed+relationship+of+the+bacterial+flagellar+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1260-1265 (2006).</li>
<li>Meacci, G., Tu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+bacterial+flagellar+motor+with+multiple+stators%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the bacterial flagellar motor with multiple stators.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3746-3751 (2009).</li>
<li>Lele, P. P., Roland, T., Shrivastava, A., Chen, Y. H., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+flagellar+motor+of+Caulobacter+crescentus+generates+more+torque+when+a+cell+swims+backwards%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Phys%22%5BJournal%5D)">The flagellar motor of Caulobacter crescentus generates more torque when a cell swims backwards.</a> Nat Phys. 12 (2), 175-178 (2016).</li>
<li>Lele, P. P., Shrivastava, A., Roland, T., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+thresholds+in+bacterial+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Response thresholds in bacterial chemotaxis.</a> Sci Adv. 1 (9), e1500299(2015).</li>
<li>Berg, H. C., Turner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque+Generated+by+the+Flagellar+Motor+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Torque Generated by the Flagellar Motor of Escherichia coli.</a> Biophys J. 65, 2201-2216 (1993).</li>
<li>Bai, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+Spread+as+a+Mechanism+for+Cooperativity+in+the+Bacterial+Flagellar+Switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conformational Spread as a Mechanism for Cooperativity in the Bacterial Flagellar Switch.</a> Science. 327, 685-689 (2010).</li>
<li>Reid, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maximum+number+of+torque-generating+units+in+the+flagellar+motor+of+Escherichia+coli+is+at+least+11%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The maximum number of torque-generating units in the flagellar motor of Escherichia coli is at least 11.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8066-8071 (2006).</li>
<li>Chen, X., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torque-Speed+Relationship+of+the+Flagellar+Rotary+Motor+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Torque-Speed Relationship of the Flagellar Rotary Motor of Escherichia coli.</a> Biophys J. 78, 1036-1041 (2000).</li>
<li>Turner, L., Caplan, S. R., Berg, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-induced+switching+of+the+bacterial+flagellar+motor%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor.</a> Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

על מנת להקל על מעקב חרוז קשור ואמידה נכונה של מגבילי מנוע, את המידע הבא צריך להיבדק. בעת ביצוע מדידות אלה עם תאים והולקה בשוט, הגז הוא שלב קריטי. גזיזה מפחיתה את נימת flagellar כדי בדל גרידא, ובכך להבטיח כי העומס הצמיג על המנוע הוא בעיקר בשל החרוז ניתן לאמוד בתוך 10% שגיאה 16. גזיזה גם משפרת את הסיכוי למצוא מסלולים עגולים עם מוזרויות מופצות בחוזקה (&lt;חרוז בקוטר 14). תוצאות גז פסולת מסלולים סוררים, אשר תרכובות טעויות מעקב בחישוב שאיפות צמיגות, כמו גם וכתוצאה...

מנועי flagellar לאפשר תאים לשחות ידי החלפת חוטים תאיים סליל. כמות מומנט המנוע יכול לייצר עבור באורך נתון של השוטון (כלומר, את העומס הצמיג) מקובעת את מהירויות השחייה. מצד השני, היכולת שלה כדי להעביר את כיוון הסיבוב שולטת נדידת תאים בתגובת כימיקלים, תהליך המכונה chemotaxis. Chemotaxis ו ארסיות להיות תנועתיות גורמי 1-3, מנועים flagellar מתאפיינים היטב במשך השנים 4. הראיות המצטברות החברה עולה כי המנוע משמש mechanosensor - זה מכנית מזהה נוכחות של 5,6 מצעים מוצקים. יכולת זו מסייעת סביר המעוררים קולוניזציה משטח וזיהומים 5,7. כתוצאה מכך, המנגנונים לפיה מנוע חושי משטחים ויוזם איתות הם בעלי חשיבות 8,9. מנוע flagellar ניתן ללמוד בקלות על ידי קושר את flagellאממ לרוטצית תא מצע והתבוננות. קשירה כזו הושגה לראשונה על ידי סילברמן וסיימון, שעבד עם מוטציה polyhook ב E. coli ו ווים לחבר בהצלחה מצעי זכוכית עם נוגדנים נגד וו 10. את assay הקשורים התאים אפשר לחוקרים ללמוד את התגובות של מתג המנוע למגוון של גירויים כימיים. לדוגמה, סגל ועמיתים לעבודה מגורה תאים קשור כימית בעזרת טפטפות iontophoretic. השינויים המתאימים הטיה CW (את החלק היחסי של מנועים הזמן לסובב עם כיוון השעון, CW) אפשרה להם למדוד את קינטיקה של הסתגלות ברשת chemotaxis 11,12. בעוד assay התא הקשור היה יעיל בחן את תשובות מתג, זה היה מסוגל רק להציע תובנה מכניקת מנוע פני טווח מוגבל של עומסים צמיגים 13. כדי להתגבר על בעיה זו, ריו ועמיתים לעבודה קשורה כדורי, חרוזי גומי כדי נימה השוברים על תאים תקועים על משטחים. החרוזים היואז מעקב באמצעות אינטרפרומטריה גב מוקד עם מלכודות אופטיות חלשות 14. הודות לשיתוף פעולה עם חרוזים בגדלים שונים, חוקרים יכלו ללמוד את המנוע על פני טווח רחב יותר של עומסים. assay זה היה שיפור מאוחר יותר על ידי יואן וברג, אשר פיתח טכניקה חרוז מעקב מבוססי מכפיל בשילוב עם תאורה כהה שדה לייזר. המעקב מופעל שיטתם של nanobeads זהב הקשור כי הם כה זעירים (~ 60 ננומטר) כי ההתנגדויות הצמיגות החיצוניות היו נמוכות לעומת ההתנגדויות הצמיגות הפנימיות סיבוב 15,16. זה הוביל את המידות של מהירויות המרביות השגה ב E. coli (~ 300 הרץ). ב V. alginolyticus, מבחני חרוז דומים מופעלים מדידות של שיעורי ספינינג בעומסים צמיגים ביניים (~ 700 הרץ) 17. בכך שהיא מאפשרת מדידות של תגובות המנוע על פני הטווח האפשרי השלם של המון צמיגה (מאפס עומס לקרוב-דוכן), החרוז-המבחנים ספקו כלי biophysical חשוב להבין את torque דור תהליך 18,19. לאחרונה, שינינו את assay יואן-ברג לכלול פינצטה אופטית שאפשרה לנו ליישם גירויים מכאניים מדויקים מנועים בודדים 6. באמצעות טכניקה זו, הראינו כי-גנרטורים כוח לסובב את המנוע הם mechanosensors דינמי - יעשו שינויים בתגובה לשינויים המון צמיגה. יתכן כי עומס חישה כגון מפעילת התמיינות תאים לתוך חיידקים שורצים, למרות המנגנונים עדיין אינם ברורים. כמו כן סביר להניח כי מנועי flagellar במינים אחרים הם גם mechanosensitive 20, למרות ראיות ישירות חסרות. כאן, אנו דנים מבוססי מכפיל (PMT) הגישה למעקב אחר סיבוב של חרוזים לטקס הרתומים חוטים flagellar 15. בהשוואת מעקב עם מצלמות מהירות, את ההתקנה המכפילה יש יתרון משום שהוא הוא פשוט יחסית כדי לעקוב אחר חרוזים יחידים בזמן אמת ושוב הדורה ארוכהמשא. זה שימושי במיוחד כאשר לומדים ותיק שיפוץ מתחמי מנוע flagellar בשל גירויים סביבתיים 21. למרות שאנחנו פרוטוקולים בפירוט במיוחד עבור E. coli, הם יכולים להתאים בקלות ללימוד מנועים flagellar במינים אחרים.

<table><tbody><tr><td>תמיסת פולי-L-ליזין (0.1%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>Polybead Microspheres</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>7307</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>1 מ"ל Luer מזרק קצה החלקה</td><td>Exel Int.</td><td>26048</td><td>http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php</td></tr><tr><td>קליי אדמס Intramedic Luer-Stub מתאם 23 מד</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>427565</td><td>http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp</td></tr><tr><td>צינורות פוליאתילן</td><td>הרווארד מנגנון</td><td>59-8325</td><td></td></tr><tr><td>http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html פוטו-מכפיל צינורות</td><td>Hamamatsu</td><td>R7400U-20</td><td>טווח תגובה ספקטרלי של 300 עד 920 ננומטר, אורך גל שיא 630 ננומטר, &nbsp; זמן תגובה של 0.78 ns&nbsp; http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html</td></tr><tr><td>חריצים מדויקים 3 x 1 מ"מ</td><td>Edmund Optics</td><td>NT39-908</td><td>2 חריצים המותקנים בזווית ישרה זה לזה על צינורות פוטו-מכפיל</td></tr><tr><td>אוסילוסקופ</td><td>Tektronix</td><td>TBS 1032B</td><td>מותגים אלטרנטיביים מקובלים. אוסצילוסקופ דיגיטלי, סדרת TBS 1000B, 2 אנלוגי, 30 מגה-הרץ, 500 MSPS, 2.5 kpts&nbsp; http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope</td></tr><tr><td>8 קוטבי LP/HP מסנן</td><td>Krohn-Hite</td><td>3384</td><td>מותגים אלטרנטיביים מקובלים. מומלץ טווח תדרים מ-0.1 הרץ עד 200 קילו-הרץ.&nbsp; &nbsp; &nbsp; http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ Optiphot</td><td>Nikon</td><td>NA</td><td>ניתן להשתמש בכל מיקרוסקופ פאזה זקוף או הפוך. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754</td></tr><tr><td>50:50 (R:T) מפצל קרן קובייה</td><td>ThorLabs</td><td>BS013</td><td></td></tr></tbody></table>

אפיון biophysical של פונקציות flagellar motor

Biophysical Characterization of Flagellar Motor Functions

תפקידם של מנועי דגל בתנועתיות חיידקים וכימוטקסיס מובן היטב. תגליות אחרונות מצביעות על כך שמנועי דגל מסוגלים להתעצב מחדש בתגובה למגוון גירויים סביבתיים והם בין הטריגרים להתיישבות פני השטח ולזיהומים. המנגנונים המדויקים שבאמצעותם מנועים מעצבים מחדש ומקדמים הסתגלות תאית תלויים ככל הנראה בתכונות מוטוריות מרכזיות. טכניקת מעקב החרוזים מבוססת מכפיל האור המוצגת כאן מאפשרת אפיון ביופיזיקלי מדויק של פונקציות מוטוריות, כולל התאמות במהירויות המנוע ודינמיקת המתגים. גישה זו מציעה את היתרון של מעקב בזמן אמת ואת היכולת לחקור התנהגות מוטורית לאורך פרקי זמן ממושכים. ניתן להרחיב בקלות את הפרוטוקולים הנדונים כדי לחקור מנועי דגל במגוון מיני חיידקים.

ההתקנה המכפילה מוצגת באיור 1 א. חשוב כי יש PMTs רגישויות גבוהות על פני טווח של אורכי גל מפוזרים על ידי החרוזים של עניין. PMTs מועסק כאן לפעול בטווחים הגלויים קרוב אינפרא אדומים, הצליח לזהות אור מפוזר על ידי חרוזים המוארים על ידי מקור אור ההלוגן. תנאי תאורה אופטימליים, לאספקת מתח ישתנו מהגדרת אחד למשנהו. עבור ההתקנה המשמשת בעבודה זו, רווח PMT ~ 10 אפריל - 10 מאי הוכיח את יעילותו. כל מכפיל היה מכוסה למעט חרך 3 x...

ממצאים אחרונים מצביעים על כך שמנועי דגל חיידקים חשים מגוון אותות סביבתיים ומעצבים מחדש בתגובה. מבחני החרוזים שנדונו כאן צפויים לעזור להסביר את תפקיד העיצוב מחדש בהסתגלות התאים לגורמי לחץ סביבתיים.

אפיון Biophysical של פונקציות flagellar Motor

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel ...

המטרה הכללית של הליך ניסיוני זה היא למדוד את הסיבוב של חרוזי גשש המחוברים למנועים של שוטות בודדות בתאי חיידקים חיים. הטכניקה שנתאר מציעה את היתרון של מעקב בזמן אמת אחר תגובות המנוע ואת היכולת להבחין בין נתונים קבילים לבלתי קבילים בזמן אמת. גישה זו מסייעת לנו לענות על שאלות מפתח בתחום המכנוביולוגיה ולחשוף את הפיזיקה העומדת בבסיס התנהגותם של מנועים מולקולריים.למרות שאנו משתמשים בטכניקות אלו בעיקר כדי לחקור מנועים של שוטונים ב-E.coli, ניתן להתאים פרוטוקולים אלו בקלות לחקר מנועים במינים אחרים של חיידקים בעלי שוטונים. גדלו תרביות לילה של הזן הרצוי הנושא את האלל sticky fliC ב-TB. למחרת, חדישו 10 milliliters של TB טרי בדילול של 1:100. גדלו את התרבית ב-33 degrees Celsius באינקובטור עם ניעור עד שהצפיפות האופטית ב-600 nanometers שווה ל-0.5.שקיעו את התאים בצנטריפוגה במהירות של 1500 times G למשך חמש עד שבע דקות. לאחר מכן, פזרו מחדש את המשקע בעוצמה ב-10 milliliters של חוצץ ניידות (motility buffer) שעבר סטריליזציה באמצעות סינון. חזרו על פעולות הצנטריפוגציה וההשעיה פעמיים נוספות.יש להשעות מחדש את המשקע הסופי ב-1 milliliter של MB. יש לבצע גזירה (shear) של התרחיף על ידי העברתו הלוך ושוב כ-75 פעמים בין שתי מזרקים עם מתאמים בכיול 21 עד 23 gauge המחוברים באמצעות צינור פוליאתילן. יש להגביל את זמן הגזירה הכולל ל-30 עד 45 שניות. לאחר סבב צנטריפוגה של התאים שעברו גזירה, יש להשעות מחדש את המשקע ב-100 עד 500 microliters של MB. הכינו תא דימוג על ידי הצמדת שני סרטי דבק דו-צדדיים בין זכוכית כיסוי לבין למסבב מיקרוסקופ.הוסיפו לתא תמיסת poly-L-lysine בריכוז 0.01%, ולאחר חמש דקות, שטפו בעדינות את המשטחים עם MB. הוסיפו לתא 40 µl של ת сусפנסיות התאים והמתינו זמן מספיק להיצמדותם למשטח הזכוכית. שטפו תאים שלא נצמדו על ידי הוספת 100 µl של MB לצד אחד של התא, תוך ספיגת התמיסה בעזרת נייר סינון מהצד השני. לאחר מכן, הוסיפו לתא 10 עד 15 µl של חרוזי לטקס.השתמשו בטווח של גדלי חרוצים עבור הניסויים שיניב ניגודיות טובה. אפשרו לחרוצים זמן מספיק לשקוע ולהיקשר לתאים. שטפו בעדינות את החרוצים עם 100 µL של MB כדי להסיר חרוצים שלא נקשרו.הניחו את הדגימה על במה של מיקרוסקופ וסרקו את פני השטח כדי לאתר חרוזיים המחוברים למנועים. השתמשו בדימות בשדה בהיר (bright-field imaging) עם עדשה אובייקטיבית 60X, כל עוד נשמר ניגודיות מספקת המאפשרת להבחין בבירור בחרוז בהיר על רקע כהה. לאחר בחירת חרוז, הזיזו את הבמה לצד כדי למקם את החרוז בפינה שנקבעה מראש.מקם את החרוזיים באותה פינה כדי להבטיח שכיוון הסיבוב של החרוז ידוע באופן מדויק. שמור על תדירות דגימה הגבוהה פי שניים מתדירות הסיבוב של המנוע כדי למנוע שגיאות הקשורות לאליאסינג (aliasing). בעבודה זו, נעשה שימוש בתדירויות דגימה שהיו גבוהות פי 10 כדי לצפות במנוע המסתובב בתדר של 50 hertz.אם לאחר הקישור, החרוזים נראים כרוטטים עם אקסצנטריות הגדולה פי אחד עד שניים מרדיוס החרוז, מומלץ לבצע גזירה של התאים מספר פעמים רב יותר. מוצג כאן השוואה ויזואלית בין חרוז מקושר כהלכה לבין חרוז שאינו מקושר. הפלטים משני הפוטו-מכפילים, שנדגמו בתדירות של 500 hertz, מוצגים לאורך פרק זמן קצר של המדידה.הפלט המסונן מה-PMTs, לאחר מרכוז ונרמול (scaling), שימש לשחזור המסלולים המעגליים של החרוז המסתובב, כפי שמוצג כאן. מסלול החרוז האידיאלי הוא מעגלי בקירוב, אך מסלולים אליפטיים הם קבילים. המהירויות הזוויתיות שחושבו ממסלולי החרוז עבור מנוע בודד מוצגות על פני חלון זמן של שלוש שניות.המעברים החוזרים של המנוע בין כיווני סיבוב נגד כיוון השעון וכיוון השעון מסומנים על ידי מעברים בין ערכים חיוביים לשליליים. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמרו עם הבנה טובה של אופן המעקב אחר חרוצים הקשורים למנועים שוטים בודדים בדיוק גבוה, באמצעות הטכניקות המבוססות על פוטומולטיפליקטור המוצגות כאן. המנוע השוט הבקטריאלי מציב קבוצה ייחודית של אתגרים מכיוון שהוא מסוגל להסתובב במהירות של כמה מאות הרץ.מעקב ברמת דיוק גבוהה אחר חרוזי-גשוש הקשורים למנועים מולקולריים סייע לאפיון של מספר סוגי מנועים, כולל קינזינים, מיוזינים ו-F1-ATPase. הרחבת טכניקת קישור החרוזים למנועים של שוטים (flagellar motors) אפשרה לחוקרים לחקור את מכניקת המנוע בדיוק חסר תקדים. הדגמה חזותית של שיטה זו תסייע לחוקרים המעוניינים להשתמש בטכניקה זו להתגבר על אתגרים, כגון איתור חרוזים הקשורים כראוי למנועים בודדים.התוכנית היא שהשיטות המוצגות כאן יאפשרו פיתוח של תובנות חדשות לגבי יכולת ההסתגלות של ננו-מכונות אלו במגוון של מיני חיידקים.

biophysical-characterization-of-flagellar-motor-functions

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הובלה תוך-תאית של מטענים, כגון שלפוחיות או אברונים, מתבצעת על ידי חלבונים מוטוריים מולקולריים העוקבים אחר מיקרו-צינורות מקוטבים. פרוטוקול זה מתאר את המתאם בין כיווניות ההובלה של חלקיקי מטען בודדים הנעים בתוך נוירונים, לכמות היחסית והסוג של חלבונים מוטוריים קשורים.

ניתוח &quot;מטען מיפוי&quot; המאפיין את ההרכב מולקולרי מוטורס על העברת axonal מטענים שימוש

המטרה של פרוטוקול זה היא טופס הרכבים של מנועים מולקולריים ב-DNA אוריגמי ננו מבנים ולהתבונן ההרכב לתנועתיות באמצעות סך השתקפות פנימית מיקרוסקופ קרינה.

ייצור Dynein וקינסין הרכבים מוטוריים ב-DNA אוריגמי ננו מבנים עבור תצפית מולקולה אחת

חיידקים רבים משתמשים בתנועתיות המונעת על ידי פלאגלה כדי לנווט בסביבתם וליישב סביבה נוחה הן בנפרד והן כקולקטיב. הוכח כאן הוא השימוש בשלוש שיטות מבוססות המנצלות תנועתיות ככלי בחירה לזיהוי רכיבים / מסלולים התורמים לשחייה ותנועתיות נחיל.

חקירת תנועתיות מונחית פלאגלה באשריצ'יה קולי על ידי יישום שלוש טכניקות מבוססות בסדרה

מוצג כאן הליך לבטא ולטהר מיוסין 5a ואחריו דיון על אפיון שלה, באמצעות הרכב ומולקולה אחת במבחנה מיקרואורסצנטיות מבוססות בדיקות, וכיצד שיטות אלה ניתן לשנות עבור אפיון של מיוסין nonmuscle 2b.

התאמות ספציפיות מיוסין של במבחנה פלואורסצנטית מיקרוסקופיה מבוססות ישבן

מוצג כאן פרוטוקול מקיף לביצוע ניסויים מהירים במיוחד במהדק כוח על מנועי מיוזין-5 תהליכיים, שניתן להרחיב בקלות לחקר סוגים אחרים של מנועים תהליכיים. הפרוטוקול מפרט את כל השלבים הדרושים, החל מהקמת מנגנון הניסוי ועד להכנת הדגימה, רכישת הנתונים וניתוחם.

ניתוח תכונות מכנואנזימטיות של מיוסינים תהליכיים באמצעות ספקטרוסקופיית מהדק כוח מהירה במיוחד

כאן, אנו מתארים את הבנייה של מוטציות ריקות של אירומונס בגליקוזילטרנספראזות ספציפיות או באזורים המכילים גליקוזילטרנספראזות, מבחני תנועתיות וטיהור פלגלה שבוצעו כדי לבסס את המעורבות והתפקוד של האנזימים המקודדים שלהם בביוסינתזה של גליקאן, כמו גם את תפקידו של גליקאן זה בפתוגנזה חיידקית.

יצירת מוטציות ריקות כדי להבהיר את תפקידם של גליקוזילטרנספראזות חיידקיות בתנועתיות חיידקית

קינסין-5 Cin8 המיטוטי הדו-כיווני מצטבר באשכולות המתפצלים ומתמזגים במהלך תנועתיותם. הצטברות באשכולות משנה גם את המהירות והכיווניות של Cin8. כאן מתואר פרוטוקול לבדיקות תנועתיות עם Cin8-GFP מטוהר וניתוח תכונות תנועתיות של מולקולות בודדות ואשכולות של Cin8.

תנועתיות של מולקולות בודדות ואשכולות של קינסין-5 Cin8 דו-כיווני מטוהרים מתאי S. cerevisiae

היווצרות של צרורות actomyosin במבחנה ומדידת ייצור כוח אנסמבל מיוזין באמצעות פינצטה אופטית מוצג ונדון.

חקר מכניקת אנסמבל מיוזין בצרורות נימה של אקטין באמצעות פינצטה אופטית

כאן אנו מציגים פרוטוקול לשחזור צרורות מיקרוטובולים במבחנה וכימות ישיר של הכוחות המופעלים בתוכם באמצעות השמנה אופטית סימולטנית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת. בדיקה זו מאפשרת מדידה ברמה ננומטרית של הכוחות והתזוזות הנוצרים על ידי הרכבי חלבונים בתוך רשתות מיקרוטובולים פעילות.

מדידה ישירה של כוחות בתוך צרורות מיקרוטובולים פעילים משוחזרים

מחקר זה מפרט טיהור של KIF1A(1-393LZ), חבר במשפחת קינזין-3, באמצעות מערכת ביטוי Sf9-baculovirus. ניתוח החלקה חד-מולקולתית ורב-מנועית במבחנה של מנועים מטוהרים אלה הפגין תכונות תנועתיות חזקות הדומות למנועים של ליזאט תאי יונקים. לפיכך, מערכת Sf9-baculovirus היא מקובלת להביע ולטהר חלבון מוטורי של עניין.

אנליזה של מולקולה בודדת של מנועי משפחת קינסין-3 מטוהרים מסוג Sf9

פרוטוקול זה מפרט את ההליכים לייצור רקומביננטי של ההולואנזים מיוזין-7a האנושי באמצעות מערכת MultiBac Baculovirus ולחקר תנועתיותו באמצעות בדיקת גלישה מותאמת אישית של חוטי להט במבחנה.

טיהור מבוסס מערכת MultiBac ואפיון ביופיזי של מיוזין-7a אנושי

חקור את מנגנוני הסיבוב של חרוטי הדגל בחיידקי E. coli באמצעות מעקב בזמן אמת של חרוזי מדידה. שיטה זו מאפשרת הבנה מעמיקה של מכניקת מנועים מולקולריים ומאפיינים ביופיזיקליים של התא החי.

אפיון Biophysical של פונקציות flagellar Motor

גלה סרטונים נוספים