ניתוח של הפרדת כרומוזום, אצטון היסטון, ומורפולוגיה ציר ב סוס ביציות

המטרות הכוללות של גישה ניסויית זו הן, ראשית, לאפיין מבחינה מורפולוגית וביוכימית ביציות סוסים, ושנית, להשוות גמטות מאותה חיה שעובדו במבחנה או in vivo. גישה ניסויית זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בביולוגיה של ביציות ופוריות במינים חד-ביוציים. זה עשוי גם לשפר את הבטיחות של הליכי מניפולציה של גמטות.

גישה זו פותחה כדי להתגבר על זמינות הדגימה המוגבלת של ביציות, במיוחד ממינים חד-ביוציים. ידגימו את נהלי ה-OPU פרופסור סטפן דלז מאוניברסיטת ליאז', ססיל דואה, מנהלת המעבדה של המעבדה שלי, ופבריס ריינר, מנהל יחידת הסוסים במרכז INRA Val de Loire. על בסיס יומי, העריכו את קוטר זקיקי השחלות בקבוצה של סוסות בוגרות באמצעות אולטרסאונד.

חפש זקיק גדול בקוטר של יותר מ-33 מילימטרים. לאחר שנמצא, התכוננו להזריק 1,500 יחידות של גונדוטרופין כוריוני אנושי כדי לגרום להבשלת הביצית לזקיק דומיננטי. לאחר מכן, אתר את תלם הצוואר וספוג את מקום ההזרקה באלכוהול.

לאחר מכן, כדי לגרום לווריד לעלות, הפעל כוח כלשהו שניים או שלושה סנטימטרים מתחת למקום ההזרקה. הכניסו את המחט כמעט במקביל לצוואר, שאפו מעט כדי לוודא שהמחט נמצאת בווריד, והזריקו את ההורמון. הכן בדיקת אולטרסאונד לגישה לנרתיק.

לאחר מכן, חבר את המחט למערכת יניקה. 35 שעות לאחר הזרקת hCG, הגדר את המכשור ל-OPU והרגיע את הסוסה. משככי כאבים טובים חשובים ביותר לבטיחות בעל החיים והמפעיל.

בעל חיים שאינו חש כאב או אי נוחות יאפשר מניפולציה של השחלה, מה שיקל על ביצוע פנצ'רים ושטיפות. לאחר החדרת בדיקת המחט, מפעיל אחד חייב לתפעל את השחלה כך שתפנה לבדיקה בזמן שהמפעיל השני מתמרן את המחט. אתר את הזקיק הדומיננטי בתמונה האקוגרפית.

לאחר מכן, השתמש במחט כדי לנקב את דופן הנרתיק ואת דופן הזקיק הדומיננטי. לאחר הגישה לחלל הזקיק, שאפו את נוזל הזקיקים. סובב את המחט כדי לגרד את דופן הזקיקים ולחבר את קומפלקס הקומולוס-ביצית.

לאחר מכן, שפכו את הנוזל לצלחת פטרי גדולה. ותחת סטריאוסקופ, חפש את ה-COC. בינתיים, שטפו את הזקיק עם PBS חם של Dulbecco המכיל הפרין.

ייתכן שיידרשו מספר שטיפות כדי לאסוף את ה-COC. לאחר מציאת ה-COC, החלף את המחט למחט בעלת לומן כפול ואסוף את ה-COCs הלא בשלים מכל הזקיקים שקוטרם בין חמישה ל-25 מילימטרים. אלה ישמשו להתבגרות במבחנה.

לאחר שאיבת כל הזקיקים משחלה אחת, חזור על אותם הליכים כדי לאסוף את ה-COCs הלא בשלים מהשחלה השנייה. כעת, בחר בין ה-COC. שמור רק COCs עם כמה שכבות שלמות של תאי קומולוס ואופלזמה חומה ומגורענת דק.

זרוק את האחרים. בסיום ההליך, הזריקו לסוסה 15,000 יחידות של בנזיל פניצילין כדי למנוע זיהום. לאחר מכן, שיכנו את הסוסה באורווה שקטה ונקייה למשך שעתיים לפחות בזמן שהיא מתאוששת.

לפני תחילת ה-OPU, חממו בקבוק של תוסף HEPES TCM-199 ל-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הכינו את מדיום ה- IVM. יש להוציא 500 מיקרוליטר של TCM-199 בתוספת נתרן ביקרבונט לבארות של צלחת בת ארבע בארות.

לאחר מכן, דגרו את המנה בחום של 38.5 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות. העבירו את ה-COCs הלא בשלים שהוחזרו לצלחת של 3.5 ס"מ מלאה בשני מיליליטר של HEPES TCM-199 המחומם. העבר את ה-COCs דרך אזורים שונים של הכלי כדי לשטוף בעדינות את הפסולת שמסביב.

כעת, העבירו את ה-COCs למדיום IVM, ודגרו אותם למשך 28 שעות בטמפרטורה של 38.5 מעלות צלזיוס. כדי לבצע ספירת כרומוזומים על COCs בוגרים, דגרו אותם במונסטרול של 100 מיקרו-מולרי למשך שעה בטמפרטורה של 38.5 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר את תאי הקומולוס על ידי טיפול ב-COCs עם 0.5% היאלורונידאז ב-TCM-199 עם חוצץ HEPES.

עקוב אחר תגובה זו על במה מחוממת המוגדרת ל-38 מעלות צלזיוס. תוך כחמש דקות, הסר את כל התאים. השתמש בפיפטינג עדין כדי להסיר את התאים העקשניים האחרונים.

לאחר מכן, הסר את ה-zona pellucida באמצעות 0.2% פרונאז ב-TCM-199 חוצץ HEPES. עקוב אחר תגובה זו גם על במה מחוממת. השלמת הפעולה אמורה להימשך כחמש דקות.

לאחר מכן, תקן את הביציות ב-4% פרפורמלדהיד ב-DPBS למשך 15 דקות ב-38.5 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן 45 דקות נוספות של קיבוע בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הקיבוע יש לשטוף את הביציות על ידי העברתן ברצף בין שלוש בארות של 0.1% אלכוהול פוליוויניל ב-DPBS. השתמש בכחצי מיליליטר תמיסה לבאר.

לאחר מכן, העבירו את הביציות לבאר מלאה ב-0.3% טריטון X-100 ב-PBS, ותנו להן לדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. כדי לחסום אותות לא ספציפיים, רחצו את התאים ב-DPBS עם 1% BSA ו-10% סרום חמור רגיל. דגרו על התאים לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר 30 דקות, יש למרוח את הנוגדן הראשוני, ולאחר מכן לדגור על התאים בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת יש לשטוף את הביציות ולמרוח את הנוגדן המשני למשך שעה בטמפרטורת החדר, מוגן מחשיפה לאור. לאחר מריחת המשני, יש לשטוף שוב את הביציות.

לאחר מכן, לפני ההרכבה, חבר רצועות סרט דו צדדיות לשקופיות כדי לשמש כתומכי כיסוי. כעת, הרכיבו את הביציות שלוש עד ארבע בכל שקופית בטיפה של מדיום הרכבה שאינו מתקשה ונוגד דהייה בתוספת 20 מיקרומולר של YO-PRO-1. הניחו לביציות לשקוע כ-10 דקות, ולאחר מכן מרחו את הכיסויים.

מתוך 32 COCs שאוחזרו על ידי OPU מזקיקים דומיננטיים, 28 היו במטפאזה II.באמצעות התבגרות במבחנה, 37 מתוך 44 COCs שנאספו מזקיקים לא דומיננטיים הבשילו למטפאזה II. לאחר מכן הושוו הכרומוזומים של שתי הקבוצות. הביציות הבוגרות במבחנה הושפעו לעתים קרובות מאנופלואידיה, בעיקר היפרפלואידיה. זה לא נצפה בביציות הבוגרות in vivo.

לאחר מכן, נמדדו אורך הציר מקוטב לקוטב וקוטר הציר במקסימום שלו. הביציות שהבשילו במבחנה היו ארוכות ורחבות יותר באופן משמעותי מהביציות שהבשילו in vivo. באותן דגימות נמדדה רמת האצטילציה העולמית של H4K16.

התוצאות היו כצפוי. אצטילציה של H4K16 הייתה נמוכה משמעותית בביציות בבגרות במבחנה מאשר בביציות בוגרות vivo. צוות מיומן היטב יכול לעבד חמש סוסות בבוקר של OPU עם שיעור שליפה של 80% עבור הביצית לפני הביוץ ו-50 עד 60% שליפה של הביציות הלא בשלות.

במהלך ה-OPU, עקוב תמיד אחר המהות והרווחה של בעל החיים, והיה מוכן לספק טיפול וטרינרי הולם במידת הצורך. ניתן ליישם את הגישה הניסויית גם על ביציות ממינים אחרים והיא ישימה במיוחד כאשר זמינות הדגימות היא בעיה, כגון עם בני אדם. בהתבסס על התוצאות שלנו, יש לבצע מחקרים כדי להבין טוב יותר את תנאי התרבות הדרושים להפרדה נכונה של כרומוזומים ושינויים אפיגנטיים.

מטרת העל היא לשפר את יעילות ההתבגרות במבחנה הן עבור הרפואה הווטרינרית והן עבור טיפולי פוריות אנושיים.