MitoCeption: העברת המיטוכונדריה MSC אדם מבודד בתאי גזע Glioblastoma

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעביר מיטוכונדריה שבודדה בעבר מתאי תורם כגון תאי גזע מזנכימליים לתאי מטרה כגון תאי גזע גליובלסטומה. הליך זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום חילוף החומרים כגון ההשפעות המטבוליות והביולוגיות של המיטוכונדריה המועברות באופן ספונטני בין תאים על ידי תהליכים כמו מנהור ננו-צינורות או מיקרו-שלפוחית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן להעריך את השפעות המיטוכונדריה ללא תלות בגורמים אחרים הקיימים בסביבת המיקרו כמו ציטוקינים או מטבוליטים וגם של תרכובות אחרות שיכולות גם הן לסחור בננו-צינורות המנהור.

למטרות הדמיה, ניתן לסמן את המיטוכונדריה של MSC ו-GSC בצבעים חיוניים לפני העברת המיטוכונדריה על ידי MitoCeption. כדי להתחיל, לאחר תיוג מראש של GSCs עם צבעים חיוניים על פי פרוטוקול הטקסט, אסוף נוירוספרות GSC בצינור של 50 מיליליטר על ידי צנטריפוגה ב-270 פעמים גרם ב-20 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. השתמש בחמישה מיליליטר של HBSS כדי לשטוף את התאים ולסובב שוב את הצינור.

שאפו את הסופרנטנט ועם 100 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין-EDTA השעו מחדש בעדינות את כדור ה-GSC. לאחר מכן דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות. לאחר מכן, הוסף 10 מיקרוליטר של 20 מילי-מולרי סידן כלורי בשני מיקרוליטר ב-10 מיליגרם למיליליטר של DNase I לשפופרת.

נתק את הנוירוספרות על ידי שימוש בפיפטה P200 כדי לפיפטה בעדינות למעלה ולמטה 30 עד 50 פעמים תוך הימנעות מהיווצרות בועות. הוסף לתאים 10 מיקרוליטר של מעכב טריפסין 5% ב-10 מיליליטר של HBSS וצנטריפוגה את ה-GSCs למשך שבע דקות. לאחר מכן השליכו את הסופרנטנט ו -10 מיליליטר של GSC Basal Medium לדגימה.

כעת, באמצעות תא ספירה של תומא, ספרו את התאים לפני שתסתובבו שוב. הוסף את הנפח המתאים של מדיום התפשטות GSC כדי להגיע לתרכיז סלולרי של 10 עד ה-GSC השישי למיליליטר. לאחר מכן זרע 10 עד החמישי GSCs לבאר של צלחת 96 בארות.

צנטריפוגה את הצלחת כך שה- GSCs יתיישבו בתחתית הבארות. בדוק את התאים מתחת למיקרוסקופ. לאחר מכן דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

כדי לבצע בידוד מיטוכונדריה של MSC, התחל בהתאמת טמפרטורת המיקרו-צנטריפוגה לארבע מעלות צלזיוס. הכן שני צינורות של 1.5 מיליליטר המסומנים A ו-C המכילים ריאגנטים למיצוי המיטוכונדריה. הכן שני צינורות נוספים המסומנים MSC ו- MiTo.

שמור את הצינורות על קרח. הכינו גם צינורות לדילולים הסדרתיים של המיטוכונדריה שיוגדרו עם תכשיר המיטוכונדריה. השתמש ב-10 מיליליטר PBS שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס כדי לשטוף את ה-MSCs.

לאחר מכן, עם שני מיליליטר של טריפסין ללא EDTA, שטפו את התאים למשך 10 שניות והוסיפו עוד מיליליטר אחד של טריפסין לפני הדגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש עד 10 דקות. יש להימנע משימוש ב-EDTA בהתאם לפרוטוקול, במיוחד עבור MSC Trypsinization ועבור מעכב פרוטאז המשמש בתכשיר המיטוכונדריה. שחזר את ה-MSCs על ידי הוספת 10 מיליליטר של Alpha MEM 10% FBS והעביר את המתלים לצינור של 50 מיליליטר.

ואז צנטריפוגה של התאים. השליכו את הסופרנטנט והוסיפו 10 מיליליטר של אלפא MEM 10% FBS לגלולת התא. לאחר מכן השתמש בתא ספירה Malassez כדי לספור את ה-MSCs לפני שתסובב מטה ארבע עד חמש פעמים 10 לתאים החמישיים.

השליכו את הסופרנטנט, הוסיפו מיליליטר אחד של Alpha MEM 10% FBS קר כקרח לגלולת התא והעבירו את התאים לצינור המסומן ב-MSC שהוכן קודם לכן תוך המשך שמירה על קרח. לאחר מכן צנטריפוגה את צינור ה-MSC ב-900 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות והסר את כל המדיום הנותר מהצינור. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של מגיב בידוד מיטוכונדריה A עם מעכבי פרוטאז נטולי EDTA ל-MSCs ולמערבולת במהירות בינונית למשך חמש שניות.

לאחר מכן השאירו את הצינורות על קרח למשך שתי דקות בדיוק. הוסף 2.5 מיקרוליטר של מגיב בידוד מיטוכונדריה B ומערבל את התאים במהירות מקסימלית למשך 10 שניות לפני החזרת הצינורות לקרח. חזור על המערבולת כל 30 שניות למשך חמש דקות.

כעת, הוסיפו 200 מיקרוליטר של ריאגנט בידוד מיטוכונדריה C עם מעכבי פרוטאז נטולי EDTA לצינור וערבבו את התוכן על ידי הטיית הצינור כ-30 פעמים. צנטריפוגה את הצינורות ב -700 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. העבירו את הסופרנטנט המכיל את המיטוכונדריה MSC לצינור ה-MiTo שהוכן בעבר.

צנטריפוגה את הדגימה ב-3,000 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט, השתמש ב-200 מיקרוליטר של מגיב C כדי לשטוף את הגלולה המיטוכונדריאלית. לאחר מכן סובב את המתלה ב -12, 000 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות כדי לגלול את האברונים.

כדי להעביר מיטוכונדריה MSC מבודדת ל-GSCs, הוסף 200 מיקרוליטר של מדיום התפשטות GSC מקורר מראש לגלולה המיטוכונדריאלית. לדלל את ההכנה המיטוכונדריאלית במדיום התפשטות GSC כדי לאפשר באופן עקבי תוספת של 20 מיקרוליטר של תרחיף מיטוכונדריאלי ל-GSCs. לאחר מכן, הוסיפו לאט את המיטוכונדריה קרוב לתחתית הבאר.

כדי לשלוט בדליפת צבע חיוני של מיטוכונדריה MSC, הוסף את אותה כמות של הכנת מיטוכונדריה לבארות של צלחת 96 בארות המכילה מדיום התפשטות GSC בלבד. צנטריפוגה את הצלחות ב -1, 500 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן הניחו מיד את התרבויות על 37 מעלות צלזיוס.

למחרת, כדי לנתח את בארות הבקרה לדליפת צבע חיונית, זרעו תאי GSC כפי שתואר קודם לכן, צנטריפוגה את הצלחת, ולאחר מכן דגרו על התרביות ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה. צנטריפוגה צלחת 96 בארות המכילה מיטוכונדריה בלבד. לאחר מכן שאפו את המדיום מצלחת הבאר GSC 96 והחליפו אותו במיטוכונדריה סופרנטנט.

דגרו את ה-GSCs עם המיטוכונדריה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים. לבסוף, בצע ניתוח של העברת מיטוכונדריה, ניתוח FACS והדמיה קונפוקלית על פי פרוטוקול הטקסט. GSCs הם תאי גזע סרטניים הגדלים כנוירוספרות כדי לשמר את תכונות תאי הגזע שלהם.

רגע לפני העברת המיטוכונדריה, הם נזרעים כתאים בודדים כדי לאפשר יעילות גבוהה של העברת מיטוכונדריה, ולמחרת, כפי שמוצג כאן, התאים נצפים שוב ויוצרים נוירוספירות. באיור זה, ניתן לראות מיטוכונדריה MSC עם תווית פלואורסצנטית מקומית בתוך Gb4 GSCs. המיטוכונדריה של MSC מופיעות בכל ה-GSCs בדומה למיטוכונדריה של GSC.

ניתן היה לראות את העברת המיטוכונדריה של MSC עבור רוב ה-GSCs בשחזור תלת מימד מתמונות קונפוקליות GSC מאשרות את הלוקליזציה הבין-תאית של מיטוכונדריית ה-MSC המועברת. תיוג מראש של GSCs עם צבעים חיוניים של תאים כחולים ואדומים איפשר לדמיין את הלוקליזציה של מיטוכונדריית MSC המועברת הנראית בירוק ביחס למיטוכונדריה GSC האנדוגנית. כפי שמוצג כאן, MitoCeption עם כמויות הולכות וגדלות של מיטוכונדריה MSC פלואורסצנטית הובילה לאותות FACS מוגברים ועם כמה סדרי גודל גבוהים יותר מאות הבקרה.

פרוטוקול העברת המיטוכונדריה המוצג כאן שבוצע על GSCs של תא בודד הראה תגובה תלוית מינון ועוצמת פלואורסצנטיות ממוצעת יחסית. לבסוף, למרות שהעברת מיטוכונדריה MSC הושגה גם על נוירוספרות GSC, יעילות ההעברה ל-GSCs בתנאים אלה הייתה נמוכה יותר בהשוואה למיטוכונדריה שהועברה ל-GSCs שנזרעו לראשונה כתאים בודדים. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שלוש שעות אם היא מבוצעת כראוי.

בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לשמור את הכנת המיטוכונדריה על קרח כל הזמן. בעקבות הליכים אלה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו FACS, מיקרוסקופיה קונפוקלית, QPCR על DNA מיטוכונדריאלי על מנת לדמיין ולכמת את העברת המיטוכונדריה של MSC לתאי המטרה. ניתן לבצע מחקרים פונקציונליים גם כדי לקבוע את ההשפעות הביולוגיות של המיטוכונדריה המועברת.

זכור כי מחקרים אלה יבוצעו בדרך כלל עם כמויות נמוכות יותר של מיטוכונדריה מאלה המשמשים להמחשת העברת המיטוכונדריה. טכניקה זו תאפשר לחקור את התוצאה וההשפעות הביולוגיות של מיטוכונדריה המועברות באופן ספונטני בין תאים בתנאים פיזיולוגיים או פתולוגיים רגילים ובכך תתרום לפיתוח טיפולים טיפוליים חדשים.