בידוד של המיטוכונדריה ללא פגע מן שרירי השלד על ידי דיפרנציאל צנטריפוגה מדידות Respirometry ברזולוציה גבוהה

המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד מיטוכונדריה משריר שלד באמצעות צנטריפוגציה דיפרנציאלית ולהגדיר את שיעורי הנשימה של קומפלקסים I, II ו-IV של שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביו-אנרגיה המיטוכונדריאלית, כגון מחלות ותסדרומים הקשורים לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה, כולל מחלות נוירולוגיות שונות, אלח דם (ספסיס) והפרעות הקשורות לגיל. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היעדרה של רוב הגורמים הציטולוגיים בדגימת המיטוכונדריה המבודדת, אשר עלולים להפריע לניתוח של תפקודי המיטוכונדריה. את ההליך תדגים סנדרה נאנסוז (Sandra Nansoz), הטכנאית מהמעבדה שלי.

כדי להתחיל בהליך זה, השג כלי כימי עם דגימות של שריר שלד כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. הנח את הכלי בתוך דלי קרח. בעזרת מספריים עדינים, קצץ את השריר לחתיכות בגודל של 1 עד 2 מילימטרים.

בשלב הבא, שטפו את הרקמה הקצוצה פעמיים עם בופר בידוד קר מאוד, תוך שימוש ב-20 milliliters לכל שטיפה. השעיו את הרקמה השטופה ב-10 milliliters של בופר בידוד לכל גרם רקמה, ולאחר מכן הוסיפו five milligrams protease-G לרקמה. לאחר מכן, הניחו את הכוס בתוך אמבט קרח עם מערבל מגנטי וערבבו במשך 10 דקות.

לאחר מכן, דללו את התושה ב-10 מיליליטרים נוספים של באפר בידוד (isolation buffer) בתוספת 0.2% BSA מנוקה שומן לגרם רקמה. לאחר מכן, שפכו את כל באפר הבידוד מהכלי. שטפו את הרקמה פעמיים עם באפר בידוד קר מאוד בתוספת 0.2% BSA, תוך שימוש ב-20 מיליליטרים לכל שטיפה.

לאחר מכן, השהוּ את הרקמה שוב ב-10 milliliters של באפר בידוד מועשר ב-BSA לכל גרם רקמה. השתמשו בהומוגניזר זכוכית חצי-אוטומטי עם פסטל בחיבור רפוי כדי להומוגנז את הרקמה. לאחר מכן, העבירו את ההומוגנאט למבחורת צנטריפוגה וצנטריפגו ב-10,000 times G למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

הספירה את הנוזל העליון בעזרת פ pipette סרולוגית. השהו מחדש את המשקע ב-10 milliliters של מצע בידוד מקורר בקרח המועשר ב-BSA לכל גרם רקמה. סבבו את התוך תרחף בצנטריפוגה ב-350 times G למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, השתמשו בפיפטה סרולוגית כדי להפריש את העל-משקע (supernatant) ולהשליך את המשקע. סננו את העל-משקע אל תוך כלי זכוכית (beaker) הנשמר על קרח, דרך שתי שכבות של גזה. העבירו את התוךלוקה המסוננת למבחנה לצנטריפוגה וסובבו ב-7,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, השליכו את העליון. השעיו שוב את משקע המיטוכונדריה הגולמי בחמישה מיליליטר של בופר בידוד מועשר ב-BSA לכל גרם רקמה. סבבו את תרחף זה ב-7,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

לאחר מכן, השליכו את הנוזל העליון ותלו את המשקע ב-20 milliliters של בופר שטיפה. סבבו בצנטריפוגה ב-7,000 times G למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius. חזרו על תהליך התליה והסבב בצנטריפוגה פעם נוספת.

לאחר מכן, השליכו את על-הנוזל (supernatant) והשביחו מחדש את המשקע במיליליטר אחד של בופר שטיפה. קבעו את ריכוז החלבון באמצעות כל שיטה סטנדרטית. לאחר מכן, שמרו את תרחיף המיטוכונדריה המרוכז על קרח עד לביצוע בדיקות הרספירומטריה.

ראשית, השביה מחדש את תרכיז המיטוכונדריה בבופר נשימה עד לריכוז סופי של 0.4 milligrams per milliliter של חלבון מיטוכונדריאלי. לאחר מכן, שאב את מדיום הנשימה מתא האוקסיגראף המכויל לאוויר. הוסף 2.1 milliliters של תרחיף מיטוכונדריה מבודד.

הכנס פקק לסגירת תא האוקסיגרף. לאחר מכן, ערבב את תרחיף המיטוכונדריה באופן רציף במהירות של 700 RPM ובטמפרטורה של 37 °C. רשום את הנשימה התאית בקו הבסיס למשך שלוש עד חמש דקות, עד להשגה של אות זרימת חמצן יציב.

כדי להתחיל נשימה התלויה בקומפלקס I, הזרק 12.5 µL של malate בריכוז 0.8 M לתוך תא אוקסיגראף שהוכן עם תרחיף מיטוכונדריה מבודד, דרך פתח ההזרקה מטיטניום של הפקק. לאחר מכן, הזרק 10 µL של glutamate בריכוז 2 M. רשום את הנשימה התאית למשך שלוש עד חמש דקות, עד להשגת אות זרימת חמצן יציב.

לאחר מכן, הזרק 10 µL של ADP בריכוז 0.05 M אל תוך התא דרך פתח ההזרקה. רשום את הנשימה התאית עד שסיגנל שטף החמצן יעלה, לאחר מכן יירד ויתייצב. עבור נשימה התלויה בקומפלקס II, הזרק 2 µL של rotenone בריכוז 0.2 mM אל תוך תא אוקסיגראף שהוכן עם תמיחת מיטוכונדריה מבודדת.

יש להקליט את הנשימה התאית עד להשגת אות זרימת חמצן יציב. לאחר מכן, יש להזריק 20 µL של סוקסינאט בריכוז 1 M. יש להקליט את הנשימה התאית עד להשגת אות זרימת חמצן יציב.

לאחר מכן, הזרק 10 µL של ADP בריכוז 0.05 M לתוך התא דרך פתח ההזרקה. רשום את הנשימה התאית עד שהאות של שטף החמצן עולה, לאחר מכן יורד ומתייצב. עבור נשימה התלויה בקומפלקס IV, הזרק 2.5 µL של ascorbate בריכוז 0.8 mM לתוך תא אוקסיגרף שהוכן עם תרחיף מיטוכונדריה מבודדות.

לאחר מכן, מזריקים מיד 2.5 µL של TMPD בריכוז 0.2 M ו-10 µL של ADP בריכוז 0.05 M. יש לתעד את הנשימה התאית עד להשגה של אות זרימת חמצן יציב. לאחר מכן, מזריקים 10 µL של סודיום אזיד בריכוז 1 M.

הקליטו את הנשימה התאית עד שסיגנל שטף החמצן יירד ולאחר מכן יתייצב. במחקר זה, מבודדים מיטוכונדריה שלמות משריר שלד. לאחר מכן, נמדדים קצבי נשימה התלויים בקומפלקס I באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה.

כפי שניתן לראות, קצב הנשימה המיטוכונדריאלית עולה מיד עם הוספת ADP. קצב הנשימה יורד לאחר התכלות ה-ADP לרמות הדומות לאלו שנצפו לפני הוספת ה-ADP. דבר זה מעיד על כך שהיחס בין מצב 3 למצב 4, המכונה יחס הבקרה הנשימתי (respiratory control ratio), או RCR, הוא גבוה, וכי השלמות המיטוכונדריאלית נשמרה היטב במהלך הליך הבידוד.

שיעורי הנשימה התלויים בקומפלקס II נמדדים לאחר מכן על ידי עיכוב הנשימה התלויה בקומפלקס I באמצעות rotenone והזרקת succinate, המשמש כסובסטרט לקומפלקס II. לאחר מכן מוסיפים ADP, מה שגורם לעלייה מיידית בקצב הנשימה. עם התכלות ה-ADP, קצב הנשימה יורד לרמות הדומות לאלה שנצפו לפני הוספת ה-ADP, דבר המעיד על RCR גבוה, ובכך על כך שהשלמות המיטוכונדריאלית נשמרה היטב במהלך הבידוד.

שיעורי נשימה התלויים במערכת IV נצפים על ידי הוספת ascorbate, TMPD ו-ADP. לאחר מכן מתווסף Sodium azide כדי לעכב את מערכת IV. ההבדל בצריכת החמצן לפני ואחרי הוספת ה-sodium azide מפורש כנשימה הממשי של מערכת IV. שיעור הנשימה הגבוה התלוי במערכת IV שנצפה במצב 3 מעיד על כך ששלמות המיטוכונדריה נשמרה היטב במהלך הליך הבידוד.

ברגע שהטכניקה נלמדת היטב, ניתן לבצעה בפחות משעה וחצי אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבצע כיול של חיישני החמצן מראש, לפני ההומוגניזציה. לאחר פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מדידות של תכולת ADP תאית, פוטנציאל ממבנה המיטוכונדריה, פעילות אנזימטית של ATP synthase ורמות סובסטרט, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון האם שינויים בשיעורי הנשימה נובעים ממחסור בסובסטרט מיטוכונדריאלי, מפוטנציאל הממברנה או מפעילות אנזימטית מופחתת של ATP synthase.

לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של השלב של בידוד מיטוכונדריה משריר שלד באמצעות סנטריפוגציה דיפרנציאלית, וכיצד למדוד שיעורי נשימה של קומפלקסים מיטוכונדריאליים I, II ו-IV באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום מטבוליזת האנרגיה המיטוכונדריאלית לחקור את תפקודי האנרגיה של מיטוכונדריה בתחומים כגון מחלות מיטוכונדריאליות גנטיות, מיופתיות ופגיעות רפרופוזיה לאחר איסכמיה במיטוכונדריה מבודדת. זכרו כי עבודה עם antimycin A, rotenone, sodium azide ו-FCCP עלולה להיות מסוכנת ביותר.

ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון חבישת כפפות ולבישת חלוקי מעבדה, בעת ביצוע הליך זה.