Name: בידוד של המיטוכונדריה ללא פגע מן שרירי השלד על ידי דיפרנציאל צנטריפוגה מדידות Respirometry ברזולוציה גבוהה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: למדו לבודד מיטוכונדריה משלד על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית ולמדוד קצבי נשימה של מורכבים I, II ו-IV ברזולוציה גבוהה. שיטה זו מסייעת בחקר מחלות נוירולוגיות וזיקנת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדע של שווייץ (מענק 32003B_127619).

הביופסיה השרירה ארבעה הראשים נלקחת חזיר מורדם, שממנו המיטוכונדריה מבודד על ידי צנטריפוגה הפרש. החזיר משמש לאחר מכן עבור ניסוי נוסף. המחקר מתבצע בהתאם המכונים הלאומיים הנחיות בריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ובאישור ועדת טיפול בבעלי חיים של קנטון ברן, שוויץ. 1. המגון שרירי השלד ובידוד מיטוכונדריאלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלו 5-10 ארבעה גרמו דגימת שריר מ חזיר מורדם. ב assay מופיע, השתמשו בשרירי שלד חזיריים. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לבודד המיטוכונדריה ממינים אחרים (למשל, חולדה, עכברים, אדם, וכו &#39;.). הערה: שלב זה מתבצע על ידי מומחה רפואי עם התמחות בכירורגיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזירים שלווים עם קטמין תוך שרירית (20 מ&quot;ג / ק&quot;ג) ו xylazine (2 מ&quot;ג / ק&quot;ג), לפני הרדמה מושרה עם התוךmidazolam ורידי (0.5 מ&quot;ג / ק&quot;ג, בתוספת אטרופין 0.02 מ&quot;ג / ק&quot;ג). לשמור על הרדמה עם חליטות תוך ורידי רציף של propofol (4-8 מ&quot;ג / ק&quot;ג ח) ו- פנטניל (30 מיקרוגרם / ק&quot;ג ח) במהלך הניתוח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לטבול את דגימת רקמה בתוך כוס המכילה 20 מ&quot;ל של חיץ בידוד המיטוכונדריה קר כקרח (טבלה 1). הערה: חוצצי שימוש במהלך המגון ו centrifugations צריך להיות קר כקרח יש pH פיסיולוגי רלוונטי עם כוח יוני האוסמוטי תואם cytosol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את דגימת רקמה בכוס על איזון tared אנליטי. טרה את האיזון עם כוס המכילה 20 מ&quot;ל של חיץ בידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הכוס על דלי קרח. הערה: בצע את כל השלבים הבאים עבור ההליך המגון בטמפרטורה דלי קרח ולשמור את כל המאגרים על דלי הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לרכך את שרירי השלד בכוס (לשמור על הקרח) לחתיכות קטנות 1-2 מ&quot;מ במשך 3-4 דקות באמצעות sciss בסדרORS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את רקמת טחון בכוס פעמים עם חיץ בידוד קר כקרח (20 מיליליטר כל צעד כביסה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את הרקמה 10 כרכים של חיץ בידוד לפי משקל רקמות (ז) המכיל רקמות 5 מ&quot;ג פרוטאז / g. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הכוס באמבט קרח על stirrer המגנטי ומערבבים במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את ההשעיה בכוס עם 10 כרכים נוספים של חיץ בידוד לפי משקל רקמות (ז) בתוספת 0.2% (משקל / נפח) אלבומין בסרום שור נטול שומן (BSA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג את כל חיץ הבידוד השלים עם 0.2% BSA ולשטוף את הרקמה בכוס פעמים עם חיץ בידוד קר קרח בתוספת 0.2% BSA (20 מיליליטר כל צעד כביסה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend רקמת ב 10 כרכים של חיץ בידוד לפי משקל רקמות (ז) בתוספת 0.2% עם נטול שומן BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize רקם עם homogenizer זכוכית חצי אוטומטי (כל זמן על קרח) עם עלי רפוי (10 משייכות). הערה: Homogenizדואר הרקמה תמיד באותו אופן (אותו מספר משיכות, למשל, 10 משיכות). מספר גבוה יותר של שבץ עלול לגרום נזק ו לנתק את המיטוכונדריה. רצוי, homogenize הרקמה באמצעות homogenizer אוטומטי. באופן ידני (וסובייקטיבית) דגימות רקמת הומוגני homogenizers זכוכית עשויות לייצר איכויות שונות של המיטוכונדריה מבודד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה רקמת הומוגני ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 10,000 x ז. הערה: כל השלבים צנטריפוגה מבוצעים צנטריפוגות עם רוטורים בזווית קבועים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant באמצעות pipet סרולוגיות ו resuspend גלולה במדיום בידוד קר כקרח-בתוספת BSA (10 מ&quot;ל / גרם רקמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב g x 350. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שומרים לעצמנו את supernatant באמצעות pipet סרולוגיות וזורקים את הכדור (פסולת הסלולר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את supernatant לתוך מבחנה (לשמור על הקרח) באמצעות שתי שכבות של גזה (17 האשכולות / 2 ס&quot;מ) להסיר תאים debrהוא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה המסוננת על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב 7000 x ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend גלולת המיטוכונדריה הגולמית במאגר הבידוד (5 רקמות מיליליטר / g) בתוספת 0.2% (משקל / נפח) BSA ו צנטריפוגות ההשעיה על 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ב 7000 x ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend גלולת המיטוכונדריה הגולמית חיץ לשטוף (טבלה 1). צנטריפוגה ההשעיה שוב ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 7000 x ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend גלולת המיטוכונדריה הגולמית במאגר לשטוף בצנטריפוגה ההשעיה שוב ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 7000 x גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ו resuspend גלולה המיטוכונדריה גולמי 1.0 מ&quot;ל של חיץ לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת ריכוז החלבון של ההשעיה המיטוכונדריה ולשמור ההשעיה המיטוכונדריה המרוכזת על קרח. הערה: ריכוז חלבון ניתן למדוד באמצעות כל שיטה סטנדרטית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זמן קצר לפניכדי respirometry מבחני, resuspend ההשעיה המיטוכונדריה למאגר הנשימה לריכוז סופי של חלבון 0.4 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​המיטוכונדריה. </li></ol> 2. ברזולוציה גבוהה Respirometry <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.1 פיפטה מ&quot;ל הנשימה חיץ (טבלה 1) 16 לתוך תא oxygraph ברזולוציה גבוהה ומערבבים למאגר ברציפות באמצעות בר בחישה מגנטית הנוכחי בתא (700 סל&quot;ד) בשעה 37 ° C עבור 1 ח עד אות השטף חמצן יציבה של חיישן חמצן polarographic מתקבל. הערה: אלקטרודות חמצן Polarographic בתוך כל תא oxygraph למדוד את ריכוז החמצן ולחשב צריכת חמצן (שטף) בתוך כל תא. ריכוז החמצן ושיעורי צריכת חמצן (שטף) מוצגים בזמן אמת באינטרנט במחשב באמצעות תוכנה עבור רכישת נתונים וניתוח. בנוסף, על מנת להבטיח תוצאות מדויקות ואמינות, תיקון רקע חמצן אינסטרומנטלי צריך להיותנעשה על פי הוראות היצרן. הערה: מדויק 2.1 מיליליטר של חיץ נשימה מתווספת לתוך התא לכיול של נפח תא סופי של 2.0 מיליליטר לאחר סגירת הפקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע כיול אוויר של חיישן חמצן polarographic פי הפרוטוקולים של יצרן 17. הערה: במהלך כיול אוויר, עם מתנת שלב גז, ריכוז חמצן התקשורת יהיה לאזן בסדר גודל של 15-20 דקות. בהתאם טמפרטורה, לחץ ברומטרי, מסיסות של -oxygen ריכוז התקשורת ניתן לחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר כיול אוויר, לשאוב את המדיום הנשימה מהאולם oxygraph ולהוסיף 2.1 מ&quot;ל של השעיה המיטוכונדריה מבודד (0.4 מ&quot;ג / חלבון המיטוכונדריה מ&quot;ל) משלב 1.24 אל חדר של oxygraph. הערה: היקף מאגר נשימה תלוי במכשיר להגדיר ויצרן. לקבלת respirometry ברזולוציה גבוהה, 2.1 מ&quot;ל של bu הנשימהffer מתווסף לתוך התא לכיול של נפח תא סופי של 2.0 מיליליטר לאחר סגירת הפקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את תא oxygraph ידי החדרת את הפקק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבב את ההשעיה המיטוכונדריה ברציפות באמצעות בר בחישה מגנטי נוכחי בתא (700 סל&quot;ד) בשעה 37 ° C ו- נשימה תאית שיא בתחילת המחקר במשך 3-5 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת. הערה: ריכוז החמצן ואת אות שטף חמצן מוצג בזמן אמת באינטרנט במחשב באמצעות תוכנה עבור רכישת נתונים וניתוח 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, להזריק מצעים ומעכבים לנשימת המיטוכונדריה דרך יציאות הזרקה טיטניום של הפקקים באמצעות הפרוטוקולים הסטנדרטיים הבאים. </li></ol> נשימת 3. אני תלוי Complex <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תא oxygraph המכיל את ההשעיה המיטוכונדריה מבודד (0.4 מ&quot;ג / מ&quot;ל) הנוהל המתואר בצעדים 2.1-2.5 ולחכות אות יציבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 12.5 μL של 0.8 M malate (5 מ&quot;מ ריכוז סופי) ו -10 μL של 2 M גלוטמט (10 מ&quot;מ הריכוז הסופי) לתוך תא oxygraph המכיל ההשעיה המיטוכונדריה מבודד (0.4 מ&quot;ג / מ&quot;ל) דרך יציאת זריקה טיטניום של פקק קאמרית להקליט נשימה תאית במשך 3-5 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת. הערה: כל הזריקות בשלבים הבאים מבוצעות דרך יציאות הזרקה טיטניום של פקקים באמצעות מזרקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 10 μL של 0.05 מ ADP (0.25 מ&quot;מ) לתוך תא oxygraph דרך נמל הזרקת טיטניום של הפקק הקאמרי ולהקליט נשימה המיטוכונדריאלי עד מגביר אות שטף חמצן, ולאחר מכן יורד ומייצב (3-5 דקות). הערה: הרמה של נשימה לאחר תוספת ADP עולה כי ריכוז ADP היה גבוה להרוות. בהתאם לכמות של המיטוכונדריה בשימוש במהלך הנשימה, ריכוז ADP יש טיטרציהעבור צריכת חמצן מדינת 3 יציבה (נשימה מקסימלי). תוספת של ADP ההשעיה המיטוכונדריה תניע לעלייה בצריכת חמצן ואת אות שטף החמצן תגדל (נשימת מדינת 3). לאחר ADP הוא נצרך, אות שטף חמצן יקטן (נשימת מדינת 4). </li></ol> 4. נשימה השנייה תלויה Complex <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תא oxygraph המכיל ההשעיה המיטוכונדריה מבודד (0.4 מ&quot;ג / מ&quot;ל) הנוהל המתואר בצעדים 2.1-2.5 ולחכות אות יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 2 μL של 0.2 rotenone מ&quot;מ (0.2 מיקרומטר) &#39;זהירות&#39; החדרת oxygraph דרך נמל הזרקת טיטניום של הפקק הקאמרי באמצעות מזרק ולהקליט את הנשימה התאית במשך 3-5 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת. הערה: Rotenone הוא רעל מסוכן ועלול להיות השפעה משמעותית על בריאות האדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 20 μL של 1 succinate M (10 מ&quot;מ) לתוך ch oxygraphענבר נשימה המיטוכונדריאלי שיא 3-5 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 10 μL של 0.05 מ ADP (0.25 מ&quot;מ) לתוך תא oxygraph דרך נמל הזרקת טיטניום של הפקק הקאמרי ולהקליט נשימה תאית עד מגביר אות שטף חמצן, מייצב, ולאחר מכן יורד ומייצב (3-5 דקות). הערה: תוספת של ADP ההשעיה המיטוכונדריה תניע לעלייה בצריכת חמצן ואת אות שטף החמצן תגדל (נשימת מדינת 3). לאחר ADP הוא נצרך, אות שטף חמצן יקטן (נשימת מדינת 4). </li></ol> 5. נשימה IV התלוי Complex <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין תא oxygraph המכיל השעיה המיטוכונדריה מבודדת (0.4 מ&quot;ג / מיליליטר) הנוהל המתואר בצעדים 2.1 כדי 2.5 הפרוטוקול ולחכות אות יציבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז להזריק 2.5 μL של ascorbate 0.8 מ&quot;מ (1 מ&quot;מ). מיד לאחר מכן להזריק 2.5 μL של 0.2M TMPD (0.25 מ&quot;מ) ו -10 μL של 0.05 מ ADP (0.25 מ&quot;מ) לתוך תא oxygraph ואת הנשימה התאית שיא עד מגביר אות השטף חמצן ומייצב (3-5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף להזריק 10 μL של 1 M יזיד הנתרן (5 מ&quot;מ) &#39;זהירות&#39; החדרת oxygraph ולהקליט נשימה תאית עד ירידות אות שטף חמצן ומייצבת. הערה: אזיד הנתרן הוא רעל מסוכן ועלול להיות השפעה משמעותית על בריאות האדם. </li></ol> 6. ציטוכרום C מבחן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכין תא oxygraph המכיל השעיה המיטוכונדריה מבודדת (0.4 מ&quot;ג / מיליליטר) הנוהל המתואר בצעדים 2.1 כדי 2.5 הפרוטוקול ולחכות אות יציבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 12.5 μL של 0.8 M malate (5 מ&quot;מ ריכוז סופי) ו -10 μL של 2 M גלוטמט (10 מ&quot;מ הריכוז הסופי) לתוך תא oxygraph המכיל ההשעיה המיטוכונדריה מבודד (0.4 מ&quot;ג / מ&quot;ל) דרך יציאת זריקה טיטניום של פקק קאמריתולהקליט נשימה תאית במשך 3-5 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק 10 μL של 0.5 M ADP (2.5 מ&quot;מ) לתוך תא oxygraph דרך נמל הזרקת טיטניום של הפקק הקאמרי נשימה המיטוכונדריאלי שיא עד מגביר אות שטף חמצן, ולאחר מכן יורדת ומייצב (3-5 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, להזריק 5 μL של ציטוכרום C 4 מ&quot;מ (10 מיקרומטר) לתוך תא oxygraph ולהקליט נשימה תאית במשך 5 דקות עד אות שטף חמצן יציבה מושגת. </li></ol>

<ol><li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues.+I.+Isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver%3B+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytochemical studies of mammalian tissues. I. Isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> J. Biol. Chem. 172, 619-635 (1948).</li>
<li>Sims, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+metabolically+active+mitochondria+from+rat+brain+and+subregions+using+Percoll+density+gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of metabolically active mitochondria from rat brain and subregions using Percoll density gradient centrifugation.</a> J. Neurochem. 55 (2), 698-707 (1990).</li>
<li>Hartwig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+comparison+between+two+classical+and+a+kit-based+method+for+mitochondria+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A critical comparison between two classical and a kit-based method for mitochondria isolation.</a> Proteomics. 9 (11), 3209-3214 (2009).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li>
<li>Niklas, J., Melnyk, A., Yuan, Y., Heinzle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+permeabilization+for+the+high-throughput+measurement+of+compartmented+enzyme+activities+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Selective permeabilization for the high-throughput measurement of compartmented enzyme activities in mammalian cells.</a> Anal. Biochem. 416 (2), 218-227 (2011).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers%2C+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nat. Protoc. 3 (6), 965-976 (2008).</li>
<li>Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+assessing+mitochondrial+function+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Methods for assessing mitochondrial function in diabetes.</a> Diabetes. 62 (4), 1041-1053 (2013).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle%3A+new+perspectives+of+mitochondrial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1837-1845 (2009).</li>
<li>Vuda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+catecholamines+on+hepatic+and+skeletal+muscle+mitochondrial+respiration+after+prolonged+exposure+to+faecal+peritonitis+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Effects of catecholamines on hepatic and skeletal muscle mitochondrial respiration after prolonged exposure to faecal peritonitis in pigs.</a> Innate Immun. 18 (2), 217-230 (2012).</li>
<li>Corrêa, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+in+septic+shock%3A+effects+on+tissue+perfusion%2C+organ+function%2C+and+mitochondrial+respiration+in+a+porcine+model+of+fecal+peritonitis%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II in septic shock: effects on tissue perfusion, organ function, and mitochondrial respiration in a porcine model of fecal peritonitis.</a> Crit. Care Med. 42 (8), e550-e559 (2014).</li>
<li>Jeger, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose+response+of+endotoxin+on+hepatocyte+and+muscle+mitochondrial+respiration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Dose response of endotoxin on hepatocyte and muscle mitochondrial respiration in vitro.</a> Biomed Res Int. 2015, 353074(2015).</li>
<li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNicholls%2C+DG+%22Bioenergetics%22">Bioenergetics</a>. 3, Academic Press. San Diego. (2002).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+respiratory+chain+and+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Enzymol.+Relat.+Subj.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The respiratory chain and oxidative phosphorylation.</a> Adv. Enzymol. Relat. Subj. Biochem. 17, 65-134 (1956).</li>
<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3076726/">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).</li>
<li>Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+phosphorylation+efficiency+and+depression+of+uncoupled+respiration+in+mitochondria+under+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 (20), 11080-11085 (2000).</li>
<li>Pesta, D., Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+respirometry%3A+OXPHOS+protocols+for+human+cells+and+permeabilized+fibers+from+small+biopsies+of+human+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle.</a> Methods Mol. Biol. 810, 25-58 (2012).</li>
<li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+structure+and+function+are+disrupted+by+standard+isolation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial structure and function are disrupted by standard isolation methods.</a> PLoS One. 6 (3), e18317(2011).</li>
<li>Picard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+functional+impairment+with+aging+is+exaggerated+in+isolated+mitochondria+compared+to+permeabilized+myofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial functional impairment with aging is exaggerated in isolated mitochondria compared to permeabilized myofibers.</a> Aging Cell. 9 (6), 1032-1046 (2010).</li>
<li>Graham, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+a+crude+mitochondrial+fraction+by+density-gradient+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell.+Biol.+Chapter+3%22%5BJournal%5D)">Purification of a crude mitochondrial fraction by density-gradient centrifugation.</a> Curr. Protoc. Cell. Biol. Chapter 3. 3, (2001).</li>
<li>Franko, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+of+pure+and+functional+mitochondria+from+mouse+tissues+using+automated+tissue+disruption+and+enrichment+with+anti-TOM22+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation of pure and functional mitochondria from mouse tissues using automated tissue disruption and enrichment with anti-TOM22 magnetic beads.</a> PLoS One. 8 (12), 382392(2013).</li>
<li>Pecinová, A., Drahota, Z., Nůsková, H., Pecina, P., Houštěk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+basic+mitochondrial+functions+using+rat+tissue+homogenates%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Evaluation of basic mitochondrial functions using rat tissue homogenates.</a> Mitochondrion. 11 (5), 722-728 (2011).</li>
<li>Lombardi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+oxidative+phosphorylation+in+skeletal+muscle+mitochondria+subpopulations+in+pig%3A+a+study+using+top-down+elasticity+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Characterisation of oxidative phosphorylation in skeletal muscle mitochondria subpopulations in pig: a study using top-down elasticity analysis.</a> FEBS Lett. 475 (2), 84-88 (2000).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

במחקר הנוכחי אנו מתארים פרוטוקול לבודד באיכות גבוהה, ללא פגם ו המיטוכונדריה שרירי שלד מצמיד בחוזקה על ידי צנטריפוגה הפרש אשר ניתן להשתמש בם עבור מחקרים תפקודיים כגון respirometry ברזולוציה גבוהה. כדי לבודד המיטוכונדריה שלם מצמידים בחוזקה, יש כמה נקודות קריטיות כדי להיחשב בתוך הפרוטוקול הנוכחי. לאחר קצירת רקמות השלד, זה צריך להיות שקוע מיד חיץ בידוד המיטוכונדריה קר כקרח. כל צעדי צנטריפוגה צריכים להיעשות על 4 מעלות...

bioenergetics מיטוכונדריאלי וקיבולות נשימה ניתן ללמוד לא רק בתאי permeabilized או סיבים אלא גם במיטוכונדריה מבודדת. במחקר הנוכחי, אנו מתארים פרוטוקול לבודד המיטוכונדריה שרירי שלד שלם באמצעות צנטריפוגה הפרש למדידות respirometry ברזולוציה גבוהה. כדי לבודד המיטוכונדריה תילן respirometry, הרקמה הומוגני המיטוכונדריה מבודד על ידי שיטת צנטריפוגה הפרש קונבנציונלית. שיטת צנטריפוגה ההפרש בוסס על centrifugations הרציף (בסדרה של גברת מהירות) של homogenates הרקמות הוצגה לראשונה על ידי Pallade ועמיתים לעבודה כמעט 70 שנים לפני 1. הרקמה טחונה ראשונה באמצעות מספריים הומוגני מכאני בתוך homogenizer זכוכית עם עלי רפוי. לאחר מכן homogenate הוא centrifuged במהירות נמוכה לבין הגלולה וכתוצאה המכילה רקמות רצופות, סלולריתפסולת גרעינים נמחקות. ואז, supernatant היא centrifuged מספר פעמים במהירות גבוהה השבר מועשר המיטוכונדריה נאסף. היתרונות של שיטת צנטריפוגה ההפרש לבודד המיטוכונדריה הוא כי: i) השיטה היא מהירה המיטוכונדריה יכול להיות מבודדת בתוך 1-1.5 שעות (ניסויי נשימה צריכות להתבצע מהר ככל האפשר); ii) הוא זול; ו- III) הוא יעיל מאוד ואת המיטוכונדריה מתקבלת על ידי צנטריפוגה הפרש טהורה מספיק עבור מבחני respirometry. החסרונות של השיטה צנטריפוגה ההפרש לבודד המיטוכונדריה הם כי אני) המיטוכונדריה עלול להיגרם מכך נזק ו זוגיים במהלך המגון; ii) את הזיהום של המיטוכונדריה עם מרכיבים תאיים אחרים (יכול להיפתר על ידי שטיפה נוספת גלולת המיטוכונדריה עם צעדים צנטריפוגה נוספים); iii) את האפשרות של בחירה תת-אוכלוסיות המיטוכונדריה שונות, למשל, במהלך שלבי centrifugations ההפרש, mitochondria עם צפופה תחתונה ניתן לשלול 7; ו- IV) בסלולרי המיטוכונדריה שמסביב חסר ורק הנשימה המקסימלי התיאורטית ניתן למדוד. שיטה נוספת לבודד המיטוכונדריה לצורך מבחני respirometry הוא שיפוע צפיפות צנטריפוגה 2. בטכניקה זו, תמצית הרקמות מונחת על פני פתרון של סוכרוז או שיפוע Percoll (עם צפיפות גבוהה יותר בחלק התחתון של צינור צנטריפוגה) ו centrifuged במהירות מסוימת, גרימת המיטוכונדריה כדי להיות מבודדת מרכיבים תאיים אחרים על פי שלהם צפיפויות. שיטה זו משמשת לעתים קרובות לבודד המיטוכונדריה מוח עם זיהום נמוך מאוד מן synaptosomes. עם זאת, המיטוכונדריה הכבד עכברוש המבודד על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות מזוהם מאוד עם אברונים תאיים אחרים 3. אחת המגבלות של שיטה זו היא כי נוכח שיפוע סוכרוז בצינור צנטריפוגה עלול להיקרע כךהמיטוכונדריה לי (הלם אוסמוטי). בהתאם לסוג של רקמות; ישנם כמה גורמים חשובים שיש להביא בחשבון עבור הבידוד של המיטוכונדריה שלם על ידי צנטריפוגה הפרש. הצורך הראשון הוא homogenize רקמות בצורה עדינה. רקמות רכות כגון כליות, מוח וכבד דורשות כוחות מכאניים עדינים מיושמים במהלך המגון. זאת לעומת רקמות קשות כגון שריר לב ו שלד שדורשים הרבה כוחות מכאניים חזקים. הרקמה הטחונה מטופל בדרך כלל עם proteinase לפני המגון לרכך את הרקמה. כל המאגרים המשמשים במהלך המגון צנטריפוגה צריכים להיות קר כקרח יש pH פיסיולוגי רלוונטי עם כוח יוני האוסמוטי תואם cytosol 4, 5. אחד היתרונות של לימוד bioenergetics המיטוכונדריה מבודד הוא כי ממברנות פלזמה הסלולר לא צריך להיות permeabilized עם דטרגנטים כגון digitonin או saponin 4, 6, אשר עלול לסכן את שלמות הממברנה החיצונית של המיטוכונדריה. יתרון נוסף של המיטוכונדריה המבודד הוא עדר גורמי cytosolic אחרים, אשר עלולים להפריע הניתוח של פונקציות המיטוכונדריה כגון צריכת חמצן. החסרונות של שימוש המיטוכונדריה המבודד הם הבחירה האפשרית של אוכלוסיות המיטוכונדריה מסוימות במהלך שלבי צנטריפוגה, הפגיעה במיטוכונדריה במהלך הומוגניות, ואת דרישת כמויות גבוהות של דגימות ביולוגיות על מנת לקבל תשואה טובה של המיטוכונדריה מבודד 7, 8. לאחר שהסתיים הליך הבידוד, שיעורי הנשימה של המיטוכונדריה מתחמי אני-, II- ו- IV תלויות (מדינות 2, 3 ו -4) נקבעים באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה. לנשימה מורכבת מונחה לי, גלוטמטו malate מתווספים ואחריו diphosphate אדנוזין (ADP). לנשימה שנייה מונחה מורכבת, succinate מתווסף ואחריו ADP. שכן, נשימת IV מונחה מורכב ascorbate ו tetramethylphenylendiamine (TMPD) מתווסף ואחריו 9 ADP, 10, 11, 12. המדינה 2 מתייחסת צריכת חמצן בנוכחות מצעים לבד. המדינה 3 מתייחסת צריכת חמצן בנוכחות המצעים ADP. המדינה 4 מתייחסת צריכת חמצן לאחר דלדול ADP. יחס השליטה בדרכי הנשימה (RCR) הינו מדד של צימוד של ייצור ATP צריכת החמצן, והוא מחושב כיחס בין המדינה 3 ומדינה 4 13, 15. לסיכום, אנו מתארים פרוטוקול לבודד המיטוכונדריה שרירי שלד פונקציונלי ללא פגע על ידי צנטריפוגה הפרש ולהשתמש mitochon מבודדdria ללימודים פונקציונליים bioenergetic כגון respirometry ברזולוציה גבוהה.

<table><tbody><tr><td>ADP</td><td>Sigma</td><td>A 4386</td><td></td></tr><tr><td>אנטימיצין כימי A</td><td>Sigma</td><td>A 8674</td><td>כימי, מתמוסס באתנול</td></tr><tr><td>Ascorbate</td><td>Merck</td><td>1.00127</td><td>כימי</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A 7699</td><td>כימי</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A 6003</td><td>כימי</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>fluka</td><td>3779</td><td>כימי</td></tr><tr><td>גלוטמט</td><td>סיגמא,</td> <td>G 1626</td><td>כימי</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H 7523</td><td>כימי</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04936</td><td>כימי</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>1.04873</td><td>כימי</td></tr><tr><td>K-lactobionate</td><td>Sigma</td><td>L 2398</td><td>כימי</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M 9272</td><td></td></tr><tr><td>חומצה סולפונית כימית מורפולינופרופאן (MOPS)</td><td>Merck</td><td>1.06129</td><td></td></tr><tr><td>ליבת O2k כימית: Oxygraph-2k&nbsp;</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10000-02</td><td>מכשיר רספירומטריה ברזולוציה גבוהה</td></tr><tr><td>פרוטאינאז, חיידקי</td><td>Sigma</td><td>P 8038</td><td></td></tr><tr><td>כימי נתרן אזיד</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>כימי</td></tr><tr><td>רוטנון</td><td>סיגמא</td><td>R 8875</td><td>כימי, מתמוסס באתנול</td></tr><tr><td>Succinate</td><td>Sigma</td><td>S 2378</td><td>כימי</td></tr><tr><td>Schuett הומוגן-פלוס הומוגנייזר חצי אוטומטי&nbsp;</td><td>schuett-biotec GmbH</td><td>3.201 011</td><td>הומוגנייזר רקמות</td></tr><tr><td>טאורין</td><td>סיגמא</td><td>T 8691</td><td>כימי</td></tr><tr><td>TMPD</td><td>סיגמא</td><td>T 3134</td><td>כימי</td></tr></tbody></table>

בידוד של המיטוכונדריה ללא פגע מן שרירי השלד על ידי דיפרנציאל צנטריפוגה מדידות respirometry ברזולוציה גבוהה

Isolation of Intact Mitochondria from Skeletal Muscle by Differential Centrifugation for High-resolution Respirometry Measurements

מיטוכונדריה מעורבים בחילוף החומרים של אנרגיה תאית ומשתמשים בחמצן כדי לייצר אנרגיה בצורה של אדנוזין טריפוספט (ATP). צנטריפוגה דיפרנציאלית במהירות נמוכה וגבוהה משמשת בדרך כלל לבידוד מיטוכונדריה מרקמות ותאים מתורבתים. שברים מיטוכונדריאלים גולמיים המתקבלים על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית משמשים למדידות רספירומטריה. טכניקת הצנטריפוגה הדיפרנציאלית מבוססת על הפרדת אברונים לפי גודלם ומהירות השקיעה שלהם. בידוד המיטוכונדריה מתבצע מיד לאחר קצירת הרקמות. הרקמה טובלת במדיום הומוגניזציה קר כקרח, טוחנת בעזרת מספריים והומוגניזציה בהומוגנייזר זכוכית עם עלי רופף. טכניקת הצנטריפוגה הדיפרנציאלית יעילה, מהירה וזולה והמיטוכונדריה המתקבלת על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית טהורה מספיק לבדיקות רספירומטריה. חלק מהמגבלות והחסרונות של מיטוכונדריה מבודדת, המבוססת על צנטריפוגה דיפרנציאלית, הם שהמיטוכונדריה עלולה להיפגע במהלך הליך ההומוגניזציה והבידוד וכי נדרשות כמויות גדולות של ביופסיית רקמה או תאים מתורבתים לבידוד המיטוכונדריאלי.

אני תלוי קומפלקס נשימה שיעורי נשימה שאני תלוי מורכבים המיטוכונדריה מבודד (מדינות 2, 3 ו -4) נקבעים באמצעות respirometry ברזולוציה גבוהה (איור 1, דיאגרמה נציג). מצעים שאני מורכבים מיטוכונדריאלי, גלוטמט malate, מתווספים ואחריו תוספת של ADP. המדינה 2 מתייחסת צריכת חמצן בנוכחות של המצעים לבד. המדינה 3 מתייחסת צריכת חמצ...

כאן, דגימת שריר ארבע ראשי נלקחת מחזיר מורדם והמיטוכונדריה מבודדת על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית. לאחר מכן, קצב הנשימה של מתחמי שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית I, II ו-IV נקבעים באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה.

בידוד של המיטוכונדריה ללא פגע מן שרירי השלד על ידי דיפרנציאל צנטריפוגה מדידות Respirometry ברזולוציה גבוהה

Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לבודד מיטוכונדריה משריר שלד באמצעות צנטריפוגציה דיפרנציאלית ולהגדיר את שיעורי הנשימה של קומפלקסים I, II ו-IV של שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביו-אנרגיה המיטוכונדריאלית, כגון מחלות ותסדרומים הקשורים לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה, כולל מחלות נוירולוגיות שונות, אלח דם (ספסיס) והפרעות הקשורות לגיל. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היעדרה של רוב הגורמים הציטולוגיים בדגימת המיטוכונדריה המבודדת, אשר עלולים להפריע לניתוח של תפקודי המיטוכונדריה. את ההליך תדגים סנדרה נאנסוז (Sandra Nansoz), הטכנאית מהמעבדה שלי.כדי להתחיל בהליך זה, השג כלי כימי עם דגימות של שריר שלד כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. הנח את הכלי בתוך דלי קרח. בעזרת מספריים עדינים, קצץ את השריר לחתיכות בגודל של 1 עד 2 מילימטרים.בשלב הבא, שטפו את הרקמה הקצוצה פעמיים עם בופר בידוד קר מאוד, תוך שימוש ב-20 milliliters לכל שטיפה. השעיו את הרקמה השטופה ב-10 milliliters של בופר בידוד לכל גרם רקמה, ולאחר מכן הוסיפו five milligrams protease-G לרקמה. לאחר מכן, הניחו את הכוס בתוך אמבט קרח עם מערבל מגנטי וערבבו במשך 10 דקות.לאחר מכן, דללו את התושה ב-10 מיליליטרים נוספים של באפר בידוד (isolation buffer) בתוספת 0.2% BSA מנוקה שומן לגרם רקמה. לאחר מכן, שפכו את כל באפר הבידוד מהכלי. שטפו את הרקמה פעמיים עם באפר בידוד קר מאוד בתוספת 0.2% BSA, תוך שימוש ב-20 מיליליטרים לכל שטיפה.לאחר מכן, השהוּ את הרקמה שוב ב-10 milliliters של באפר בידוד מועשר ב-BSA לכל גרם רקמה. השתמשו בהומוגניזר זכוכית חצי-אוטומטי עם פסטל בחיבור רפוי כדי להומוגנז את הרקמה. לאחר מכן, העבירו את ההומוגנאט למבחורת צנטריפוגה וצנטריפגו ב-10,000 times G למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.הספירה את הנוזל העליון בעזרת פ pipette סרולוגית. השהו מחדש את המשקע ב-10 milliliters של מצע בידוד מקורר בקרח המועשר ב-BSA לכל גרם רקמה. סבבו את התוך תרחף בצנטריפוגה ב-350 times G למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, השתמשו בפיפטה סרולוגית כדי להפריש את העל-משקע (supernatant) ולהשליך את המשקע. סננו את העל-משקע אל תוך כלי זכוכית (beaker) הנשמר על קרח, דרך שתי שכבות של גזה. העבירו את התוךלוקה המסוננת למבחנה לצנטריפוגה וסובבו ב-7,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, השליכו את העליון. השעיו שוב את משקע המיטוכונדריה הגולמי בחמישה מיליליטר של בופר בידוד מועשר ב-BSA לכל גרם רקמה. סבבו את תרחף זה ב-7,000 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.לאחר מכן, השליכו את הנוזל העליון ותלו את המשקע ב-20 milliliters של בופר שטיפה. סבבו בצנטריפוגה ב-7,000 times G למשך 10 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius. חזרו על תהליך התליה והסבב בצנטריפוגה פעם נוספת.לאחר מכן, השליכו את על-הנוזל (supernatant) והשביחו מחדש את המשקע במיליליטר אחד של בופר שטיפה. קבעו את ריכוז החלבון באמצעות כל שיטה סטנדרטית. לאחר מכן, שמרו את תרחיף המיטוכונדריה המרוכז על קרח עד לביצוע בדיקות הרספירומטריה.ראשית, השביה מחדש את תרכיז המיטוכונדריה בבופר נשימה עד לריכוז סופי של 0.4 milligrams per milliliter של חלבון מיטוכונדריאלי. לאחר מכן, שאב את מדיום הנשימה מתא האוקסיגראף המכויל לאוויר. הוסף 2.1 milliliters של תרחיף מיטוכונדריה מבודד.הכנס פקק לסגירת תא האוקסיגרף. לאחר מכן, ערבב את תרחיף המיטוכונדריה באופן רציף במהירות של 700 RPM ובטמפרטורה של 37 °C. רשום את הנשימה התאית בקו הבסיס למשך שלוש עד חמש דקות, עד להשגה של אות זרימת חמצן יציב.כדי להתחיל נשימה התלויה בקומפלקס I, הזרק 12.5 µL של malate בריכוז 0.8 M לתוך תא אוקסיגראף שהוכן עם תרחיף מיטוכונדריה מבודד, דרך פתח ההזרקה מטיטניום של הפקק. לאחר מכן, הזרק 10 µL של glutamate בריכוז 2 M. רשום את הנשימה התאית למשך שלוש עד חמש דקות, עד להשגת אות זרימת חמצן יציב.לאחר מכן, הזרק 10 µL של ADP בריכוז 0.05 M אל תוך התא דרך פתח ההזרקה. רשום את הנשימה התאית עד שסיגנל שטף החמצן יעלה, לאחר מכן יירד ויתייצב. עבור נשימה התלויה בקומפלקס II, הזרק 2 µL של rotenone בריכוז 0.2 mM אל תוך תא אוקסיגראף שהוכן עם תמיחת מיטוכונדריה מבודדת.יש להקליט את הנשימה התאית עד להשגת אות זרימת חמצן יציב. לאחר מכן, יש להזריק 20 µL של סוקסינאט בריכוז 1 M. יש להקליט את הנשימה התאית עד להשגת אות זרימת חמצן יציב.לאחר מכן, הזרק 10 µL של ADP בריכוז 0.05 M לתוך התא דרך פתח ההזרקה. רשום את הנשימה התאית עד שהאות של שטף החמצן עולה, לאחר מכן יורד ומתייצב. עבור נשימה התלויה בקומפלקס IV, הזרק 2.5 µL של ascorbate בריכוז 0.8 mM לתוך תא אוקסיגרף שהוכן עם תרחיף מיטוכונדריה מבודדות.לאחר מכן, מזריקים מיד 2.5 µL של TMPD בריכוז 0.2 M ו-10 µL של ADP בריכוז 0.05 M. יש לתעד את הנשימה התאית עד להשגה של אות זרימת חמצן יציב. לאחר מכן, מזריקים 10 µL של סודיום אזיד בריכוז 1 M.הקליטו את הנשימה התאית עד שסיגנל שטף החמצן יירד ולאחר מכן יתייצב. במחקר זה, מבודדים מיטוכונדריה שלמות משריר שלד. לאחר מכן, נמדדים קצבי נשימה התלויים בקומפלקס I באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה.כפי שניתן לראות, קצב הנשימה המיטוכונדריאלית עולה מיד עם הוספת ADP. קצב הנשימה יורד לאחר התכלות ה-ADP לרמות הדומות לאלו שנצפו לפני הוספת ה-ADP. דבר זה מעיד על כך שהיחס בין מצב 3 למצב 4, המכונה יחס הבקרה הנשימתי (respiratory control ratio), או RCR, הוא גבוה, וכי השלמות המיטוכונדריאלית נשמרה היטב במהלך הליך הבידוד.שיעורי הנשימה התלויים בקומפלקס II נמדדים לאחר מכן על ידי עיכוב הנשימה התלויה בקומפלקס I באמצעות rotenone והזרקת succinate, המשמש כסובסטרט לקומפלקס II. לאחר מכן מוסיפים ADP, מה שגורם לעלייה מיידית בקצב הנשימה. עם התכלות ה-ADP, קצב הנשימה יורד לרמות הדומות לאלה שנצפו לפני הוספת ה-ADP, דבר המעיד על RCR גבוה, ובכך על כך שהשלמות המיטוכונדריאלית נשמרה היטב במהלך הבידוד.שיעורי נשימה התלויים במערכת IV נצפים על ידי הוספת ascorbate, TMPD ו-ADP. לאחר מכן מתווסף Sodium azide כדי לעכב את מערכת IV. ההבדל בצריכת החמצן לפני ואחרי הוספת ה-sodium azide מפורש כנשימה הממשי של מערכת IV. שיעור הנשימה הגבוה התלוי במערכת IV שנצפה במצב 3 מעיד על כך ששלמות המיטוכונדריה נשמרה היטב במהלך הליך הבידוד.ברגע שהטכניקה נלמדת היטב, ניתן לבצעה בפחות משעה וחצי אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לבצע כיול של חיישני החמצן מראש, לפני ההומוגניזציה. לאחר פרוצדורה זו, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון מדידות של תכולת ADP תאית, פוטנציאל ממבנה המיטוכונדריה, פעילות אנזימטית של ATP synthase ורמות סובסטרט, כדי לענות על שאלות נוספות, כגון האם שינויים בשיעורי הנשימה נובעים ממחסור בסובסטרט מיטוכונדריאלי, מפוטנציאל הממברנה או מפעילות אנזימטית מופחתת של ATP synthase.לאחר צפייה בסרטון זה, תגיעו להבנה טובה של השלב של בידוד מיטוכונדריה משריר שלד באמצעות סנטריפוגציה דיפרנציאלית, וכיצד למדוד שיעורי נשימה של קומפלקסים מיטוכונדריאליים I, II ו-IV באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה. לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום מטבוליזת האנרגיה המיטוכונדריאלית לחקור את תפקודי האנרגיה של מיטוכונדריה בתחומים כגון מחלות מיטוכונדריאליות גנטיות, מיופתיות ופגיעות רפרופוזיה לאחר איסכמיה במיטוכונדריה מבודדת. זכרו כי עבודה עם antimycin A, rotenone, sodium azide ו-FCCP עלולה להיות מסוכנת ביותר.ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון חבישת כפפות ולבישת חלוקי מעבדה, בעת ביצוע הליך זה.

isolation-intact-mitochondria-from-skeletal-muscle-differential

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול זה מתאר הליך ללמוד את הנשמה של המיטוכונדריה מבודד שרירי השלד. שיטה זו הותאמה מ...

בידוד מיטוכונדריאלי של שריר השלד

שיטה לבידוד מהיר של המיטוכונדריה מביופסיות רקמות יונקים מתוארת. כבד חולדה או תכשירי שרירי שלד היה הומוגני עם Dissociator רקמה מסחרי ומיטוכונדריה היו מבודדת על ידי סינון ההפרש דרך מסנני רשת ניילון. זמן בידוד מיטוכונדריאלי הוא &lt;30 דקות בהשוואה ל60-100 דקות תוך שימוש בשיטות אלטרנטיביות.

בידוד מהיר וטיהור של מיטוכונדריה להשתלה על ידי דיסוציאציה רקמות ודיפרנציאל סינון

שיטות לביופסיה של lateralis vastus, הכנת המיטוכונדריה מטוהרת, ופרופיל respirometric מתוארות. השימוש בשרירים קטן נפח עושה בטכניקה זו מתאימה ליישומי מחקר קליניים.

ההכנה וRespirometric הערכה של המיטוכונדריה מבודדת מרקמת שריר שלד מתקבלת על ידי Percutaneous מחט ביופסיה

כאן, אנו מציגים שינוי של שיטה שדווחה בעבר המאפשרת בידוד של מיטוכונדריה איכותית ומטוהרת מכמויות קטנות יותר של שרירי שלד עכבר. הליך זה מביא למיטוכונדריה בצימוד גבוה שנושמים בתפקוד גבוה במהלך מבחני רספירומטירק מבוססי מיקרופלייט.

בידוד של המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות תפוקה גבוהה microplate נשימה

המיטוכונדריה הם אברונים מטבוליים מרכזיים המציגים רמה גבוהה של פלסטיות פנוטיפית בשריר השלד. ייבוא חלבונים מן הציטוסול הוא מסלול קריטי עבור biogenesis אברון, חיוני להרחבת הרשתית ותחזוקה של תפקוד מיטוכונדריאלי.  לכן, יבוא חלבון משמש ברומטר של בריאות התא.

מדידה של קיבולת ייבוא חלבון של המיטוכונדריה שריר השלד

כאן, אנו מתארים שיטה מפורטת לבידוד המיטוכונדריה משריר השלד של העכבר ואת הניתוח הבא של נשימה על ידי שיעור צריכת חמצן (OCR) באמצעות בדיקות respirometric מבוססות מיקרופלט. צינור זה יכול להיות מיושם כדי לחקור את ההשפעות של התערבויות סביבתיות או גנטיות מרובות על חילוף החומרים המיטוכונדריאלי.

בידוד המיטוכונדריה משריר שלד העכבר לבדיקות ספירומטריות

לסוסים יש יכולת פעילות אירובית יוצאת דופן, מה שהופך את שרירי השלד של הסוסים לרקמה חשובה הן לחקר הפיזיולוגיה של פעילות גופנית של סוסים והן לפיזיולוגיה של המיטוכונדריה של יונקים. מאמר זה מתאר טכניקות להערכה מקיפה של תפקוד המיטוכונדריה בשרירי השלד של סוסים.

פלואורו-רספירומטריה ברזולוציה גבוהה של שרירי השלד של סוסים

מחקרים ביואנרגטיים ומטבוליים על מיטוכונדריה חשפו את תפקידם הרב-גוני במחלות רבות, אך שיטות הבידוד של אברונים אלה משתנות. השיטה המפורטת כאן מסוגלת לטהר מיטוכונדריה באיכות גבוהה ממקורות רקמה מרובים. האיכות נקבעת על ידי יחסי בקרת נשימה ומדדים אחרים המוערכים עם רספירומטריה ברזולוציה גבוהה.

בידוד מיטוכונדריאלי חזק מרקמת לב מכרסם 

מיקרו גזור טכניקה explants היא שיטה חזקה ואמינה לבידוד שגשוג התאים שריר השלד מן, השרירים נוער למבוגרים או עובריים כמקור לתאי גזע שרירי השלד. באופן ייחודי, התאים האלה כבר נגזר clonally לייצר גזע שריר השלד שורות תאים המשמשים in vivo השתלה.

למבוגרים עובריים שרירי השלד Microexplant התרבות בידוד בתאי גזע שרירי השלד

שתואר כאן היא שיטה למדידה ישירה ניצוצות סידן, היחידות יסודי של Ca 2 + שחרור מreticulum sarcoplasmic בסיבי שריר שלד בשלמותה. בשיטה זו משתמשת האוסמוטי-תיווך מתח מפעילה של Ca 2 + שחרור מקולט ryanodine בסיבי שריר מבודדים. יכולים להיות מועסק הדינמיקה ויכולת homeostatic של Ca 2 + איתות תאית כדי להעריך את תפקוד שרירים בבריאות ובחוליים.

הערכה של סידן ניצוצות בסיבי שריר שלד שלמים

למדו לבודד מיטוכונדריה משלד על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית ולמדוד קצבי נשימה של מורכבים I, II ו-IV ברזולוציה גבוהה. שיטה זו מסייעת בחקר מחלות נוירולוגיות וזיקנת.

בידוד של המיטוכונדריה ללא פגע מן שרירי השלד על ידי דיפרנציאל צנטריפוגה מדידות Respirometry ברזולוציה גבוהה

גלה סרטונים נוספים