Calorimetry סריקה דיפרנציאל - שיטה להערכת יציבות תרמית ומבנה של Antigen חלבון

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את היציבות התרמית והקונפורמציה המבנית של חלבונים בסביבה תעשייתית באמצעות קלורימטריית סריקה דיפרנציאלית. קלורימטריית סריקה דיפרנציאלית מודדת את קיבולת החום המולרי של דגימות כפונקציה של טמפרטורה ושימשה בהצלחה להערכת היציבות התרמית והקונפורמציה המבנית של חלבונים. הליך פשוט יחסית זה אינו תלוי בסליל מבני או בפלואורופורים פנימיים כפי שקורה בשיטות ביופיזיקליות אחרות.

יתרון נוסף של טכניקה זו הוא שהיא מודדת ישירות את טמפרטורת המעבר התרמי ואת האנרגיה הנדרשת כדי לשבש את האינטראקציה המייצבת את המבנה השלישוני של חלבונים. כאשר משתמשים בה בשילוב עם ההתלהבות של התפתחות, טמפרטורת המעבר התרמי יכולה לשמש כפרמטר שימושי לניטור עקביות של תהליכי ייצור עבור תרופות ביולוגיות. הדגמה חזותית של שיטה זו יכולה לשמש כמדיום אינטראקטיבי כדי לסייע ביעילות למשתמשים החדשים בשלבים קריטיים.

כדי להתחיל, הפעל את קלורימטר הסריקה הדיפרנציאלי. ואז ספק חנקן למערכת. זה יגביר את הלחץ בתאים כדי לדכא את הרתיחה של הדגימות וכן למנוע היווצרות בועות בטמפרטורות גבוהות.

בהתאם לחומר המרכיב את התא, התאם את לחץ אספקת גז החנקן בהתאם ללחץ המומלץ של היצרן כדי למנוע נזק לתא. ודא שכל מאגרי חומרי הניקוי מלאים בנפח הנדרש. חומרי ניקוי נדרשים כוללים חומר ניקוי לשטיפת התא ומים לניקוי התא לאחר כל הפעלת דגימה.

הגדר את הטמפרטורה של תא החזקת הדגימה לערך מתאים, רצוי חמש מעלות צלזיוס כדי לשמור על שלמות הדגימה לפני הניסוי. חשוב לאזן את הדגימה מול המאגר כדי להבטיח שההבדל היחיד בין התמיסות הוא החלבון. לכן, ניתן לייחס נכון את ההבדל שנצפה בקיבולת החום לחלבון.

קבע את ריכוז דגימת החלבון באמצעות שיטת קביעת ריכוז חלבון מתאימה כגון שיטת Lowry. עבור המכשיר המשמש בפרוטוקול זה, טווח העבודה העדיף הוא 0.5 עד מיליגרם אחד של חלבון למיליליטר. דיאליזה של הדגימה כנגד המאגר שישמש כהתייחסות לניסוי.

הסר את הדגימה ואת מאגר הייחוס בוואקום כדי להיפטר מבועות מיקרו שעלולות לגרום לאי דיוק בנפח. עבודה בארון הכלה ביולוגית של זרימה למינרית, השתמש במיקרופיפטה ובקצות סטריליות כדי לטעון את הדגימות במאגר שלהן בזוגות לתוך 96 לוחות באר. מלא את שני זוגות הבארות הראשונים במאגר כדי לבצע סריקות מאגר כדי לוודא את התאמת המכשיר לפני מדידת הדגימה.

מלאו את שני זוגות הבארות האחרונים במים לסריקת המים כדי לנקות את התאים. לאחר מכן מכסים את צלחת 96 הבאר בסרט איטום. ודא שהבארות אטומות כראוי לפני הוצאת הצלחת מארון הבטיחות הביולוגית כדי למנוע זיהום דגימה.

לבסוף, הנח את הצלחת בתא החזקת הדגימה בכיוון הנכון. באמצעות תוכנת הרכישה, הזן את המידע לדוגמה לפי סדר טעינת הצלחת. הזן ריכוזי חלבון אם זמינים.

אחרת, הזן את הריכוז בתוכנת הניתוח לפני ניתוח הנתונים. בחר באפשרות המבטיחה ניקוי התא עם חומר ניקוי לפני כל סריקת דגימה. לאחר הניקוי יש לבצע מספר שלבי שטיפה במים כדי להבטיח שלא יישארו שאריות חומר ניקוי בתאים.

הגדר את טמפרטורת ההתחלה של הניסוי ל-20 מעלות צלזיוס, שיכולה להשתנות בהתאם לדגימה. עבור חלבונים ידועים, ניתן להשתמש בטמפרטורת התחלה קבועה מראש בעוד שניתן להחיל טמפרטורת התחלה נמוכה יותר עבור דגימות לא ידועות. לאחר מכן הגדר את הטמפרטורה הסופית של הניסוי.

הטמפרטורה הסופית עשויה להשתנות גם בהתאם לידע מוקדם של המדגם. לאחר מכן, הגדר את קצב הסריקה של הניסוי. רצוי לסרוק דגימות לא ידועות בקצבי סריקה שונים כדי להעריך את הקינטיקה של ההתפתחות.

הגדר את תוכנת הרכישה כדי לסרוק מחדש את הדגימות כדי לבחון את הפיכות המעבר התרמי. התפתחות חלבון נחשבת הפיכה אם האנתלפיה המתקבלת עבור הסריקה השנייה היא לפחות 80% מערך האנתלפיה מהסריקה הראשונה. הגדר את התרמוסטט שלאחר הניסוי ל-10 מעלות צלזיוס כדי לשמור על שלמות תא הקלורימטר.

ודא שפרמטרי הגדרת הניסוי נכונים לפני ביצוע הניסוי. אם הכל במקום, התחל את הניסוי. לאחר הניסוי, בצע ניתוח נתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.

לצורך הניתוח, חיסור הבסיס מתבצע באופן ידני. עקביות בשלב זה היא חיונית להשגת תוצאות דומות. מוצג כאן נתונים גולמיים מייצגים של ריצת ניסוי כולל סריקות המאגר והמים.

הדגימות המנותחות הן רעלים במצבם המקורי ונטול הרעלים. סריקות הדגימה מעובדות בנפרד כדי לגזור את טמפרטורת ההיתוך וערכי האנתלפיה עבור כל דגימה. עבור המדינה הילידית, טמפרטורת ההיתוך היא 55.55 מעלות צלזיוס והאנטלפיה של הרעלן היא 3.157 כפול 10 עד חמישית קלוריות למול.

לעומת זאת, טמפרטורת ההיתוך של הרעלן במצבו הנקי היא 81.21 מעלות צלזיוס והאנטלפיה היא 3.656 כפול 10 עד חמישית קלוריות למול. שכבת העל של הנתונים המעובדים של הרעלן במצבו המקורי ונטול הרעלים מדגימה כי הדגימה המנוקה יציבה יותר מבחינה תרמית מאשר מצבה המקורי על פי ערכי טמפרטורת ההיתוך. זה גם מצביע על כך שתהליך ניקוי הרעלים מציג שינויים מבניים במבנה השלישוני של הרעלן.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לספק אספקה נאותה של חומר ניקוי ומים כדי למנוע זיהום צולב של התא והמזרק שכן צלילותם חיונית לתוצאות מדויקות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לך הבנה טובה של קלורימטריית הסריקה הדיפרנציאלית כשיטה להערכת היציבות התרמית והקונפורמציה של חלבונים. תוכל גם לבצע ניכויים משמעותיים מהריצות התרמיות המתקבלות.

בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו דיכרואיזם מעגלי על מנת לענות על שאלות נוספות הנוגעות לשינויים במבנים המשניים במהלך ההתפתחות. נתונים שנאספו עבור מערך של הרבה מאותו מוצר שימשו ליצירת קווי בסיס אמפיריים לבחינת ההשפעה של שינויים בתהליכים, ניסוח ותנאי אחסון על מבנה האנטיגנים של חלבונים לייצור חיסונים.