Name: Calorimetry סריקה דיפרנציאל - שיטה להערכת יציבות תרמית ומבנה של Antigen חלבון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: למד כיצד להעריך יציבות תרמית ומבנה של חלבונים באמצעות קלורימטריה סריקה דיפרנציאלית. שיטה זו מודדת טמפרטורת מעבר תרמי ואנרגיית דנטורציה לפיתוח חיסונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

הכותבים הם מאוד אסיר תודה ליוסף מנצ&#39;יני (לשעבר עם GE Healthcare), פאבל Czudec, תומאס קייג (מוגבל Malvern מכשירים) עבור תפקידם ההתקנה וההדרכה על קלורימטר סריקת הפרש, Sasmit Deshmukh וובסטר Magcalas לדיונים שלהם.

1. כלי Start-up <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את קלורימטר הסריקה דיפרנציאלי להגביר את הלחץ בתאים לדכא רתיחה של הדגימות וכן למנוע היווצרות בועות בטמפרטורות גבוהות. זו מושגת בדרך כלל על ידי אספקת חנקן לתוך המערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם החומר המהווים של התא (למשל, טנטלום, זהב, פלטינה, וכו &#39;), לכוון את הלחץ של אספקת גז חנקן על פי הלחץ המומלץ על ידי היצרן כדי למנוע נזק לתא. לדוגמה, להגדיר את הלחץ של אספקת גז חנקן עד 45 psi עבור המכשיר בשימוש לפתח הליך זה, ואת הלחץ מעל 80 psi עלולה לגרום נזק לתא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי כל מאגרי חומר ניקוי מלאים עד הנפח הנדרש. חומרי ניקוי נדרשו לכלול חומרי ניקוי ומים לשטוף ולנקות את התא בהתאמה אחרי כל סיבוב מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הטמפרטורה של התא מחזיק מדגםלערך מתאים, רצוי 5 מעלות צלזיוס, כדי לשמור על שלמות המדגם לפני להתנסות. </li></ol> לדוגמא כנה 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dialyze מדגם נגד החיץ אשר ישמש כנקודת ההתייחסות לצורך הניסוי. לחלופין, חיץ elution שנאספו על השלב האחרון של טיהור חלבונים (elution טור כלומר) ניתן להשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הריכוז של מדגם החלבון בשיטת קביעת ריכוז החלבון המתאימה ביותר כגון שיטת Kjedahl 33 או לורי שיטה 34. לשם השוואה אובייקטיבית של תוצאות, השתמש באותה השיטה בעקביות באותו המחקר. טווח הריכוז הנדרש עשוי להשתנות בהתאם לדגם של המכשיר. עבור המכשיר בשימוש בפרוטוקול זה, טווח עבודה עדיפה הוא 0.5 - 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגה למאגר מדגם ועיון בריק להיפטר microbubbles שיכולים לגרום נפח inaccurACY. שלב זה ניתן לדלג על מודלים קלורימטר חדשים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש micropipette וטיפים סטרילי בתוך ארון biocontainment זרימה למינרית, טען את דגימות למאגר שלהם בזוגות לתוך 96 צלחות גם תואם עם המכשיר. מלא את שני הזוגות הראשונים של בארות עם חיץ ושני הזוגות האחרונים עם מים למאגר החיץ וסריקת המים בהתאמה. סריקות-חיץ חיץ לאמת את התאמתו של המכשיר לפני לדגום מדידה (הערכה כלומר טעות מכשור) וכן להקים בסיס; בעוד סריקות מים מנוהלות לנקות את התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את צלחת 96-היטב עם סרט אטים, ולהבטיח כי הבארות נסגרות כמו שצריך לפני שלקחת את הצלחת מתוך קבינט הבטיחות הביולוגי כדי למנוע זיהום מדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הצלחת בתא מחזיק המדגם בכיוון הנכון. </li></ol> 3. הגדרת פרמטר הניסיון הערה: בהתאם instrumentation, ניתן לטעון דגימות לתוך התא באופן ידני או באמצעות מזרק, או באופן אוטומטי באמצעות autosampler. במקרה זה (כלומר הגדרה תעשייתית), גידול autosampler משמש כדי לחסוך זמן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות תוכנת הרכישה, הזן את המידע המדגם לפי סדר הצלחת הועמסה כאמור בסעיף 2.4. זן ריכוזים אם זמין, אחרת, זן ערכי ריכוז לתוך תוכנת ניתוח לפני ניתוח נתונים (סעיף 4.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות המבטיח ניקוי של תאים עם חומר ניקוי לפני כל סריקה מדגם, אשר צריכה להיות מלווה בצעדים לשטוף במים מרובים כדי להבטיח שאין שאריות דטרגנט נותר בתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הטמפרטורה ההתחלתית של הניסוי ל -20 מעלות צלזיוס, אבל זה יכול להשתנות בהתאם לידע הקודם של המדגם. עבור חלבונים ידועים, טמפרטורת התחלה שנקבעה מראש ניתן להשתמש, בעוד טמפרטורת התחלה נמוכה יכולה להיות מיושמת על דגימות ידועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הטמפרטורה הסופיתהניסוי, למשל 100 ° C. הטמפרטורה הסופית עשויה להשתנות בהתאם על ידע קודם של המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את קצב הסריקה של הניסוי, למשל 60 ° C / שעה, המהווה את קצב הסריקה הטיפוסי. עם זאת, קצב סריקה עשוי להשתנות תלוי בידע מוקדם של המדגם, למשל 90 ° C / שעה, או 120 ° C / שעה. מומלץ לסרוק דגימות ידועות בשיעורי סריקה שונים כדי להעריך את קינטיקה של התגלגלות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות סריקה חוזרות לחקור את ההפיכות של תרמית התגלגלות. השתלשלות חלבון נחשבת הפיכה אם אנתלפיה שהתקבל עבור הסריקה השנייה הוא לפחות 80% מהשווי האנתלפיה עבור הסריקה הראשונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבעו את טרמוסטט שלאחר הניסוי עד 10 מעלות צלזיוס כדי לשמור על שלמות התאים של קלורימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי פרמטרי הגדרת הניסוי נכונים לפני ביצוע הניסוי. אם הכל במקום, להתחיל בניסוי. </li></ol> 4. נתוניםalysis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחזור נתונים גולמיים מהניסוי ובחר מדגם אחד בכל פעם לניתוח. סריקת התייחסות לחסר, חיץ כלומר, מן הסריקה המדגמת. הערה: חיסור הפניה מתבצע באופן אוטומטי על ידי דגמים חדשים של מכשירי DSC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זן ערך ריכוז מדגם אם זה הושמט כאמור בסעיף 3.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם ולחסר הבסיס מן thermogram רכשה לתת דין וחשבון על הבדלים ביכולות החום של מדינות שקופל ונפתח של חלבון אשר נגרמת על ידי חשיפה של קבוצות הידרופובי למים על התגלגלות. לינארי או הולם עקום מעוקב ניתן ליישם בהתאם לצורה של פרופיל DSC למדגם. לקבלת עקביות, אותו סוג של התאמה צריך לשמש במהלך מחקר, מחקר יציבות בזמן אמת למשל. צעד זה נדרש כדי לעבד את העקומה לשילוב השיא להשיג אנתלפיה של מעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע אינטגרציה שיא באמצעות שאינו ליניארי לפחות בכושר מרובע. בהתבסס על המוצריידע ליישם שתי מדינות לשני עמים או מודל הלא שתי מדינות לשני עמים. שתי מדינות לשני עמי מודל יכול לשמש עבור מעברים תרמיים שיתופיים אחת, ועבור חלבונים לא-מוכרים, להחיל מודל מדינה ללא ושתיים עד ידע מוצר נוסף זמין. במידת צורך, להתאים עקומה הולמת באמצעות הפונקציה ההולמת העקומה איטרטיבי של של התוכנה והציוד עד שיגיעו השווי צ&#39;י המרובע נשאר קבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התוצאות שהתקבלו יציג את הערכים עבור נקודת האמצע של טמפרטורות המעבר (TM), אנתלפיה קלוריות (ΔH), ו אנתלפיה van&#39;t הוף (ΔH VH) של המדגם. </li></ol>

<ol><li>Gill, P., Moghadam, T. T., Ranjbar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+calorimetry+techniques%3A+applications+in+biology+and+nanoscience%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Tech%22%5BJournal%5D)">Differential scanning calorimetry techniques: applications in biology and nanoscience.</a> J. Biomol. Tech. 21 (4), 167-193 (2010).</li>
<li>Perkin Elmer Corp. Differential microcalorimeter. Patent. , US3263484A 02 August (1966).</li>
<li>O'Neill, M. J. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/231200637_The_Analysis_of_a_Temperature-Controlled_Scanning_Calorimeter">The Analysis of a Temperature-Controlled Scanning Calorimeter.</a> Anal. Chem. 36 (7), 1238-1245 (1964).</li>
<li>O'Neil, M. J. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac60242a011">Measurement of Specific Heat Functions by Differential Scanning Calorimetry.</a> Anal. Chem. 38 (10), 1331-1336 (1966).</li>
<li>Privalov, P. L., Monaselidze, D. R. Mol. Biol. 6, (in Russian) 7-33 (1975).</li>
<li>Privalov, P. L., Plotnikov, V. V. Adiabatic differential microcalorimeter. Адиабатический дифференциальный микрокалориметр. , Authorship certificate No 328776 (USSR), applied 1970 (1970).</li>
<li>Andronikashvili, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorimetric+study+of+the+nature+of+the+intramolecular+fusion+of+collagen%2C+isolated+from+transplantable+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Dokl.+Akad.+Nauk%22%5BJournal%5D)">Calorimetric study of the nature of the intramolecular fusion of collagen, isolated from transplantable tumor.</a> Dokl. Akad. Nauk. 183 (1), (In Russian) 212-214 (1968).</li>
<li>Andronikashvili, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndronikashvili%2C+EL+%22Conformational+Changes+of+Biopolymers+in+Solution%22">Conformational Changes of Biopolymers in Solution</a>. , Nauka Publishing House. Moscow. (In Russian) 171-173 (1973).</li>
<li>Andronikashvili, E. L. <a target="_blank" href="http://europepmc.org/abstract/med/3318939">Malignant transformation and changes in various physic-chemical properties of macromolecules and supramolecular structures.</a> Biofizika. 32 (5), (In Russian) 782-799 (1987).</li>
<li>Velicelebi, G., Sturtevant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+of+the+denaturation+of+lysozyme+in+alcohol-water+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics of the denaturation of lysozyme in alcohol-water mixtures.</a> Biochemistry. 18 (7), 1180-1186 (1979).</li>
<li>Sturtevant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+capacity+and+entropy+changes+in+processes+involving+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Heat capacity and entropy changes in processes involving proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 74 (6), 2236-2240 (1977).</li>
<li>Sturtevant, J. M. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.pc.38.100187.002335">Biochemical applications of differential scanning calorimetry.</a> Annu. Rev. of Phys. Chem. 38, 463-488 (1987).</li>
<li>Jackson, W. M., Brandts, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamics+of+protein+denaturation.+A+calorimetric+study+of+the+reversible+denaturation+of+chymotrypsinogen+and+conclusions+regarding+the+accuracy+of+the+two-state+approximation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Thermodynamics of protein denaturation. A calorimetric study of the reversible denaturation of chymotrypsinogen and conclusions regarding the accuracy of the two-state approximation.</a> Biochem. 9 (11), 2294-2301 (1970).</li>
<li>Privalov, P. L., Khechinashvili, N. N., Atanasov, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+analysis+of+thermal+transitions+in+globular+proteins.+I.+Calorimetric+study+of+chymotrypsinogen%2C+ribonuclease+and+myoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic analysis of thermal transitions in globular proteins. I. Calorimetric study of chymotrypsinogen, ribonuclease and myoglobin.</a> Biopolymers. 10 (10), 1865-1890 (1971).</li>
<li>Privalov, P. L., Khechinashvili, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+thermodynamic+approach+to+the+problem+of+stabilization+of+globular+protein+structure%3A+a+calorimetric+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A thermodynamic approach to the problem of stabilization of globular protein structure: a calorimetric study.</a> J. Mol. Biol. 86 (3), 665-684 (1974).</li>
<li>Privalov, P. L., Potekhin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+microcalorimetry+in+studying+temperature-induced+changes+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins.</a> Methods Enzymol. 131, 4-51 (1986).</li>
<li>Veprintseva, O. D., Emelyanenko, V. I., Konstantinova, V. V., Shnyrov, V. L. The importance of structural changes in bacteriophage T4 tail proteins. Biofizika. 33, (In Russian) 954-961 (1988).</li>
<li>Shutilova, N., Semenova, G., Klimov, V., Shnyrov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-induced+functional+and+structural+transformations+of+the+photosystem+II+oxygen-evolving+complex+in+spinach+subchloroplast+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Mol.+Biol.+Int%22%5BJournal%5D)">Temperature-induced functional and structural transformations of the photosystem II oxygen-evolving complex in spinach subchloroplast preparations.</a> Biochem. Mol. Biol. Int. 35 (6), 1233-1243 (1995).</li>
<li>Sanina, N. M., Kostetsky, E. Y. a, Shnyrov, V. L. Calorimetric investigation of phosphatidyl choline from membranes of marine invertebrates. J. Evol. Biokhim. Physiol. 23, 451-460 (1987).</li>
<li>Oreshkin, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+the+muscle+proteins+of+cured+beef+during+heating%5BTitle%5D)+AND+%22Meat+Science%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in the muscle proteins of cured beef during heating.</a> Meat Science. 16 (4), 297-305 (1986).</li>
<li>Kirkitadze, M., Hu, J., Tang, M., Carpick, B. <a target="_blank" href="http://www.future-science.com/doi/abs/10.4155/pbp.14.27">Qualification of a differential scanning calorimetry method for biophysical characterization of monoclonal antibodies and protein vaccine antigens.</a> Pharm. Bioprocess. 2 (6), 491-498 (2014).</li>
<li>Jiskoot, W., Daan, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJiskoot%2C+W+%22Methods+for+structural+analysis+of+protein+pharmaceuticals%22">Methods for structural analysis of protein pharmaceuticals</a>. 3, Springer Science & Business Media. (2005).</li>
<li>Plotnikov, V. V., Brandts, M., Lin, L. N., Brandts, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+ultrasensitive+scanning+calorimeter%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A new ultrasensitive scanning calorimeter.</a> Anal. Biochem. 250 (2), 237-244 (1997).</li>
<li>Plotnikov, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autosampling+differential+scanning+calorimeter+instrument+for+studying+molecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions.</a> Assay Drug Dev. Technol. 1 (1), 83-90 (2002).</li>
<li>Freire, E. Differential scanning calorimetry. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/book/10.1385%2F0896033015">Protein Stability and Folding: Theory and Practice. Method in Molecular Biology</a>. 40, 191-218 (1995).</li>
<li>Freire, E., van Osdol, W. W., Mayorga, O. L., Sanchez-Ruiz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorimetrically+determined+dynamics+of+complex+unfolding+transitions+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biophys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Calorimetrically determined dynamics of complex unfolding transitions in proteins.</a> Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 19, 159-188 (1990).</li>
<li>Johnson, C. R., Morin, P. E., Arrowsmith, C. H., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodynamic+analysis+of+the+structural+stability+of+the+tetrameric+oligomerization+domain+of+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thermodynamic analysis of the structural stability of the tetrameric oligomerization domain of p53 tumor suppressor.</a> Biochemistry. 34 (16), 5309-5316 (1995).</li>
<li>Kasimova, M. R., Sam, J. M., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+conformational+equilibrium+of+human+growth+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The conformational equilibrium of human growth hormone.</a> J. Mol. Biol. 277 (2), 409-418 (1998).</li>
<li>Saboury, A. A., Moosavi-Movahedi, A. A. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1016/0307-4412(94)90013-2/full">Clarification of calorimetric and van't hoff enthalpies for evaluation of protein transition states.</a> Biochem Edu. 22 (4), 210-211 (1994).</li>
<li>Privalov, P. L. Microcalorimetry of proteins and their complexes. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9781588299543">Protein Structure, Stability, and Interactions. Method in Molecular Biology</a>. 490, 1-39 (2009).</li>
<li>Dehghan-Nayeri, N., Rezaei-Tavirani, M. <a target="_blank" href="http://www.ijapbs.com/admin/php/uploads/156_pdf.pdf">The Interpretation of Protein Structure Through Relationship of Melting Point (Tm) and Enthalpy of Unfolding (ΔHU).</a> Int J Anal Pharma Biomed Sci. 4 (1), 47-50 (2015).</li>
<li>Stability testing of new drug substances and products. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guideline%2C+ICH+Harmonised+Tripartite%22">Guideline, ICH Harmonised Tripartite</a>. 1 (2), current step. 4 (2003).</li>
<li>Kjeldahl, J. Neue Methode zur Bestimmung des Stickstoffs in organischen Körpern (New method for the determination of nitrogen in organic substances). Zeitschrift für analytische Chemie. 22 (1), 366-383 (1883).</li>
<li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14907713">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J. Biol. Chem. 193 (1), 265-275 (1951).</li>
<li>HÖhne, G., Hemminger, W., Flammersheim, H. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aH%C3%96hne%2C+G+%22Differential+Scanning+Calorimetry%22">Differential Scanning Calorimetry</a>. , Springer Science & Business Media. (2003).</li>
<li>Porter, L. L., George, D. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22635268">A thermodynamic definition of protein domains.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109 (24), 9420-9425 (2012).</li>
<li>Frokjaer, S., Daniel, E. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+drug+stability%3A+a+formulation+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Protein drug stability: a formulation challenge.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 4, 298-306 (2005).</li>
<li>Johnson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+calorimetry+as+a+tool+for+protein+folding+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability.</a> Arch. Biochem. Biophys. 531, 100-109 (2013).</li>
<li>Chiu, M. H., Elmar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+calorimetry%3A+an+invaluable+tool+for+a+detailed+thermodynamic+characterization+of+macromolecules+and+their+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Bioallied+Sci%22%5BJournal%5D)">Differential scanning calorimetry: an invaluable tool for a detailed thermodynamic characterization of macromolecules and their interactions.</a> J. Pharm. Bioallied Sci. 3 (1), 39-59 (2011).</li>
<li>Hirst, J. D., Charles, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicity%2C+circular+dichroism+and+molecular+dynamics+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Helicity, circular dichroism and molecular dynamics of proteins.</a> J. Mol. Biol. 243 (2), 173-178 (1994).</li>
<li>Kirkitadze, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+modules+of+the+vaccinia+virus+complement+control+protein+are+not+in+extensive+contact%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Central modules of the vaccinia virus complement control protein are not in extensive contact.</a> Biochem. J. 344 (1), 167-175 (1999).</li>
<li>Freire, E., SchÖn, A., Hutchins, B. M., Brown, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+denaturation+as+a+tool+in+the+formulation+optimization+of+biologics%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+disc+today%22%5BJournal%5D)">Chemical denaturation as a tool in the formulation optimization of biologics.</a> Drug disc today. 18 (19), 1007-1013 (2013).</li>
<li>Wen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+differential+scanning+calorimetry+for+thermal+stability+analysis+of+proteins%3A+qualification+of+DSC%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">Applications of differential scanning calorimetry for thermal stability analysis of proteins: qualification of DSC.</a> J. Pharm. Sci. 101 (3), 955-964 (2012).</li>
</ol>

כל הכותבים הם עובדים ב סאנופי פסטר. העבודה מומנה על ידי סנופי פסטר, ודמי פרסום מאמר וידאו זה שולמו על ידי סאנופי פסטר. יש המחברים שום נטיות רלוונטיות או מעורבות פיננסית עם כל ארגון או גוף שיש לו סכסוך כספי עם הנושא או חומרים דנו בכתב היד. אלה כוללים תעסוקה, חברות ייעוץ, בעלות מניות או אופציות, או תמלוגים. אין סיוע בכתב נוצל בייצור של כתב היד הזה.

הליך זה כבר שולב בהצלחת חבילות בדיקת אפיון שונות, כוללים מחקרי יציבות השוואת מוצר 21. במחקרי יציבות בזמן אמת, DSC משמש כדי לפקח T מ, כמו גם להעריך את F א הביולוגי לאורך זמן כדי לקבוע את חיי המדף שלהם. באשר השוואת מוצר, הוא משמש כדי להעריך את ההשפעה של תהליך ושינוי מתקן וכן השפעת צעדי ייצור מפתח על קונפורמציה המבני של המון מיוצר. זה בדרך כלל כולל ההשוואה הישירה של ΔH של הרבה מיוצר למוצר הפנית כאזור המוצר האידיאלי. בנוסף, DSC הוכיחה להיות כלי אנליטי שימושי ללימודי ניסוח מוצר 37. ה- T מ &#39;של חלבון מאגרים שונים בריכוזים שונים שניתן להשתמש בהם כדי לקבוע את הניסוח כי ומציע את היציבות ביותרהחלבון. כדי להבטיח את האמינות של השיטה הזאת ואת האובייקטיביות של תוצאותיה, חשוב לשמור פרמטרי בדיקה עקביים מהריצה לרוץ בתוך אותו המחקר (למשל, מחקר ניסוח חיסון). עם זאת, ההליך יכול להיות שונה כדי להכיל הבדלים בתכונות הפיזיות של חלבונים שונים. דוגמא שינוי שניתן לעשות היא לשנות את קצב הסריקה של הניסוי 38, 39. חלבונים כי היו מועדים אגרגטים להרכיב כאשר מחומם נבחנו בקצב סריקה מהיר יותר (למשל, 120 ° C / שעה), כדי למנוע את התרומה של אגרגטים לפרופיל המעבר התרמי, כמו גם סתימה בנימי קלורימטר. ראוי לציין כי סריקת קצב יכול להשפיע על תוצאות ניסוי DSC 38. התרחבותה של שיא מעבר התרמית נצפתה עם הגדלת שיעורי סריקה בחלק פרוחלבונים; עם זאת, T מ &#39;נשאר קבוע למדי 38. יתר על כן, צעדי דיאליזת degassing להכנת מדגם הם גם מאוד קריטיים עבור תוצאות מדויקות 31. דיאליזה מבטיחה כי ההבדל היחיד בהרכב המדגם למאגר הוא החלבון; וכך, כל עודף החום נספג על ידי המדגם ניתן לייחס קיבולת החום של החלבון. Degassing מבטיחה ניתוח נפח מדויק, כמו אקסטרפולציה של פרמטר תרמודינמי מניחה שאירוע ההתגלגלות מתרחש תחת נפח קבוע ולחץ 31. החלק לחץ מתמיד של ההנחה היא מוסברת על ידי שמירת לחץ החנקן של מערכת כאמור בסעיף 1.1 של ההליך. בהשוואה לשיטות אחרות של בקביעת יציבותה של תצורות חלבון כגון מעגלי dichroism (CD) פלואורסצנטי Spectroscopies, DSC מציעה מספר יתרונות בתוך comהגדרה מסחרית לרבות חיסכון בעלויות ובזמן. ראשית, העיצוב adiabatic של קלורימטר סריקה ההפרש מאפשרת מדידה של יציבות תרמית עם דיוק טמפרטורה טובה יותר לעומת מדידות עם מכשור עבור דיסקים CD ו הקרינה Spectroscopies 6. שנית, בניגוד CD, את הדיוק של נתוני DSC אינו תלוי helicity של החלבון 39, 40; עם זאת, CD מספק מידע נוסף על ההתגלגלות של המבנה מהשני, אשר יהיה חינם אל DSC 41. בנוסף, שמירת לחץ קבוע של מערכת DSC מאפשר לבדיקה עם טווח רחב של טמפרטורות ללא רותחים המדגם; וכך, מגוון רחב של חלבונים ניתן לבדוק על ידי DSC. בעוד DSC היא גישה מהירה יחסית וישירה כדי לקבוע את יציבות התרמית של תרופות ביולוגיות, זה לא בלי מגבלות. ראשית, הבסיסקו צעד חיסור מציג צורה כלשהי של חוסר עקביות אנושית לתוך ניתוח נתונים הגולמי; וכך, וריאציות בתוצאות ניתן להבחין בין משתמשים שונים. שנית, calorimeters סריקת ההפרש יש מגבלות ריכוז מינימאליות אשר עלול להיות קשה להשיג בקנה מידת ייצור בתפזורת. שלישית, ΔH של denaturation תרמית ההפיכה אינו מוחלט; מה שמרמז על כך נגזר ΔG (אינדיקטור של יציבות חלבון) בתרחישים דומים יכול להיות מטעה. יתר על כן, השיטה מתאימה ביותר דגימות מטוהרות. נוכחות של זיהומים עשויה גם לגרום שינוי T מ אם קיימת אינטראקציה עם החלבון תחת חקירה, או המראה של מעברי תרמית חדשים אם אין אינטראקציה. במקרה כל תכונות נוספות אלה על thermograms ניתן לייחס בטעות דגימות, ובכך להשפיע על הפרשנות של התוצאות. למרות מגבלות אלה, DSC נשאר שיטה אמינה שיכולה לספק מידע מפורט על התרמודינמית החלבון ה התגלגלות תהליך אם מיושם כהלכה 42. לסיכום, DSC מציע יתרון משמעותי ככלי הודעה קונפורמציה למוצרי חיסון הביניים שלהם. שני הפרמטרים, T מ &#39;ΔH, שנאספו עבור מערך של הרבה של אותו מוצר יכול להיות הבסיס האמפירי, שניתן להשתמש בהם כדי לבחון את ההשפעה של שינויים בתהליך, ניסוח, ותנאי אחסון על מבנה שלישוני ויציבות של חלבון אנטיגנים נגיפיים 21, 43.

סריקה calorimetry דיפרנציאלי (DSC) היא שיטה ניסיונית אשר מודד את ההבדל ישירות ספיגת אנרגיית חום המתרחשים קרוב משפחה מדגם עזר במהלך שינוי הטמפרטורה מוסדר 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10,, 11, 12. שבוצעה במשך קלורימטר סריקת הפרש, השיטה כרוכה החדרת אנרגית חום לתוך תא מדגם תא התייחסות בו זמנית תוך הגדלת הטמפרטורה זהה של התאים הם לאורך זמן 2, 13,14. בשל הבדל בהרכב המדגם ואת ההתייחסות, כמות האנרגיה שונה תידרש כדי להעלות את הטמפרטורה של התאים 2, 12, 13. לפיכך, כמות העולה על האנרגיה הנדרשת כדי לפצות על הבדלי הטמפרטורה בין התאים נמדד בקורלציה ישירות תכונות תרמודינמיות ספציפיים של המדגם 1, 3. ב -1960, MJ אוניל וא ווטסון של פרקין אלמר פתחו את קלורימטר סריקת ההפרש הראשון למדוד את זרימת החום של חומרים מוצקים 2, 3, 4. במקביל, PL Privalov ו- DR Monaseldze EL של המכון לפיזיקה, הרפובליקה של גאורגיה (ברית המועצות לשעבר) יצר קלורימטר adiabatic ההפרש ייחודי שיכול לשמש FOr ביוכימיים מחקר 5, 6. בהמשך לכך, צוות של Andronikashvili במכון לפיסיקה, הרפובליקה של גאורגיה, דיווח קיבולת החום של ביומולקולות כגון חלבונים סיביים כדוריים, DNA, RNA באמצעות DSC 7, 8, 9. מספר צוותים בראשות Sturtevant 10, 11, 12, ברנדט 13, ו Privalov 14, 15, 16 מתמקדת בפיתוח של תיאוריה ויישומים מעשיים של DSC לחקור את הפרטים התרמודינמית של התגלגלות חלבון. שווי DSC בלימוד מבנים מולקולריים גדולים כמו פאגים, הכלורופלסט, גבישים נוזליים פוספוליפידים, וחלבוני בשר גם דווח 17 </<html> sup&gt;, 18, 19, 20. DSC הפכה כעת שבשגרה במחקר של תרופות ופיתוח עבור הערכת יציבות תרמית של ביומולקולות, במיוחד חלבונים 1, 21, 22. זהו בעיקר בשל התקדמות מבחינת רגישות ואוטומציה של המכשור המשמש לביצוע הניסוי 23, 24. כאן, התוצאה הסופית של הניסוי DSC, כלומר, קיבול חום טוחנת כפונקציה של הטמפרטורה, משמש כדי להעריך את הפרמטרים הבאים התרמודינמית (שינוי קיבול חום (ΔCp), אנתלפיה (ΔH), האנטרופיה (ΔS) אנרגיה חופשית, ו גיבס (ΔG)) באמצעות המשוואה הבאה: eq1.jpg &quot;/&gt; (1) <img alt="משוואה 2" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq2.jpg" /> (2) <img alt="משוואה 3" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq3.jpg" /> (3) <img alt="משוואה 4" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq4.jpg" /> (4) <img alt="משוואה 5" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq5.jpg" /> (5) איפה Cp נמדד קיבול חום; q הוא זרימת החום לתוך החומר למבחן; T 0 ו- T הם הטמפרטורות התחלתי וסופי של המעבר בהתאמה 22, 25. כמו כן ראוי לציין כי המשוואות לעיל חלות לחלבונים חד תחום שיכול לעבור מעבר של שתי מדינות והפיכות תרמית התגלגלות 22. ניתוח של חלבונים מורכבים יותר (למשל, חלבונים שאינם שתי מדינות לשני עמים, ו oligomers) hותעיף דווח על ידי ואח &#39;פריירה. 26; ג&#39;ונסון et al. 27; ו Kasimova et al. 28. על מנת לקבוע האם חלבון עובר המעבר של שתי מדינות או צורות ביניים במהלך denaturation תרמית, אנתלפיה נגזר באופן ניסיוני (ΔH; התייחס גם קאל ΔH אנתלפיה קלוריות כמו) מושווה אנתלפיה נגזר באמצעות המשוואה van&#39;t הוף כדלקמן (גם המכונה אנתלפיה van&#39;t הוף; ΔH VH): <img alt="משוואה 6" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq6.jpg" /> (6) איפה T מ &#39;היא הטמפרטורה האמצע של המעבר, R הוא קבוע הגזים האידיאלי (1.987 cal mol -1 K -1) ו- Y הוא חלק קטן מהאוכלוסייה חלבון במדינת פרש 16, 29. אםΔH VH שווה ΔH קאל; או ΔH VH / ΔH קאל שווה ל -1, אז החלבון עובר מעבר &quot;הכל או לא כלום&quot; (כלומר מעבר של שתי מדינות) 16, 25, 29. עם זאת, אם ΔH VH הוא פחות מ ΔH קאל; או ΔH VH / ΔH קאל הוא פחות מ 1, החלבון עובר מעבר הלא שתי מדינות לשני עמים 16, 25, 29. יחס ΔH VH / ΔH קאל גם תואם את חלקם של מבנה החלבון שנמס כיחידה שיתופית התרמודינמית או התחום 26. הפרמטרים התרמודינמית הנ&quot;ל כגון ΔG ו ΔH לספק מידע שימושי על יציבות התרמית של חלבונים, כולל תרופות ביולוגיות<html> 30. עם זאת, הדגש יהיה מונח על T מ &#39;ΔH בפרסום זה, כפי שהם על הערכים המדווחים עבור פרוטוקול זה. מ T היא טמפרטורת נקודת האמצע של המעבר, שבו המקופל והמדינות הפרשיות של החלבון הן בשיווי המשקל (כלומר, ΔG = 0) 25, 31. ככל T מ &#39;של חלבון, גבוה יותר יציבות תרמית שלה 31. ΔH תואמת את השטח מתחת לשיא (ים) של קיבול חום לעומת גרף טמפרטורה (הידוע גם בשם thermogram) שנוצר בסוף הניסוי DSC 16, 25. זוהי האנרגיה הנדרשת כדי לפגל חלבונים והוא יכול לשמש כדי להעריך את החלק היחסי פעיל (א F) בניסוח חלבון (כלומר, חלקם של חלבונים עם קונפורמציה פעיל מדגם) באמצעות המשוואה הבאה: jove_content &quot;&gt; <img alt="משוואה 7" src="/files/ftp_upload/55262/55262eq7.jpg" /> (7) איפה ΔH הוא אנתלפיה נגזר באופן ניסיוני של מדגם החלבון ו- Q הוא אנתלפיה שנקבע הפניה היטב מאופיינת או חלבון סטנדרטי 22. האמידה של F היא משמעותית לניטור היציבות בזמן האמת של מוצרים, כמו גם ביצוע מחקרי יציבות בתנאי קיצון כנדרשת בהנחיות ICH 32. גם השוואה של ΔH מספק מידע על הקומפקטיות של קונפורמציה מבנה שלישוני של חלבון 31. פרוטוקול זה מפרט נוהל להערכת יציבות התרמית של חלבונים בסביבה תעשייתית כבר נעשה שימוש נרחב לגיבוש חיסונים. הוא פותח באמצעות קלורימטר סריקת הפרש אוטומטי שיוצר f תוצאות לשחזוראו ריכוזי חלבון נמוך כמו 300 מיקרוגרם / מ&quot;ל.

<table><tbody><tr><td>קלורימטר סריקה דיפרנציאלית</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>28428948 (דרך GE Healthcare)</td><td>בעל דגימה אוטומטית לחלוקה אוטומטית של דגימות לתא כדי להפחית מאמץ אנושי וטעויות.</td></tr><tr><td>Contrad 100</td><td>Decon Laboratories Inc</td><td>1504</td><td>לדלל במים ל-20% לפני השימוש</td></tr><tr><td>500 ומיקרו; L פוליפרופילן תחתון עגול 96 באר צלחת</td><td>מדעי החיים הקנדית</td><td>ML072100</td><td>צלחות שוות ערך מספקים אחרים (למשל , פולקסווגן) ניתן להשתמש גם</td></tr><tr><td>MicroCal ThermoVac&nbsp;</td><td>Malvern Instruments Ltd</td><td>N/Ap</td><td>סיפקה את ארון הבטיחות הביולוגית Cap VP DSC</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Labconco</td><td>Logic+ -</td><td>ארון זרימה למינרי הכלה ביולוגית A2 להכנת דגימה</td></tr> קלטת <tr><td>דיאליזה Slide-A-Lyzer</td><td>Thermo Scientific</td><td>66810 או 66380</td><td>לאיזון הדגימה והמאגר</td></tr></tbody></table>

calorimetry סריקה דיפרנציאל - שיטה להערכת יציבות תרמית ומבנה של antigen חלבון

Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

סריקת calorimetry דיפרנציאלי (DSC) הוא שיטה אנליטית אשר מודדת את קיבולת חום הטוחנת של דגימות כפונקציה של טמפרטורה. במקרה של דגימות חלבון, פרופילי DSC לספק מידע על יציבות תרמית, ובמידה מסוימת הוא מעין &quot;טביעת אצבע&quot; מבנית שיכול לשמש כדי להעריך קונפורמציה מבני. הדבר מתבצע באמצעות קלורימטר סריקת הפרש המודד את טמפרטורת מעבר התרמית (נמסה בטמפרטורה; T מ &#39;) ואת האנרגיה הנדרשת כדי לשבש את יחסי הגומלין לייצוב המבנה השלישוני (אנתלפיה; ΔH) של חלבונים. נעשות השוואות בין הניסוחים כמו גם הרבה ייצור, והבדלי ערכים הנגזרים להצביע על הבדלים יציבים תרמית קונפורמציה מבני. נתונים הממחישים את שימוש DSC בסביבה תעשייתית עבור מחקרי יציבות, כמו גם ניטור צעדי ייצור עיקריים מופיעים הוכחה ליעילות של פרו זהtocol. לשם השוואה לשיטות אחרות להערכת יציבות התרמית של תצורות חלבון, DSC היא חסכונית, דורשת כמה צעדי הכנת מדגם, וגם מספקת פרופיל התרמודינמית מלא של תהליך התגלגלות החלבון.

הנתונים הגולמיים מרוב ניסויי DSC מוצגים בתור שטף חום לעומת גרף טמפרטורה, כמו קלורימטר למעשה מודד את הפער בשיעור של זרימת חום לתוך התמיסה מדגם חיץ 35. לכן, אם שני התאים (כלומר תאי מדגם הפניה) מכילים פתרונות זהים במהלך ניסוי, את הנתונים הגולמיים מן הסריקה צריכים להיות קו ישר בלי שום שיאים נצפים. כל שיא נצפה ניתן לייחס טעות מדידה (פגום למשל או מזוהם תאים), וזאת הסיבה פועלת סריקות חיץ לפני לדגום ניתוח הוא מבחן התאמת מערכת נאות. איור 1 מדגים את התוצאה של סריקת חיץ אופיינית המציין כי קלורימטר היה במצב עבודה טוב לפני לדגום ניתוח. איור 2 מציג את הנתונים הגולמיים עבור ניסוי DSC שבוצעו על diffהמון erent של שתי דגימות חלבון. כפי שנרמז קודם לכן, הפסגות ציינו הם הבדלי שטף החום על מדגם המאגרים שלהם. הבדלים בריכוז מדגם יכולים לגרום וריאציות קיבול חום שרשם קלורימטר; עם זאת, הווריאציות הללו הן מנורמלות במהלך ניתוח מדגם כאמור בסעיף 4.2 של ההליך. ריכוזים גבוהים יותר גם יכולים לחשוף תחומי התרמודינמית נוספים לא תורם המעבר בריכוזים נמוכים. בנוסף, כל מעבר מייצג תחום התרמודינמית שעשויה לכלול תחומים מבניים אחד או יותר של החלבון 36. במקרה זה, החלבון 1 יש שלושה תחומים מבניים שנמסים בשיתוף פעולה. איור 3 מציג את התוצאות שנוצרו מהניתוח של הנתונים הגולמיים עבור חלבון 1 ו -2 מוצגים באיור 2, כלומר, לאחר חיסור בסיס וסיבי עקומת איטרטיביtting. Thermograms וכתוצאה מכך כבר מנורמל לסריקת שיעור (מתבצע באופן אוטומטי על ידי אלגוריתם שנקבע מראש בתוכנת הניתוח) וריכוז; ובכך, הצגת התוצאות של ניסוי קיבול חום השוואה מול גרפי טמפרטורה. תוכנת הניתוח משתמשת בנתוני קיבולת החום לעומת גרפי טמפרטורה, כגון T מ &#39;ΔCp, לגזור פרמטרים תרמודינמיים אחרים באמצעות וריאציות של המשוואות שניתנו לעיל תלוי cooperativity של חלבון התגלגלות. כאשר בודקים דגימות ידועות, הגדרת טווח הטמפרטורה המתאימה הוא חיוני. אחרת, thermograms שלם עלול לגרום, כפי שמודגם באיור 4. למרות T מטר מ- פרופילים כאלה ניתן לגזור, ΔH לא ניתן לקבוע במדויק. לכן, המדגם חייב להערכה מחדש עם טווח טמפרטורות גדול יותר כדי ללכוד את המעבר התרמי לחלוטין. כמה חלבונים גם מחדשטופס adily אגרגטים לאחר denaturation המלא, ותוצאה הוא קיבול חום שלאחר מעבר הגדלה: לעתים קרובות זה נראה כמו thermogram שלם כפי שמודגם באיור 2B. עם זאת, retesting עם טמפרטורה סופית גבוהה יכול לעזור לאשר אם יש התרחשות של מעבר קונפורמציה באותו האזור של thermogram או שזה רק האפקט קליט החום של אגרגטים חלבון. יציבות תרמית היא אחת התכונות הפיסיקליות המשמעותיות ביותר של חלבונים ומוצרים מבוססי חלבון בענף 37. בתחום התרופות, הוא משמש כדי לקבוע את היציבות של התרופות הביולוגיות בתנאים שונים, כולל כריות ניסוח וגורמים סביבתיים כגון לחות וטמפרטורה. כמו כן הוא משמש כדי לפקח צעד ייצור מפתח (למשל, טיהור רעלים) על מנת להבטיח עקביות קונפורמציה בין המון ייצור. <strong<html> &gt; דמוי 5 ו -6 להמחיש את שימוש DSC לבחון את ההשפעות של תנאים דטוקסיפיקציה ומחסני כימיקלי בהתאמה על יציבות קונפורמציה מבנית של שני חלבונים שונים. ההבדלים המשמעותיים ב TM ו ΔH להצביע על שינויי קונפורמציה ושפלת חלבון בהתאמה. בנוסף, אובדן המעבר השלישי באיור 6 נוסף ממחיש את השפלתה של תחום אשר אושר על ידי ירידה במשקל מולקולרי כאשר הדגימות נותחו באמצעות כרומטוגרפיה בגודל הדרה עם פיזור אור רב-זווית (SEC-יונקים) ( מידע לא מוצג). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig1.jpg" /> איור 1: סורק הצפה. דמיון השיפוע של כל סריקה ללא פסגות נצפות מציין כי המכשיר נמצא במצב עבודה טוב שנוצר תוצאות לשחזור.//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig2.jpg" /> איור 2: נתונים גולמיים שנאספו מניסויי DSC. גרפים אלה הם ייצוגים טובים של נתונים לא המוסברים (גלם) שנרכשו לאחר ריצות ניסיון (קרי בטרם חיסור עקום בסיס הולם). כל שורה מייצגת הרבה ייצור. חלבון 2 נוטה לצבור יותר בקלות על חימום, וכתוצאה מכך עלייה בקיבולת חום מעל 100 מעלות צלזיוס באזור-המעבר פוסט של thermogram. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig3.jpg" /><br/&gt; איור 3: נתח נתוני DSC. גרפים אלה הם ייצוגים טובים של נתוני DSC נתחו (כלומר, לאחר חיסור מחקר ולאחר עקומה הולמת). הקו הכחול מייצג את thermogram לאחר חיסור בסיס, ואילו הקו האדום מייצג את העקומה עם בכושר הטוב ביותר אל thermogram. (א) T מ &#39;ΔH עבור חלבון 1 לדוגמא # 12 הם 80.16 ° C ו- 1.69 x 10 6 cal / mol בהתאמה. (ב) מ T ו ΔH עבור חלבון 1 לדוגמא # 13 הם 80.15 ° C ו- 1.71 x 10 6 cal / mol בהתאמה. (ג) T מ &#39;ΔH עבור חלבון 2 לדוגמא # 21 הם 75.01 ° C ו- 4.08 x 10 6 cal / mol בהתאמה. (ד) מ T ו ΔH עבור חלבון 2 לדוגמא # 22 הם 75.67 ° C ו- 4.22 x 10 6 cal / mol בהתאמה. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי</a>לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig4.jpg" /> איור 4: Thermogram Incomplete. נתונים גולמיים לאסוף עבור חלבון 1 ונותח טווח טמפרטורות לקוי. הטמפרטורה הסופית של הניסוי נקבע ל -90 מעלות צלזיוס אשר לא להתאים את פרופיל המעבר כולו של חלבון לעומת הניסוי עבור איור 2 א אשר נקבע ל -120 מעלות צלזיוס. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig5.jpg" /> איור 5: ניתחו נתונים מראה את ההשפעה של ניקוי רעלים כימיים על מבנה שלישוני של חלבון 1. (א) חלבון 1 הוא רעלן קונפורמציה המקורית שלו ואת חהS M T שלה ב 56.84 מעלות צלזיוס, ΔH ב 2.57 x 10 5 cal / mol. (ב) טופס detoxified של חלבון 1 (toxoid כלומר) יש T מ וערכים ΔH של 81.01 ° C ו- 1.89 x 10 6 cal / mol בהתאמה. לפיכך, ניתן להסיק כי צעד הגמילה הציג צורה כלשהי של וריאציה על קונפורמציה המבני של חלבוני 1 אשר מקנה יציבות רבה יותר (מ T גבוה) בצורת detoxified שלה. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/55262/55262fig6.jpg" /> איור 6: נתח נתונים מראים את ההשפעה של תנאי אחסון על הקונפורמציה של חלבון 3. גרפים אלו ממחישים את ההשפעה של טמפרטורת אחסון (2 - 8 ° C) על יציבות מבנה שליישונים של פרוחלבון 3 למעלה מ -30 שבועות. T מ וערכים ΔH עבור חלבון 3 בבית (א) 8 וה ה -38 בשבוע (B) של אחסון ניתנים בטבלה 1 להלן. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> לִטעוֹם </td><td> Tm 1 (° C) </td><td> ΔH 1 (cal / mol) </td><td> Tm 2 (מעלות צלזיוס) </td><td> ΔH 2 (cal / mol) </td><td> Tm 3 (° C) </td><td> ΔH 3 (cal / mol) </td></tr><tr><td> חלבון 3 מאוחסן ב 2-8 מעלות צלזיוס למשך 8 שבועות </td><td> 61.91 </td><td> 1.71 x 10 5 </td><td> 75.54 </td><td> 2.17 x 10 5 </td><td> 90.29 </td><td> 4.17 x 10 5 </td></tr><tr><tד&gt; חלבון 3 מאוחסן ב 2-8 מעלות צלזיוס למשך 38 שבועות </td><td> 61.87 </td><td> 1.66 x 10 5 </td><td> 75.18 </td><td> 1.46 x 10 5 </td><td> 90.22 </td><td> 5.76 x 10 5 </td></tr></tbody></table> טבלה 1: TM ו ΔH ערכים עבור חלבון 3 בבית שבוע 8 וה ה -38 של אחסון של 2 - 8 מעלות צלזיוס. למרות ערכי m T בשתי נקודות הזמן דומים, ההבדל בערכי ΔH מציין כי המבנה שליישונים של חלבון 3 נפגם כדי כך בחלוף 30 שבועות בתנאי האחסון שצוין.

סריקת calorimetry דיפרנציאלי המודד את טמפרטורת מעבר התרמית (ים) ו אנרגית חום כוללת הנדרשת כדי לפגל חלבון. תוצאות שהתקבלו משמשות כדי להעריך את יציבות התרמית של אנטיגנים חלבון בניסוחי חיסון.

Calorimetry סריקה דיפרנציאל - שיטה להערכת יציבות תרמית ומבנה של Antigen חלבון

Differential scanning calorimetry (DSC) is an analytical technique that measures the molar heat capacity of samples as a function of temperature. In the ...

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את היציבות התרמית והקונפורמציה המבנית של חלבונים בסביבה תעשייתית באמצעות קלורימטריית סריקה דיפרנציאלית. קלורימטריית סריקה דיפרנציאלית מודדת את קיבולת החום המולרי של דגימות כפונקציה של טמפרטורה ושימשה בהצלחה להערכת היציבות התרמית והקונפורמציה המבנית של חלבונים. הליך פשוט יחסית זה אינו תלוי בסליל מבני או בפלואורופורים פנימיים כפי שקורה בשיטות ביופיזיקליות אחרות.יתרון נוסף של טכניקה זו הוא שהיא מודדת ישירות את טמפרטורת המעבר התרמי ואת האנרגיה הנדרשת כדי לשבש את האינטראקציה המייצבת את המבנה השלישוני של חלבונים. כאשר משתמשים בה בשילוב עם ההתלהבות של התפתחות, טמפרטורת המעבר התרמי יכולה לשמש כפרמטר שימושי לניטור עקביות של תהליכי ייצור עבור תרופות ביולוגיות. הדגמה חזותית של שיטה זו יכולה לשמש כמדיום אינטראקטיבי כדי לסייע ביעילות למשתמשים החדשים בשלבים קריטיים.כדי להתחיל, הפעל את קלורימטר הסריקה הדיפרנציאלי. ואז ספק חנקן למערכת. זה יגביר את הלחץ בתאים כדי לדכא את הרתיחה של הדגימות וכן למנוע היווצרות בועות בטמפרטורות גבוהות.בהתאם לחומר המרכיב את התא, התאם את לחץ אספקת גז החנקן בהתאם ללחץ המומלץ של היצרן כדי למנוע נזק לתא. ודא שכל מאגרי חומרי הניקוי מלאים בנפח הנדרש. חומרי ניקוי נדרשים כוללים חומר ניקוי לשטיפת התא ומים לניקוי התא לאחר כל הפעלת דגימה.הגדר את הטמפרטורה של תא החזקת הדגימה לערך מתאים, רצוי חמש מעלות צלזיוס כדי לשמור על שלמות הדגימה לפני הניסוי. חשוב לאזן את הדגימה מול המאגר כדי להבטיח שההבדל היחיד בין התמיסות הוא החלבון. לכן, ניתן לייחס נכון את ההבדל שנצפה בקיבולת החום לחלבון.קבע את ריכוז דגימת החלבון באמצעות שיטת קביעת ריכוז חלבון מתאימה כגון שיטת Lowry. עבור המכשיר המשמש בפרוטוקול זה, טווח העבודה העדיף הוא 0.5 עד מיליגרם אחד של חלבון למיליליטר. דיאליזה של הדגימה כנגד המאגר שישמש כהתייחסות לניסוי.הסר את הדגימה ואת מאגר הייחוס בוואקום כדי להיפטר מבועות מיקרו שעלולות לגרום לאי דיוק בנפח. עבודה בארון הכלה ביולוגית של זרימה למינרית, השתמש במיקרופיפטה ובקצות סטריליות כדי לטעון את הדגימות במאגר שלהן בזוגות לתוך 96 לוחות באר. מלא את שני זוגות הבארות הראשונים במאגר כדי לבצע סריקות מאגר כדי לוודא את התאמת המכשיר לפני מדידת הדגימה.מלאו את שני זוגות הבארות האחרונים במים לסריקת המים כדי לנקות את התאים. לאחר מכן מכסים את צלחת 96 הבאר בסרט איטום. ודא שהבארות אטומות כראוי לפני הוצאת הצלחת מארון הבטיחות הביולוגית כדי למנוע זיהום דגימה.לבסוף, הנח את הצלחת בתא החזקת הדגימה בכיוון הנכון. באמצעות תוכנת הרכישה, הזן את המידע לדוגמה לפי סדר טעינת הצלחת. הזן ריכוזי חלבון אם זמינים.אחרת, הזן את הריכוז בתוכנת הניתוח לפני ניתוח הנתונים. בחר באפשרות המבטיחה ניקוי התא עם חומר ניקוי לפני כל סריקת דגימה. לאחר הניקוי יש לבצע מספר שלבי שטיפה במים כדי להבטיח שלא יישארו שאריות חומר ניקוי בתאים.הגדר את טמפרטורת ההתחלה של הניסוי ל-20 מעלות צלזיוס, שיכולה להשתנות בהתאם לדגימה. עבור חלבונים ידועים, ניתן להשתמש בטמפרטורת התחלה קבועה מראש בעוד שניתן להחיל טמפרטורת התחלה נמוכה יותר עבור דגימות לא ידועות. לאחר מכן הגדר את הטמפרטורה הסופית של הניסוי.הטמפרטורה הסופית עשויה להשתנות גם בהתאם לידע מוקדם של המדגם. לאחר מכן, הגדר את קצב הסריקה של הניסוי. רצוי לסרוק דגימות לא ידועות בקצבי סריקה שונים כדי להעריך את הקינטיקה של ההתפתחות.הגדר את תוכנת הרכישה כדי לסרוק מחדש את הדגימות כדי לבחון את הפיכות המעבר התרמי. התפתחות חלבון נחשבת הפיכה אם האנתלפיה המתקבלת עבור הסריקה השנייה היא לפחות 80% מערך האנתלפיה מהסריקה הראשונה. הגדר את התרמוסטט שלאחר הניסוי ל-10 מעלות צלזיוס כדי לשמור על שלמות תא הקלורימטר.ודא שפרמטרי הגדרת הניסוי נכונים לפני ביצוע הניסוי. אם הכל במקום, התחל את הניסוי. לאחר הניסוי, בצע ניתוח נתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.לצורך הניתוח, חיסור הבסיס מתבצע באופן ידני. עקביות בשלב זה היא חיונית להשגת תוצאות דומות. מוצג כאן נתונים גולמיים מייצגים של ריצת ניסוי כולל סריקות המאגר והמים.הדגימות המנותחות הן רעלים במצבם המקורי ונטול הרעלים. סריקות הדגימה מעובדות בנפרד כדי לגזור את טמפרטורת ההיתוך וערכי האנתלפיה עבור כל דגימה. עבור המדינה הילידית, טמפרטורת ההיתוך היא 55.55 מעלות צלזיוס והאנטלפיה של הרעלן היא 3.157 כפול 10 עד חמישית קלוריות למול.לעומת זאת, טמפרטורת ההיתוך של הרעלן במצבו הנקי היא 81.21 מעלות צלזיוס והאנטלפיה היא 3.656 כפול 10 עד חמישית קלוריות למול. שכבת העל של הנתונים המעובדים של הרעלן במצבו המקורי ונטול הרעלים מדגימה כי הדגימה המנוקה יציבה יותר מבחינה תרמית מאשר מצבה המקורי על פי ערכי טמפרטורת ההיתוך. זה גם מצביע על כך שתהליך ניקוי הרעלים מציג שינויים מבניים במבנה השלישוני של הרעלן.בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לספק אספקה נאותה של חומר ניקוי ומים כדי למנוע זיהום צולב של התא והמזרק שכן צלילותם חיונית לתוצאות מדויקות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לך הבנה טובה של קלורימטריית הסריקה הדיפרנציאלית כשיטה להערכת היציבות התרמית והקונפורמציה של חלבונים. תוכל גם לבצע ניכויים משמעותיים מהריצות התרמיות המתקבלות.בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו דיכרואיזם מעגלי על מנת לענות על שאלות נוספות הנוגעות לשינויים במבנים המשניים במהלך ההתפתחות. נתונים שנאספו עבור מערך של הרבה מאותו מוצר שימשו ליצירת קווי בסיס אמפיריים לבחינת ההשפעה של שינויים בתהליכים, ניסוח ותנאי אחסון על מבנה האנטיגנים של חלבונים לייצור חיסונים.

differential-scanning-calorimetry-method-for-assessing-thermal

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

סרטון זה מדגים קלורימטריה של סריקה דיפרנציאלית — טכניקה לחקר האינטראקציה בין ביומולקולה לליגנד. הקישור של אפטמר DNA וליגנד תרמולבילי נחקר על ידי החלת מחזורי חימום וקירור חוזרים ונשנים על הדגימה וקבלת סריקות לאנליזה תרמודינמית.

סריקה דיפרנציאלית קלורימטריה לחקר DNA Aptamer-Thermolabile Ligand אינטראקציה

מיזוג הוא גישה יעילה ליצירת חומרים ביולוגיים עם מגוון רחב של מאפיינים ותכונות משולבות. על ידי חיזוי האינטראקציות מולקולריות בין חלבוני משי טבעי השונים, פלטפורמות סגסוגת חלבון חדשות משי משי עם גמישות מתכונן מכאנית, תגובה חשמלית, שקיפות אופטית, processability הכימי, פריקות ביולוגית, או יציבות תרמית יכולות להיות מתוכננות.

עיצוב פרוטאין משי משי חומרי סגסוגת עבור יישומים ביו

פלואורימטריית סריקה דיפרנציאלית היא שיטה בשימוש נרחב לסינון ספריות של מולקולות קטנות לאינטראקציות עם חלבונים. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה להרחבת ניתוחים אלה כדי לספק אומדן של קבוע הדיסוציאציה בין מולקולה קטנה לשותף החלבון שלה.

נחישות של אינטראקציות חלבון ליגנד שימוש דיפרנציאל סריקת Fluorimetry

אנו מציגים פרוטוקול פלואורסנציה למערכות ביולוגיות קיפול ואיגוד אינטראקציות עם thermolabile ליגנדים שימוש דיפרנציאלי calorimetry סריקה מהירה.

מדידת למערכות ביולוגיות DSC פרופילים עם Thermolabile ליגנדים לאפיין במהירות קיפול ואיגוד אינטראקציות

פרוטוקול מוצג כדי לבדוק במהירות את יציבות תרמית של חלבונים במגוון תנאי באמצעות shift תרמי מבחני וננו דיפרנציאלית סריקה fluorimetry. הכוללת שלושה ייחודי יציבות מסכי, הם לבדיקה מאגר מערכות, מלחים, תוספים, יחד עם חלבונים כדי לזהות מאגרים מתאימים עבור לימודי המבנית תפקודית.

איך לייצב את חלבון: מסכי יציבות תרמית משמרת מבחני ו ננו דיפרנציאלית סריקה Fluorimetry בפרוייקט וירוס-X

מדידות של התרופה היעד אירוסין הן גורם מרכזי פיתוח תרופות יעיל ובדיקת בדיקה כימית. כאן, אנו מפרטים פרוטוקול למדידת סמים-יעד האירוסין באמצעות הדמיה תוכן גבוהה לאגדת microplate תואמי וזמינותו הסלולר shift תרמיים (CETSA).

באמצעות תוכן גבוהה הדמיה לכמת התחייבות היעד תאים חסיד

ניטור שינויים בטמפרטורת ההיתוך של חלבון יעד (כלומר,בדיקת משמרות תרמית, TSA) היא שיטה יעילה לבדיקת ספריות שברים של כמה מאות תרכובות. אנו מציגים פרוטוקול TSA המיישם פלואורימטריה סריקה ננו-דיפרנציאלית בסיוע רובוטיקה (nano-DSF) לניטור פלואורסצנטיות טריפטופן מהותית ופיזור גב אור להקרנת שברים.

פלואורימטריה סריקה ננו-דיפרנציאלית להקרנה בתגלית עופרת מבוססת שבר

פרסום זה מציג את היישום של עקיפת קרני רנטגן וקלורימטריה של סריקה דיפרנציאלית כתקני זהב לחקר המצב המוצק של חומרים פעילים מבוססי שומנים (LBEs). הבנת השינוי במצב מוצק ב-LBEs והשפעתו על הביצועים של מוצרים פרמצבטיים הם גורם המפתח לייצור צורות מינון חזקות המבוססות על שומנים.

חבילה של כלים אנליטיים מבוססים כדי לחקור את השינוי במצב מוצק של חומרים פעילים מבוססי ליפידים

פרוטוקול זה מתאר שיטה ייחודית לזיהוי הקישור בין תרכובות ומולקולות חלבון, ומציע את היתרונות של אובדן דגימת חלבון מינימלי ודיוק נתונים גבוה.

זיהוי אינטראקציה של חלבון-אומבליפרון CD40 באמצעות פלואורסצנטיות סריקה דיפרנציאלית

האינטראקציה בין ערוצי HCN ו למקטע העזר שלהם זוהה כיעד טיפולי הפרעת דיכאון מג'ורית. כאן, שיטת קרינה מבוססת קיטוב לזיהוי מעכבי מולקולה קטנים של אינטראקציה בין חלבונים זה, מוצגת.

שיטה לזיהוי מולקולה קטנה מעכבים של האינטראקציה בין החלבונים בין HCN1 ו TRIP8b

למד כיצד להעריך יציבות תרמית ומבנה של חלבונים באמצעות קלורימטריה סריקה דיפרנציאלית. שיטה זו מודדת טמפרטורת מעבר תרמי ואנרגיית דנטורציה לפיתוח חיסונים.

Calorimetry סריקה דיפרנציאל - שיטה להערכת יציבות תרמית ומבנה של Antigen חלבון

גלה סרטונים נוספים