Calorimetry סריקה דיפרנציאל - שיטה להערכת יציבות תרמית ומבנה של Antigen חלבון
4 במרץ 2017
סריקת calorimetry דיפרנציאלי המודד את טמפרטורת מעבר התרמית (ים) ו אנרגית חום כוללת הנדרשת כדי לפגל חלבון. תוצאות שהתקבלו משמשות כדי להעריך את יציבות התרמית של אנטיגנים חלבון בניסוחי חיסון.
המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את היציבות התרמית והקונפורמציה המבנית של חלבונים בסביבה תעשייתית באמצעות קלורימטריית סריקה דיפרנציאלית. קלורימטריית סריקה דיפרנציאלית מודדת את קיבולת החום המולרי של דגימות כפונקציה של טמפרטורה ושימשה בהצלחה להערכת היציבות התרמית והקונפורמציה המבנית של חלבונים. הליך פשוט יחסית זה אינו תלוי בסליל מבני או בפלואורופורים פנימיים כפי שקורה בשיטות ביופיזיקליות אחרות.
יתרון נוסף של טכניקה זו הוא שהיא מודדת ישירות את טמפרטורת המעבר התרמי ואת האנרגיה הנדרשת כדי לשבש את האינטראקציה המייצבת את המבנה השלישוני של חלבונים. כאשר משתמשים בה בשילוב עם ההתלהבות של התפתחות, טמפרטורת המעבר התרמי יכולה לשמש כפרמטר שימושי לניטור עקביות של תהליכי ייצור עבור תרופות ביולוגיות. הדגמה חזותית של שיטה זו יכולה לשמש כמדיום אינטראקטיבי כדי לסייע ביעילות למשתמשים החדשים בשלבים קריטיים.
כדי להתחיל, הפעל את קלורימטר הסריקה הדיפרנציאלי. ואז ספק חנקן למערכת. זה יגביר את הלחץ בתאים כדי לדכא את הרתיחה של הדגימות וכן למנוע היווצרות בועות בטמפרטורות גבוהות.
בהתאם לחומר המרכיב את התא, התאם את לחץ אספקת גז החנקן בהתאם ללחץ המומלץ של היצרן כדי למנוע נזק לתא. ודא שכל מאגרי חומרי הניקוי מלאים בנפח הנדרש. חומרי ניקוי נדרשים כוללים חומר ניקוי לשטיפת התא ומים לניקוי התא לאחר כל הפעלת דגימה.
הגדר את הטמפרטורה של תא החזקת הדגימה לערך מתאים, רצוי חמש מעלות צלזיוס כדי לשמור על שלמות הדגימה לפני הניסוי. חשוב לאזן את הדגימה מול המאגר כדי להבטיח שההבדל היחיד בין התמיסות הוא החלבון. לכן, ניתן לייחס נכון את ההבדל שנצפה בקיבולת החום לחלבון.
קבע את ריכוז דגימת החלבון באמצעות שיטת קביעת ריכוז חלבון מתאימה כגון שיטת Lowry. עבור המכשיר המשמש בפרוטוקול זה, טווח העבודה העדיף הוא 0.5 עד מיליגרם אחד של חלבון למיליליטר. דיאליזה של הדגימה כנגד המאגר שישמש כהתייחסות לניסוי.
הסר את הדגימה ואת מאגר הייחוס בוואקום כדי להיפטר מבועות מיקרו שעלולות לגרום לאי דיוק בנפח. עבודה בארון הכלה ביולוגית של זרימה למינרית, השתמש במיקרופיפטה ובקצות סטריליות כדי לטעון את הדגימות במאגר שלהן בזוגות לתוך 96 לוחות באר. מלא את שני זוגות הבארות הראשונים במאגר כדי לבצע סריקות מאגר כדי לוודא את התאמת המכשיר לפני מדידת הדגימה.
מלאו את שני זוגות הבארות האחרונים במים לסריקת המים כדי לנקות את התאים. לאחר מכן מכסים את צלחת 96 הבאר בסרט איטום. ודא שהבארות אטומות כראוי לפני הוצאת הצלחת מארון הבטיחות הביולוגית כדי למנוע זיהום דגימה.
לבסוף, הנח את הצלחת בתא החזקת הדגימה בכיוון הנכון. באמצעות תוכנת הרכישה, הזן את המידע לדוגמה לפי סדר טעינת הצלחת. הזן ריכוזי חלבון אם זמינים.
אחרת, הזן את הריכוז בתוכנת הניתוח לפני ניתוח הנתונים. בחר באפשרות המבטיחה ניקוי התא עם חומר ניקוי לפני כל סריקת דגימה. לאחר הניקוי יש לבצע מספר שלבי שטיפה במים כדי להבטיח שלא יישארו שאריות חומר ניקוי בתאים.
הגדר את טמפרטורת ההתחלה של הניסוי ל-20 מעלות צלזיוס, שיכולה להשתנות בהתאם לדגימה. עבור חלבונים ידועים, ניתן להשתמש בטמפרטורת התחלה קבועה מראש בעוד שניתן להחיל טמפרטורת התחלה נמוכה יותר עבור דגימות לא ידועות. לאחר מכן הגדר את הטמפרטורה הסופית של הניסוי.
הטמפרטורה הסופית עשויה להשתנות גם בהתאם לידע מוקדם של המדגם. לאחר מכן, הגדר את קצב הסריקה של הניסוי. רצוי לסרוק דגימות לא ידועות בקצבי סריקה שונים כדי להעריך את הקינטיקה של ההתפתחות.
הגדר את תוכנת הרכישה כדי לסרוק מחדש את הדגימות כדי לבחון את הפיכות המעבר התרמי. התפתחות חלבון נחשבת הפיכה אם האנתלפיה המתקבלת עבור הסריקה השנייה היא לפחות 80% מערך האנתלפיה מהסריקה הראשונה. הגדר את התרמוסטט שלאחר הניסוי ל-10 מעלות צלזיוס כדי לשמור על שלמות תא הקלורימטר.
ודא שפרמטרי הגדרת הניסוי נכונים לפני ביצוע הניסוי. אם הכל במקום, התחל את הניסוי. לאחר הניסוי, בצע ניתוח נתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
לצורך הניתוח, חיסור הבסיס מתבצע באופן ידני. עקביות בשלב זה היא חיונית להשגת תוצאות דומות. מוצג כאן נתונים גולמיים מייצגים של ריצת ניסוי כולל סריקות המאגר והמים.
הדגימות המנותחות הן רעלים במצבם המקורי ונטול הרעלים. סריקות הדגימה מעובדות בנפרד כדי לגזור את טמפרטורת ההיתוך וערכי האנתלפיה עבור כל דגימה. עבור המדינה הילידית, טמפרטורת ההיתוך היא 55.55 מעלות צלזיוס והאנטלפיה של הרעלן היא 3.157 כפול 10 עד חמישית קלוריות למול.
לעומת זאת, טמפרטורת ההיתוך של הרעלן במצבו הנקי היא 81.21 מעלות צלזיוס והאנטלפיה היא 3.656 כפול 10 עד חמישית קלוריות למול. שכבת העל של הנתונים המעובדים של הרעלן במצבו המקורי ונטול הרעלים מדגימה כי הדגימה המנוקה יציבה יותר מבחינה תרמית מאשר מצבה המקורי על פי ערכי טמפרטורת ההיתוך. זה גם מצביע על כך שתהליך ניקוי הרעלים מציג שינויים מבניים במבנה השלישוני של הרעלן.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור לספק אספקה נאותה של חומר ניקוי ומים כדי למנוע זיהום צולב של התא והמזרק שכן צלילותם חיונית לתוצאות מדויקות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לך הבנה טובה של קלורימטריית הסריקה הדיפרנציאלית כשיטה להערכת היציבות התרמית והקונפורמציה של חלבונים. תוכל גם לבצע ניכויים משמעותיים מהריצות התרמיות המתקבלות.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו דיכרואיזם מעגלי על מנת לענות על שאלות נוספות הנוגעות לשינויים במבנים המשניים במהלך ההתפתחות. נתונים שנאספו עבור מערך של הרבה מאותו מוצר שימשו ליצירת קווי בסיס אמפיריים לבחינת ההשפעה של שינויים בתהליכים, ניסוח ותנאי אחסון על מבנה האנטיגנים של חלבונים לייצור חיסונים.
סקירה כללית
מאמר זה דן בשימוש בקלורימטריה סורקת דיפרנציאלית (DSC) להערכת היציבות התרמית והקונפורמציה המבנית של חלבונים. טכניקה זו מודדת את טמפרטורת המעבר התרמי ואת האנרגיה הדרושה לדנטורציה של חלבונים, דבר החיוני להערכת פורמולציות של חיסונים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביופיזיקה
- כימיה של חלבונים
- פיתוח חיסונים
רקע
- קלורימטריה סורקת דיפרנציאלית (Differential scanning calorimetry) מודדת את קיבול החום המולרי של דגימות כפונקציה של הטמפרטורה.
- שיטה זו אינה נסמכת על סליליות מבנית או על פלואורופורים פנימיים.
- היא מספקת מדידות ישירות של טמפרטורות מעבר תרמי ושל האנרגיה הנדרשת לדנטורציה של חלבונים.
- ניתן להשתמש ב-DSC לניטור עקביות בין סדרות ייצור (lot-to-lot consistency) בייצור של תכשירים ביולוגיים.
מטרת המחקר
- להערכת היציבות התרמית של אנטיגנים חלבוניים בפורמולציות של חיסונים.
- להערכת התצורה המבנית של חלבונים במסגרת תעשייתית.
- למתן הדגמה ויזואלית של שיטת ה-DSC עבור משתמשים חדשים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת דגימות חלבון ותמיסות חוצצים.
- שימוש בקלורימטר סריקה דיפרנציאלית למדידת קיבול חום.
- החסרת קו בסיס במהלך ניתוח הנתונים להשגת תוצאות מדויקות.
- הערכת ההפיכות של פריסת החלבון באמצעות סריקות מרובות.
תוצאות עיקריות
- נקבעו ערכי טמפרטורת ההמסחה והאנטלפיה עבור המצבים הטבעי והמנוטרל של רעלן.
- רעלנים מנוטרלים הראו יציבות תרמית גבוהה יותר בהשוואה למקביליהם במצבם הטבעי.
- תוצאות ה-DSC הצביעו על שינויים מבניים במבנה השלישוני של הרעלן.
מסקנות
- קלורימטריה סורקת דיפרנציאלית היא שיטה יעילה להערכת יציבות חלבונים.
- הטכניקה יכולה לסייע בהבטחת עקביות בייצור תרופות ביולוגיות.
- הדגמות חזותיות יכולות לשפר את ההבנה של שלבים קריטיים בניסוי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
קלורימטריה סורקת דיפרנציאלית (DSC) מספקת למחקר ופיתוח בתחום הביו-פארמה (biopharma R&D)&צוותים עם גישה כמותית חזקה להערכת היציבות התרמית והשלמות הקונפורמציונית של אנטיגנים חלבוניים לאורך מנות ייצור ופורמולציות שונות. יכולת זו היא קריטית להפחתת סיכונים בפיתוח תרופות ביולוגיות, לתמיכה בעקביות בין מנות, ולסיוע בקבלת החלטות לגבי שינויים בתהליך או אופטימיזציה של הפורמולציה. תוצרי התרמודינמיקה הישירים של DSC מאפשרים ביטחון חזוי בנקודות תפנית מרכזיות ברצף שבין שלב הגילוי לשלב הפרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ובפיתוח בביופארמה&ד
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר הערכה כמותית של קיפול חלבונים ויציבותם לצורך בחירת מועמדים.
- תומך בהפחתת סיכונים מנגנונית על ידי חשיפת שינויים קונפורמציוניים כתוצאה ממודיפיקציות או עיבוד.
- מקל על השוואה אמפירית בין מצבים של חלבונים טבעיים לעומת חלבונים מהונדסים או מנוטרלי רעלים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מספק פרופילים מאומתים של יציבות תרמית לצורך סטנדרטיזציה של מערכת הבדיקה.
- מאפשר פלטים כמותיים הניתנים לשחזור לסריקת וריאנטים של חלבונים או פורמולציות.
- תומך במוכנות הפלטפורמה על ידי קביעת טביעות אצבע תרמודינמיות בסיסיות כייחוס.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאם נתוני יציבות חלבונים עם מחקרי פיתוח תהליכים וניסוחי פורמולציה עבור חיסונים ותכשירים ביולוגיים.
- מאפשר קבלת החלטות על קידום מבוסס סיכונים באמצעות ניטור השלמות המבנית תחת שינויים בתהליך או באחסון.
- תומך בקביעת קו בסיס אמפירי להמשכיות תרגומית בין מנות ייצור שונות.
שילוב זרימה ותהליכי עבודה
שימוש ב-DSC משתלב החל משלב הגילוי המוקדם ועד לפיתוח פרה-קליני, ומספק יכולת אנליטית הניתנת לשימוש חוזר לאפיון חלבונים, ניטור תהליכים והערכת פורמולציה.
- ביולוגיה של הגילוי: מכמת יציבות תרמית ושינויים קונפורמציונליים לתמיכה בבדיקת השערות ובתיקוף מטרות.
- סריקה: מספק נתוני טמפרטורת התכה ואנתלפיה כמותיים וניתנים לשחזור לצורך ניתוח השוואתי.
- אנליטיקה: מאפשר מדידה ישירה של מעברי פריסה (unfolding) של חלבונים ועקביות בין סדרות ייצור.
- מחקר תרגומי: עוקב באופן אמפירי אחר השפעת שינויים בתהליך או בפורמולציה על מבנה החלבון לייצור חיסונים.
- שימוש חוזר ארגוני: קובע קווי בסיס תרמודינמיים סטנדרטיים לייצור שוטף ולבקרת איכות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ביציבות החלבון ובשלמות המבנית שלו.
- ערך תפעולי: מייעל את הסטנדרטיזציה והשחזוריות בין סדרות ייצור ופורמולציות.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס לקבלת החלטות של המשך או עצירה (go/no-go) ומפחית סיכונים בשלבים מאוחרים באמצעות אספקת נתוני יציבות ברי-יישום.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם-סיכון ובקידום של מועמדים לביולוגים.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בכימיה של חלבונים ובפירוש נתונים תרמודינמיים.
- נדרשת גישה לקלורימטר סריקה דיפרנציאלית (DSC) מכויל ולפרוטוקולי ניקוי מתוקפים.
- השיטה דורשת הכנה קפדנית של הדגימות והחסרת קו בסיס להשוואה בין הנתונים.
- יש להבטיח סטנדרטיזציה של פרמטרי האנליזה והדיווח בין צוותים שונים.
- השיטה מוגבלת לבדיקת יציבות תרמית ומבנה שלישוני; שינויים במבנה שני עשויים לדרוש שיטות משלימות.
