נוהל מקיף כדי להעריך את

המטרה הכוללת של הליך זה היא להעריך את ההתנהגות in vivo של ננו-תרופות לסרטן ברמות מערכתיות, רקמתיות, ברמת התא הבודד וברמה התת-תאית בעכברים עם גידולים סרטניים בעלי מערכת חיסונית תקינה. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלה המרכזית בתחום הננו-תרופות לסרטן: כיצד ננו-תרופות מצטברות כמותית ברקמות שונות של בעלי חיים חיים לאורך זמן?

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שגישת סימון הכפול מאפשרת אפיון של ננו-רפואה in vivo מהרמה המקרוסקופית לרמה המיקרוסקופית. בחרנו בליפוזומים כדוגמה להדגמת הפרוצדורה שלנו כיוון שליפוזומים נמצאים כיום בשימוש קליני, והם מהווים גם פלטפורמה נפוצה לננו-תרופות ניסיוניות. כדי להתחיל בפרוצדורה, המיסו 20 milligrams של תערובת ליפידים, הכוללת 0.1%by mole של צבע פלואורסצנטי קטיוני ליפופילי, ושני milliliters של כלורופורם.

לאחר מכן, ייבשו את הליפידים באמצעות אידור סיבובי (rotary evaporator). הוסיפו 20 milliliters של phosphate-buffered saline לליפידים המיובשים. בצעו סוניקציה לתערובת על קרח באמצעות probe sonicator של 3.8 millimeter בהספק של 30 watts למשך 30 דקות, תוך שמירה על טמפרטורת התערובת בין 4 ל-20 degrees Celsius לאורך כל התהליך.

סבבו בצנטריפוגה את תרחיף הננו-חלקיקים הליפוזומליים שהתקבל ב-4,000 G למשך 10 דקות. השליכו את המשקע ושטפו את הליפוזומים ב-PBS, באמצעות יחידת סינון צנטריפוגלית בעלת MWCO של 100 kilodalton ב-4000 G. העבירו את הליפוזומים המרוכזים מהתא העליון לשפופרת צנטריפוגה חדשה. ניתן לאחסן את הליפוזומים ב-PBS במקרר למשך עד שבוע.

בצע פיזור אור דינמי (dynamic light scattering) על תערובת של 50 µL של תרחיף הליפוזומים המנוקה ו-950 µL של PBS. מדוד את גדלי החלקיקים וקבע את התפלגות הגדלים. כדי להתחיל בהליך הסימון הרדיואקטיבי, העבר למבחנה של 1.5 mL את הנפח הדרוש של ליפוזומים מנוקים ו-PBS, כדי להגיע לכמות של 2 mg של ליפידים.

הוסיפו לכך מיליקיורי אחד של zirconium-89 oxalate לנפח סופי של 100 µL ו-pH של 6.9 עד 7.1. ערבבו את התערובת בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים. לאחר מכן, הסירו zirconium-89 חופשי באמצעות סינון צנטריפוגלי עם יחידת סינון של 100 kDa ב-4,000 G. שטפו את השאריות (retentate) עם PBS סטרילי שלוש פעמים ב-4,000 G. לאחר מכן, דללו את השאריות לריכוז של כ-3 µCi ל-µL לצורך הזרקה.

השתמש ב-HPLC המבוסס על הפרדה לפי גודל (size-exclusion) בשילוב עם גלאי קרינה כדי לקבוע את הטוהר הרדיוכמי של הליפוזומים המסומנים רדיואקטיבית. אם הטוהר הרדיוכמי נמוך מ-95%, יש להכין מחדש את המנה. השתמש בפיזור אור דינמי (dynamic light scattering) כדי לוודא שערכי גודל החלקיקים וההתפלגות שלהם דומים לאלו של הליפוזומים שאינם מסומנים רדיואקטיבית.

כדי להתחיל בהליך הדימוי, הזרק כ-300 microcurie של ליפוזומים מסומנים רדיואקטיבית לווריד הזנב של עכבר עם מלנומה המוחזק בריסון. שתי דקות לאחר ההזרקה, השתמש במזרק אינסולין במידה 28 כדי לאסוף 10 עד 20 µL של דם מווריד הזנב של העכבר. העבר את דגימת הדם למבחנת ספירה שנשקלה מראש.

שקלו את דגימת הדם ומדדו את הפעילות באמצעות מונה גמא. חשבו את ריכוז הרדיואקטיביות כאחוז מהמנה המוזרקת לגרם. חמש עשרה דקות לאחר ההזרקה, אספו ומדדו דגימת דם נוספת באופן דומה.

לאחר מכן, הרדימו את העכבר על ידי מתן 2% isoflurane וחמצן באמצעות מסכת אף (nosecone). אספו ומדדו דגימת דם שלישית שעה אחת לאחר ההזרקה. לאחר מכן, אפשרו לעכבר להתאושש בכלוב התאוששות עד להשבת הניידות התקינה.

אספו דגימות נוספות ארבע, שמונה, 24 ו-48 שעות לאחר ההזרקה. אפשרו לעכבר להתאושש באופן מלא בין ההזרקות. שכן את העכבר בחדר המיועד לבעלי חיים להם ה diberikan חומרים רדיואקטיביים.

24 או 48 שעות לאחר הזרקת הליפוזומים, הרדימו את העכבר באמצעות 2% isoflurane וחמצן. הניחו את העכבר על בטנו על מיטת סורק microPET-CT לבעלי חיים קטנים. המשיכו בהגשת 2% isoflurane וחמצן באמצעות קונו לאף.

מרחו פומדת וטרינרית על עיני העכבר כדי למנוע מהן להתייבש. לאחר מכן, הכניסו את מיטת הסריקה אל המכשיר. בצעו סריקת PET סטטית של כל הגוף למשך 15 דקות עם לפחות 50 מיליון אירועי קואינסידנציה (coincident events), באנרגיה של 250 עד 700 kiloelectron volts, ובחלון תזמון קואינסידנציה של שש ננו-שניות.

בשלב הבא, בצעו סריקת CT למשך חמש דקות עם 120 שלבים סיבוביים על פני 220 מעלות, עם כ-145 milliseconds לכל פריים. עם השלמת הסריקה, הקריבו מיד את העכבר באמצעות חנק בפחמן דו-חמצני. ודאו את מותו על ידי צביטה בכף רגלו של בעל החיים, ולאחר מכן בצעו פריקה צווארית.

בצעו פרפוזיה לרקמות באמצעות PBS כדי להסיר דם, ואספו את דגימות הרקמה הרלוונטיות. שקלו את הרקמות שנאספו ומדדו את פעילותן. חשבו את הצטברות הליפוזומים המסומנים רדיואקטיבית ברקמה כאחוז מהמינון המוזרק לגרם.

יש לאחסן את רקמת הגידול ב-PBS קר. בצעו ציטומטריה של זרימה ex vivo ודימוי פלואורסצנציה אימונולוגית על רקמת הגידול שנאספה כדי למדוד את ההצטברות ביחס לאוכלוסיות התאים. דימוי PET/CT של עכברים הנושאים גידול שהוזרקו להם ננו-חלקיקים המסומנים ב-zirconium-89 הראה הצטברות משמעותית של ננו-חלקיקים ברקמת הגידול 24 שעות לאחר ההזרקה.

נמצא כי זמן מחצית החיים של הננו-חלקיקים בדם הוא כ-10 שעות. מדידות של התהלוּת הביולוגית (biodistribution) ex vivo שבוצעו 24 שעות לאחר ההזרקה, היו עקביות עם מדידות ה-PET/CT in vivo. לאחר מכן, נבדקה הצטברות הננו-חלקיקים ברמת התא הבודד באמצעות טכניקות של צביעה אימונוהיסטוכימית.

בדיקת ציטומטריית זרימה הצביעה על כך שננו-חלקיקים נוטים להצטבר באופן מועדף במקרופגים תומכי גידול. הדמיית אימונופלואורסצנציה של דגימות גידול הצביעה אף היא על מיקוד ספציפי של הננו-חלקיקים בתאי אנדותל. טכניקה זו יכולה לסייע לחוקרים לזהות תרופות ננומטריות מבטיחות למעבר ליישומים קליניים.

ברגע שהטכניקה נלמדת היטב, ניתן לבצעה בתוך שלושה ימים אם היא מבוצעת כראוי. בעת סימון רדיואקטיבי של ננו-תרופות, חשוב להחיל סטנדרטים גבוהים של בקרת איכות. בהתאם לנוהל זה, ניתן לסמן ננו-תרופות אחרות, כגון ננו-אמולסיות, ננו-חלקיקים פולימריים, מיצלות, נוגדנים ופרגמנטים של נוגדנים, על מנת למדוד את ביצועיהן in vivo בעכברים הנושאי גידולים.