Name: מערכת לסינון יעילות Cytotoxicity של מעכבי מיקוד תאי שחפת Mycobacterium (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: למד שיטת סינון יעילות גבוהה לזיהוי תרכובות חדשות נגד Mycobacterium tuberculosis בתוך מקרופאגים אנושיים. השיטה משלבת מבחן לומינסציה להערכת הישרדות חיידקים ומבחן ציטוטוקסיות לתאי מארח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

עבודה זו נתמכה על ידי איגוד הריאות של BC ו-Mitacs.

1. זן חיידקים וצמיחה בינוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך דקסטרוז אלבומין פתרון מניות מלח (ADS) על ידי solubilizing 25 גרם של אלבומין בסרום שור, 10.0 גרם של דקסטרוז, ו 4.05 גרם של נתרן כלורי ב 460 מ&quot;ל של מים ללא יונים. מסנן לעקר את המודעות ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 7H9 מרק ידי הוספת 4.7 גרם של 7H9 אבקה 2 מ&quot;ל של גליצרול כדי 900 מ&quot;ל של מים מטוהרים. החיטוי מרק 7H9 ב 121 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאפשר לו להתקרר לטמפרטורת החדר לפני שתמשיך. הפוך 7H9ADST ידי הוספת 100 מ&quot;ל של מודעות 0.5 מ&quot;ל של Tween80 כדי 900 מ&quot;ל של 7H9 מרק. חנות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול 50 מ&quot;ג של סולפט kanamycin ו להתמוסס 1 מ&quot;ל של מים ללא יונים; הריכוז הסופי הוא 50 מ&quot;ג / מ&quot;ל. מסנן לעקר ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. להוסיף 0.5 מ&quot;ל של Kanamycin פתרון מניות לכל 1 ליטר של 7H9ADST. הערה: בינוני זה צריך להיעשות טרי, כך לטפס על הכרכים כראוי בהתאם לגודל התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול מ שחפת ב 7H9ADST בתוספת kanamycin בעמידת התרבות. Shake התרבות היומי לדלל אותו לפני OD600 מגיע 1.0 להימנע clumping. הערה: זן שחפת המשמש לפיתוח שיטה זו H37Rv טרנספורמציה עם pJAK2.A פלסמיד 12. pJAK2.A הוא פלסמיד אינטגרטיבי המבוסס על וקטור pMV361, המאפשר ביטוי ברמה גבוהה של הגן בלוציפראז גחלילית מן האמרגן hsp60 וניתן לבחור באמצעות kanamycin. </li></ol> 2. THP-1 בינוני ותחזוקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 50 מ&quot;ל של סרום שור העובר חום מומת (FBS) ו 5 מ&quot;ל של 200 מ&quot;מ L- גלוטמין ל 500 מ&quot;ל של RPMI 1640 כדי להפוך RPMI בינוני שלם (כ 10% FBS ו 2 גלוטמין מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשמור על תרבית תאים THP-1 על פי פרוטוקול סטנדרטי 13. בקצרה, לגדל תאים THP-1 במדיום שלם RPMI תוך שמירה על צפיפות התאים שערכה 0.2 1 מיליון דולר מ&quot;ל של מדיום בין pasחכם. </li></ol> 3. תפוקה גבוהה הקרנת תאיים באמצעות H37Rv שחפת להביע בלוציפראז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את הצפיפות האופטית של השעיה חיידקי ומתרחבת ספקטרופוטומטר באורך גל של 600 ננומטר. חשב את צפיפות חיידקים באמצעות גורם המרה של 0.1 OD 600 = 3 x 10 7 חיידקים למ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה את החיידקים מספיק ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 10: 1 לתוך צינור צנטריפוגות חדשות. גלולה ב 3000 XG במשך 10 דקות לשאוב את הנוזל. להוסיף 50 μL של בסרום אדם 450 μL של RPMI1640. סולם נפח לנכס ערכים לצורך הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי opsonize החיידקים, להשעות את הגלולה בצפיפות של 1 x 10 8 חיידקים לכל 500 μL של RPMI1640 המכילים 10% בסרום אדם. אפשר התערובת כדי לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. קביעת צפיפות תרבית התאים THP-1 על ידי ספירה עם hemocytometer ו microsco הפוכהפ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולת התאים ב מבחנות צנטריפוגה סטריליים 100 XG ו 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לשאוב supernatant מחדש להשעות התאים RPMI שלם בצפיפות של 1 מיליון תאים למ&quot;ל. להוסיף phorbol-12-myristate-13-אצטט (PMA) לריכוז 40 ng / mL הסופי. הערה: זה יהיה המכונה תמהיל הבידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים שחפת opsonized עם תערובת בידול THP-1 בכל פנים של 10: 1 ו aliquot התמהיל הסופי 100 μL לכל היטב צלחת לבנה 96-היטב שטוחה תחתונה. באופן קבוע ומערבבים את התערובת על מנת להבטיח אחידות. אפשר בידול וזיהומים להמשיך לילה בשעה 37 ° C חממה humidified המכיל 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבארות פעמיים עם 100 μL של RPMI כל. הוספת תרכובות בדילול אל הריכוז הרצוי RPMI שלם דגירה במשך 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום מהבארות. להוסיף 50 μL של מגיב בדיקה לוציפראז היטב כל אחד. חותם את הצלחות עם tאיטום צלחת דבק ransparent. אפשר 5 דקות של דגירה על 22 מעלות צלזיוס ולאחר מכן לקבל הודעה בתוך luminometer ב 1 s לכל היטב. </li></ol> 4. ניתוח Cytotoxicity שימוש 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-י.ל) -2,5-diphenyltetrazolium ברומיד (MTT) Assay 14 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדו להבחין בתאי THP-1 ב RPMI בתוספת שלמה עם 40 ng / mL של PMA צלחות 96-היטב ברורות. לשמור על צפיפות התאים של 1 מיליון דולר מ&quot;ל ו aliquot 100 μL לכל טוב. אפשר בידול כדי להמשיך לילה בשעה 37 ° C חממה humidified המכיל 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום מבאר ולשטוף אותם פעמים עם RPMI 1640. הוספת תרכובות מדוללות RPMI שלמים אל הבארות. דגירה של 3 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 0.5 גרם של MTT ב 100 מ&quot;ל של בופר פוספט (PBS) כדי להפוך את פתרון המניות של 5 מ&quot;ג / מ&quot;ל. מסנן וחנות סטריליים -20 ° C, הרחק מאור; עדיף לעשות את הפתרון הזה טרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2.5 h beforדואר תום תקופת הדגירה 3 ימים, להוסיף 25 μL של פתרון MTT היטב כל ולהשלים את תקופת הדגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50% N, לפוראמיד -dimethyl N (DMF) על ידי ערבוב 250 מ&quot;ל של DMF עם 250 מ&quot;ל מים ללא יונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ החילוץ MTT כדלקמן: לשקול 100 גרם של SDS בבקבוק 500 מ&quot;ל ולהוסיף 300 מ&quot;ל של 50% DMF. החל חום נמוך כדי לאפשר SDS להתמוסס. להוסיף 10 מ&quot;ל של חומצה אצטית טהורה 12.5 מ&quot;ל של 1 M HCl. מלאו עד לציון 500 מ&quot;ל עם 50% DMF; ההרכב הסופי של חיץ החילוץ הוא 50% DMF, 20% SDS, 2.5% חומצה אצטית, ו 2.5% 1 חומצה הידרוכלורית M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתום תקופת הטיפול, להוסיף 100 μL של חיץ חילוץ (מחומם 45 מעלות צלזיוס כדי לפזר כל גבישים) זה טוב. אפשר תערובת כדי לדגור לילה בשעה 37 ° C חממה humidified המכיל 5% CO 2. קראו את הספיגה ב 570 ננומטר. הערה: assay cytotoxicity מבוצע טוב במקביל עם intracellמסך ular שימוש באותן-אצווה וגיל של תאים THP-1. </li></ol> 5.-מרק ניתוח פעילות באמצעות 3 Assay Resazurin <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול מ שחפת ב 7H9ADST לשלב אמצע יומן (~ 0.5 - .8 OD 600). לדלל את התרבות עם 7H9ADST כדי 0.01 OD 600. לדלל את התרכובות ב 7H9ADST פי 2 ריכוזי בדיקות aliquot 100 μL של כל תרכובת מדוללת לתוך זה גם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר 100 μL של השעית החיידקים מדולל לתוך זה גם. אפשר הצלחות לדגור על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified עבור 5 ימים. ממיסים 10 מ&quot;ג של resazurin ב 100 מ&quot;ל של מים ללא יונים ולסנן סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 30 μL של פתרון resazurin ולנטר את שינוי הצבע אחרי 48 h; התפתחות חיידקים מצוינת על ידי מרת צבע מכחול לורוד. הערה: ניתוח כמותי יכול להתבצע גם על ידי מדידת גם את הקרינה בבית 590 ננומטר עם עירור ב 530 - 560ננומטר או את הספיגה ב 570 ננומטר ו 600 15 ננומטר. </li></ol>

<ol><li>WHO. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Global+tuberculosis+report+2015%22">Global tuberculosis report 2015</a>. , WHO. (2016).</li>
<li>USFDA. FDA news realease. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm333695.htm">http://www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ucm333695.htm</a> (2012).</li>
<li>Yajko, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+method+for+determining+MICs+of+antimicrobial+agents+for+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Colorimetric method for determining MICs of antimicrobial agents for Mycobacterium tuberculosis.</a> J Clin Microbiol. 33, 2324-2327 (1995).</li>
<li>Khare, G., Kumar, P., Tyagi, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+screening-based+identification+of+inhibitors+against+the+intraphagosomal+survival+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Whole-cell screening-based identification of inhibitors against the intraphagosomal survival of Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 57, 6372-6377 (2013).</li>
<li>Andreu, N., Fletcher, T., Krishnan, N., Wiles, S., Robertson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+antituberculosis+drug+activity+in+vitro+and+in+macrophages+using+bioluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of antituberculosis drug activity in vitro and in macrophages using bioluminescence.</a> J Antimicrob Chemother. 67, 404-414 (2012).</li>
<li>Mak, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+screen+to+identify+inhibitors+of+ATP+homeostasis+in+non-replicating+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput screen to identify inhibitors of ATP homeostasis in non-replicating Mycobacterium tuberculosis.</a> ACS Chem Biol. 7, 1190-1197 (2012).</li>
<li>Pethe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+genetic+screen+in+Mycobacterium+tuberculosis+identifies+carbon-source-dependent+growth+inhibitors+devoid+of+in+vivo+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A chemical genetic screen in Mycobacterium tuberculosis identifies carbon-source-dependent growth inhibitors devoid of in vivo efficacy.</a> Nat Commun. 1, 57(2010).</li>
<li>Hmama, Z., Pena-Diaz, S., Joseph, S., Av-Gay, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoevasion+and+immunosuppression+of+the+macrophage+by+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">Immunoevasion and immunosuppression of the macrophage by Mycobacterium tuberculosis.</a> Immunol Rev. 264, 220-232 (2015).</li>
<li>Ramon-Garcia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+drug+combinations+for+tuberculosis+therapy+identified+by+a+novel+high-throughput+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Synergistic drug combinations for tuberculosis therapy identified by a novel high-throughput screen.</a> Antimicrob Agents Chemother. 55, 3861-3869 (2011).</li>
<li>Lam, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitazoxanide+stimulates+autophagy+and+inhibits+mTORC1+signaling+and+intracellular+proliferation+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Nitazoxanide stimulates autophagy and inhibits mTORC1 signaling and intracellular proliferation of Mycobacterium tuberculosis.</a> PLoS Pathog. 8, e1002691(2012).</li>
<li>Sorrentino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+Intracellular+Screen+for+New+Compounds+Able+To+Inhibit+Mycobacterium+tuberculosis+Growth+in+Human+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Development of an Intracellular Screen for New Compounds Able To Inhibit Mycobacterium tuberculosis Growth in Human Macrophages.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60, 640-645 (2015).</li>
<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+broad-range+of+recombination+cloning+vectors+in+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">A broad-range of recombination cloning vectors in mycobacteria.</a> Plasmid. 62, 158-165 (2009).</li>
<li>ATCC. THP-1 (ATCC TIB-202). , Manassas. 
 <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx">https://www.atcc.org/products/all/TIB-202.aspx</a> (2016).</li>
<li>Hansen, M. B., Nielsen, S. E., Berg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-examination+and+further+development+of+a+precise+and+rapid+dye+method+for+measuring+cell+growth%2Fcell+kill%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Re-examination and further development of a precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill.</a> J Immunol Methods. 119, 203-210 (1989).</li>
<li>Invitrogen. <a target="_blank" href="http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/PI-DAL1025-1100_TI%20alamarBlue%20Rev%201.1.pdf">AlamarBlue assay</a>. , Invitrogen. (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handbook+of+anti-tuberculosis+agents.+Introduction%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis+%28Edinb%29%22%5BJournal%5D)">Handbook of anti-tuberculosis agents. Introduction.</a> Tuberculosis (Edinb). 88 (2), 85-86 (2008).</li>
<li>Riss, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRiss%2C+TL+%22Cell+Viability+Assays%22">Cell Viability Assays</a>. , (2004).</li>
<li>Meyer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+efficacy+of+apramycin+in+murine+infection+models%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vivo efficacy of apramycin in murine infection models.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58, 6938-6941 (2014).</li>
<li>Ballell, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fueling+open-source+drug+discovery%3A+177+small-molecule+leads+against+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22ChemMedChem%22%5BJournal%5D)">Fueling open-source drug discovery: 177 small-molecule leads against tuberculosis.</a> ChemMedChem. 8, 313-321 (2013).</li>
<li>Grundner, C., Cox, J. S., Alber, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18752626">Protein tyrosine phosphatase PtpA is not required for Mycobacterium tuberculosis growth in mice.</a> FEMS Microbiol Lett. 287, 181-184 (2008).</li>
<li>Wong, D., Bach, H., Sun, J., Hmama, Z., Av-Gay, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+protein+tyrosine+phosphatase+%28PtpA%29+excludes+host+vacuolar-H%2B-ATPase+to+inhibit+phagosome+acidification%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis protein tyrosine phosphatase (PtpA) excludes host vacuolar-H+-ATPase to inhibit phagosome acidification.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 19371-19376 (2011).</li>
<li>Bach, H., Papavinasasundaram, K. G., Wong, D., Hmama, Z., Av-Gay, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis+virulence+is+mediated+by+PtpA+dephosphorylation+of+human+vacuolar+protein+sorting+33B%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis virulence is mediated by PtpA dephosphorylation of human vacuolar protein sorting 33B.</a> Cell Host Microbe. 3, 316-322 (2008).</li>
<li>Chanput, W., Peters, V., Wichers, H. <a target="_blank" href="http://edepot.wur.nl/374646">The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models</a>. , Springer International Publishing. 147-159 (2015).</li>
<li>Maess, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+transfection+of+human+THP-1+macrophages+by+nucleofection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.</a> J Vis Exp. , e51960(2014).</li>
<li>Ferguson, J. S., Weis, J. J., Martin, J. L., Schlesinger, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+protein+C3+binding+to+Mycobacterium+tuberculosis+is+initiated+by+the+classical+pathway+in+human+bronchoalveolar+lavage+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">Complement protein C3 binding to Mycobacterium tuberculosis is initiated by the classical pathway in human bronchoalveolar lavage fluid.</a> Infect Immun. 72, 2564-2573 (2004).</li>
<li>Andreu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimisation+of+bioluminescent+reporters+for+use+with+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimisation of bioluminescent reporters for use with mycobacteria.</a> PLoS One. 5, e10777(2010).</li>
<li>Queval, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microscopic+phenotypic+assay+for+the+quantification+of+intracellular+mycobacteria+adapted+for+high-throughput%2Fhigh-content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening.</a> J Vis Exp. , e51114(2014).</li>
<li>Christophe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+content+screening+identifies+decaprenyl-phosphoribose+2%27+epimerase+as+a+target+for+intracellular+antimycobacterial+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors.</a> PLoS Pathog. 5, e1000645(2009).</li>
<li>Pethe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+Q203%2C+a+potent+clinical+candidate+for+the+treatment+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Discovery of Q203, a potent clinical candidate for the treatment of tuberculosis.</a> Nat Med. 19, 1157-1160 (2013).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים כלכליים מתחרים לעבודה זו.

מטרת המחקר הנוכחי הייתה ליצור שיטת HTS פשוטה וחסכונית באמצעות מודל זיהום תאיים אדם עבור שחפת. שחפת היא מחלה אנושית מתאפיינת הזיהום של מקרופאגים המכתשית ידי מ שחפת. בשל בעיות בטיחות ביולוגיות, המחקר מעורב מודלים ביולוגיים של שני החיידק ואת תאי המארח נעשה שימוש בעבר. עם זאת, הוכיח כי השימוש של חיידקים פונדקאיים ומודלים לא אנושיים הם מנבאים עניים של להיט-to-Lead הצלחה בפיתוח תרופה, המציין כי הקרנת תרופה נעשית בצורה טובה ביותר עם תאים אנושיים נגועים שבחפת מ ...

שחפת Mycobacterium, הסוכן סיבתי של שחפת (TB), היא הסיבה המובילה לתחלואה ותמותה בעולם. Drug-רגיש TB היא מחלה שניתן לטפל הדורשת אנטיביוטיקה מרובה לתקופה של 6 חודשים. למרות היותו מחלה שניתן לטפל בה, תמותת TB נאמד ב -1.5 מיליון 2015 1. בשנת 10 השנים האחרונות, התרבו חששות השכיחים של שחפת עמידה לתרופות. Multidrug העמיד TB (MDR-TB) מוגדר TB כי הוא עמיד לפחות איזוניאזיד (INH) ו ריפמפיצין (RMP), ורוב זני MDR-TB הם עמידים גם לבחור סמי TB קו שני, ובכך להגביל את אפשרויות טיפול . ההשפעות של עמידות לתרופות ליצור אתגר גדול לטיפול בחולים במשותף נגועים בנגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV); 400,000 חולים ברחבי העולם מתו משחפת HIV הקשורים ב 2015 1. למרבה האכזבה, ארצות הברית המזון והתרופות Administיחס אישר תרופה חדשה TB אחד בלבד נגד MDR-TB, bedaquiline, ב 2 40 השנים האחרונות. מקדם במציאת טיפולי TB טובים יותר קצרים יותר יש צורך דחוף כדי להקדים במאבק נגד שחפת MDR-TB. באופן מסורתי, מסכי סמי TB מבוצעים בתנאי גידול במבחנה במדיום גידול, לפיו תרכובות מתווספות תרבות גוברת והאפקטיביות שלהם בביעור מיקרואורגניזמים נקבעות על ידי ספירת יחידות מושבה להרכיב (CFU) על מדיום מוצק. כמו ספירת CFU הם עבודה אינטנסיבית, גוזל זמן יקר, שיטות עקיפות שונות פותחו כדי להקל על בעיה זו. שיטות אלו כוללות את assay הכדאיות הכחולה Alamar 3, קביעה של קרינה 4 מ חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או הארה 5 מחיידקים להביע בלוציפראז, ואת הערכת אדנוזין אדנוזין הכולל (אTP) 6, 7. TB האופיינית מאופיינת זיהום שחפת של הריאות, שבו החיידקים מתגוררים ולשכפל בתוך phagosomes של מקרופאגים המכתשית 8. מסך פנוטיפי ב-מרק פשוט עשוי להתאים פתוגנים תאיים; עם זאת, בפרספקטיבה היסטורית, פגע תרכובות נגד שחפת מזוהה בשיטה זו לעיתים קרובות אינם מצליחים לעמוד בציפיות במהלך השלבים אימות במורד הזרם מודלים זיהום. אנו מציעים כי תרופת TB מבוצעת טוב מודל זיהום תא מארח תאי. עם זאת, מודלים תאיים בעלי חסמים טכנולוגיים ביולוגיים רבים לפיתוח הקרנת תפוקה גבוהה (HTS). מכשול גדול הוא המורכבות של תהליך ההדבקה, שהודגם על ידי צעדים רבים וההסרה המשוכללת של חיידקים תאיים על ידי ב-בין הכביסה. משוכה משמעותית שנייה היא מחדש הזמן הממושךquirements, כמו גילוי גידול, בדרך כלל נעשה על ידי CFU לספור על צלחות תרבות, הוא תהליך שלוקח מעל 3 שבועות כדי להשלים. פתרון אחד כדי להחליף ספירת CFU סופק על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי האוטומטי בשילוב עם חיידקים פלורסנט. עם זאת, פתרון זה דורש השקעה בציוד ראשונית כי הוא מחוץ להישג ידם של מעבדות מחקר רבות. פשוט, בעלות נמוכה, ושיטת HTS הרלוונטית-מחלה היו מאוד לשפר את תהליך גילוי תרופות. במחקר זה, אנו מדווחים מערכת HTS חדשה, מודולרי, המכוונת מתן מהיר, ו מדרגית, עדיין חסכוני, assay מתאים לקביעת הפעילות של תרכובות נגד שחפת תאיים. מערכת זו מורכבת משלושה מודולים: (i) תאי, (ii) רעיל לתאים, וכן (iii) מבחנים-מרק. התוצאה הסופית בשילוב מספקת תיאור מקיף של התכונות המתחמות, עם מידע נוסף לגבי מצב פוטנציאלי פעולה. SC זהreening מערכת נעשה שימוש במספר פרויקטים עם ספריות מתחמות שונות למקד במצב של פעולה, כוללים הניתוח של סינרגיה סמי 9, הגירוי של autophagy 10, ואת העיכוב של שחפת -secreted גורם ארסי (לא פורסם). תרכובות של מצב ידוע של פעולה גם נחקרו 11. גרסה שונה של שיטה זו אומצה גם על ידי שיתוף הפעולה עם התעשייה שלנו כשיטת ההקרנה העיקרית לזהות תרכובות חדשות נגד שחפת תאיים מ 11.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5886</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>271210</td><td></td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164</td><td></td></tr><tr><td>Albumin, בקר pH7</td><td>Affymetrix</td><td>10857</td><td></td></tr><tr><td>דקסטרוז</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP350</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>קנמיצין סולפט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP906</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M2128</td><td></td></tr><tr><td>N,N- דימתילפורממיד (DMF)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>D131</td><td></td></tr><tr><td>1 M חומצה הידרוקולורית (HCl)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>351279212</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>351269</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>רזזורין</td><td>אלפא אסאר</td><td>B21187</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>THP-1</td><td>אוסף תרבות מסוג אמריקאי</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>M. שחפת H37Rv</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 בארות צלחת לבנה תחתונה שטוחה</td><td>קורנינג</td><td>3917</td><td></td></tr><tr><td>95 בארות צלחת שקופה תחתונה</td> שטוחה <td>קורנינג</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>אוטם צלחת שקופה</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>AB-0580</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>ביומט 3</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר מיקרופלייט</td><td>ביוטק</td><td>עידן</td><td></td></tr><tr><td>לומינומטר</td><td>יישומי ביוסיסטמס</td><td>Tropix TR717</td><td></td></tr></tbody></table>

מערכת לסינון יעילות cytotoxicity של מעכבי מיקוד תאי<em&gt; שחפת mycobacterium</em

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, הגורם לשחפת, הוא גורם מוביל לתחלואה ותמותה ברחבי העולם. עם ההתפשטות המוגברת של שחפת עמידה לתרופות מרובות (MDR-TB), יש דחיפות אמיתית לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות נגד זיהומי שחפת. באופן מסורתי, תרכובות מוערכות על סמך פעילותן האנטיבקטריאלית בתנאי גידול במבחנה במרק; עם זאת, לעתים קרובות התוצאות מטעות עבור פתוגנים תוך-תאיים כמו שחפת, שכן תנאי הסקר הפנוטיפיים במרק שונים באופן משמעותי ממצבי המחלה בפועל בגוף האדם. סינון מעכבים הפועלים בתוך מקרופאגים היה קשה באופן מסורתי בשל המורכבות, השונות בזיהום וקצב השכפול האיטי של M. tuberculosis. במחקר זה, אנו מדווחים על גישה חדשה להערכה מהירה של יעילות התרכובות על הכדאיות של M. tuberculosis במודל זיהום מקרופאגים. באמצעות שילוב של בדיקת ציטוטוקסיות ובדיקת כדאיות M. tuberculosis בתוך המרק, הצלחנו ליצור מערכת סינון המייצרת ניתוח מקיף של תרכובות מעניינות. מערכת זו מסוגלת לייצר נתונים כמותיים בעלות נמוכה הנמצאת בהישג ידן של רוב המעבדות ועם זאת ניתנת להרחבה גבוהה כדי להתאים לסביבות תעשייתיות גדולות.

תפוקה גבוהה הקרנה תאית באמצעות שחפת לבטא את הגן בלוציפראז איור 2A ולוח 1 מכילים את הנתונים הגולמיים שנאספו על ידי luminometer, המבוטא ביחידות זורחות יחסית (RLU), מראים את ההשפעה של ריכוז גדל והולך של ריפמפיצין סמי TB על שחפת בתוך תאי THP-1. איור 2 א היא פיזור עלילה של הארת הגלם נמדדת...

פתחנו מערכת הקרנה מודולרית תפוקה גבוהה לגילוי תרכובות רומן נגד שחפת Mycobacterium, מיקוד תאי ב-המרק גובר חיידקים כמו גם רעילה לתאים נגד התא המארח היונק.

מערכת לסינון יעילות Cytotoxicity של מעכבי מיקוד תאי<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לספק הערכה רב-ממדית של האופן שבו תרכובות משפיעות על הישרדות של M.tuberculosis בתוך מקפגים אנושיים. שיטה זו מתבססת על בדיקת יעילות המבוססת על לוסיפראז. כאשר היא משולבת עם בדיקת ציטוטוקסיות, בדיקת MIC יכולה לספק מידע שימושי לשיפור של תרכובות HIT בפיתוח תרופות לשחפת.היתרון המרכזי של השיטה שלנו הוא חיסכון בזמן ובכוח אדם. היא מחליפה את בדיקת CFU (יחידות יוצרות מושבות) בבדיקה מבוססת לוסיפראז. בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את הטכניקה הזו יתקשו להשיג עקביות בפיפטאージュ ידני לעומת אוטומציה.טכניקת פיפטור נסמכת היא קריטית. גדלו תאי THP1 ב-RPMI במצע מלא, תוך שמירה על צפיפות תאים של 0.2 עד מיליון תאים למיליליטר של מצע בין מעברים.השתמש בספקטרופוטומטר כדי למדוד את ה-OD600 של תרחיף חיידקים בצמיחה פעילה. לאחר מכן, חשב את צפיפות החיידקים באמצעות מקדם ההמרה שבו 0.1 OD600 שווה ל-3×10⁷ חיידקים למילליליטר. העבר בפיפט כמות מספקת של חיידקים עבור MOI של 10 ל-1 אל תוך מבחנה לצנטריפוגה חדשה.לאחר מכן, השקיעו את החיידקים בצנטריפוגה ב-3,000 ×g למשך 10 דקות. כדי לבצע אופסוניזציה לחיידקים, הוסיפו 50 µL של סרום אנושי ל-450 µL של RPMI 1640 והשתמשו בתמיסה זו כדי לסספנד מחדש את משקע החיידקים בריכוז של 1×10⁸ חיידקים ל-500 µL של מצע. הניחו לתערובת להדגיר בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות.בשלב

system-for-efficacy-cytotoxicity-screening-inhibitors-targeting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים בדיקה להערכת יעילות התרופות נגד זיהום Mycobacterium tuberculosis (Mtb).  נוצר מודל זיהום במבחנה המכיל אגרגטים Mtb/מקרופאגים המחקה זיהום in vivo. עם החדרת אנטיביוטיקה מתאימה, יעילותם נבדקת באמצעות בדיקת resuzarin כדי לפקח על הישרדותם של חיידקים עם ריכוזי תרופות עולים.

בדיקה להערכת יעילות התרופה נגד מודל זיהום Mycobacterium tuberculosis

סרטון זה מדגים בדיקה במרק כדי לקבוע יעילות אנטיביוטית נגד Mycobacterium tuberculosis. תרבית החיידקים מודגרת בריכוזים שונים של אנטיביוטיקה קוטלת חיידקים. יעילות קוטל החיידקים נמדדת על ידי הערכת נוכחותם של חיידקים ברי קיימא באמצעות בדיקת רזזורין.

הערכת היעילות של תרכובת בדיקה נגד מיקובקטריה במרק

כאן, אנו מתארים בדיקה פנוטיפית החלה על מסכי תפוקה גבוהה / תוכן גבוה של RNA סינתטי קטן מפריע (siRNA), תרכובת כימית, וספריות מוטציה שחפת Mycobacterium. שיטה זו מסתמכת על זיהוי של שחפת Mycobacterium שכותרתו פלואורסצנטית בתוך תא מארח שכותרתו פלואורסצנטית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית אוטומטית.

בדיקה פנוטיפית מיקרוסקופית לכימות של מיקובקטריה תאית המותאמת להקרנה בתפוקה גבוהה/תוכן גבוה

ה-charcoal agar resazurin assay (CARA) היא שיטה כמותית למחצה, תפוקה בינונית להערכת הפעילות של סוכני בדיקה כנגד מיקובקטריות המשכפלות, אינן משתכפלות או שניהם.  ה-CARA מאפשר הערכה מהירה של פעילות תלוית זמן וריכוז ומזהה פרמטרים שיש לעקוב אחריהם על ידי מבחני יחידת יצירת מושבה (CFU).

ויזואליזציה של Assay Resazurin פחם אגר עבור וכמותיות, ספירת בינוני תפוקה של Mycobacteria

בדיקה בתפוקה גבוהה בזמן אמת פותחה כדי לזהות בו זמנית (1) אנטי-מיקרוביאלים חודרי תאים אוקריוטיים המכוונים לפתוגן חיידקי תוך תאי, ו-(2) להעריך ציטוטוקסיות של תאים אוקריוטיים. וריאציה על אותה טכנולוגיה שולבה לאחר מכן עם טכנולוגיית חלוקה דיגיטלית כדי לאפשר מחקרי סינרגיה קלים, ברזולוציה גבוהה, מינון-תגובה וסינרגיה דו-ממדית ותלת-ממדית.

תפוקה גבוהה, בזמן אמת, בדיקת Dual-readout של פעילות מיקרוביאלית תאיים Cytotoxicity Cell איקריוטיים

מודלים ומבחנים חדשים שישפרו את תהליך פיתוח התרופות המוקדם לתרופות נגד שחפת מהדור הבא הם רצויים מאוד. כאן, אנו מתארים בדיקה מהירה, זולה ותואמת BSL-2 להערכת יעילות התרופה נגד Mycobacterium tuberculosis שניתן להתאים בקלות לבדיקה בתפוקה גבוהה.

Assay תואם תפוקה גבוהה כדי להעריך יעילות התרופה נגד Macrophage passaged<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

כימות מהיר ויעיל של גדילת שחפת M. תוך תאית הוא חיוני להמשך טיפולים משופרים נגד שחפת ( שחפת ). פרוטוקול זה מתאר בדיקת זיהוי קולורימטרית מבוססת מרק באמצעות מערכת תרבית נוזלית אוטומטית כדי לכמת את גידול ה-Mtb במקרופאגים שטופלו בטיפולים מוכווני מארח מועמדים.

מערכת תרבית אוטומטית לשימוש בבדיקות פרה-קליניות של טיפולים מכווני מארח לשחפת

קביעת יחידות יוצרות מושבות (CFU) היא הטכניקה הסטנדרטית לכימות חיידקים, כולל Mycobacterium tuberculosis אשר יכול לקחת שבועות כדי ליצור מושבות גלויות. כאן אנו מתארים מיקרו-CFU לקביעת CFU עם יעילות זמן מוגברת, שטח מעבדה מופחת ועלות מגיב, ומדרגיות לניסויים בתפוקה בינונית וגבוהה.

בדיקת יחידה להקמת מושבות מיקרו להערכת יעילות חיסונים נגד שחפת

מחקר זה פיתח בדיקה לסינון בתפוקה גבוהה נגד Mycobacterium abscessus עם זן כפול של כתב שנוצר לאחרונה, תוך שימוש בפלואורסצנטיות ולומינסנציה כדי להעריך את כדאיות החיידקים במהירות. פרוטוקול זה יהיה רלוונטי לחוקרים השואפים לסנן תרופות חדשות נגד חיידק עמיד לתרופות.

פיתוח Assay לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה נגד מיקובקטריה

כאן אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי מועמדים פוטנציאליים לתרופות נגד שחפת באמצעות סקר פנוטיפי, הכולל סינתזה כימית של תרכובת 4-אמינוקווינולין, קביעת ריכוז המעכב המינימלי שלה נגד מיקובקטריום טוברקולוזיס, והערכת הציטוטוקסיות שלה בקווי תאים יונקים.

זיהוי מועמדים פוטנציאליים לאנטי-שחפת: מדריך שלב אחר שלב לסינתזה, קביעת MIC והערכת ציטוטוקסיות בתאי יונקים

למד שיטת סינון יעילות גבוהה לזיהוי תרכובות חדשות נגד Mycobacterium tuberculosis בתוך מקרופאגים אנושיים. השיטה משלבת מבחן לומינסציה להערכת הישרדות חיידקים ומבחן ציטוטוקסיות לתאי מארח.

מערכת לסינון יעילות Cytotoxicity של מעכבי מיקוד תאי

גלה סרטונים נוספים