מערכת לסינון יעילות Cytotoxicity של מעכבי מיקוד תאי

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא לספק הערכה רב-ממדית של האופן שבו תרכובות משפיעות על הישרדות של M.tuberculosis בתוך מקפגים אנושיים. שיטה זו מתבססת על בדיקת יעילות המבוססת על לוסיפראז. כאשר היא משולבת עם בדיקת ציטוטוקסיות, בדיקת MIC יכולה לספק מידע שימושי לשיפור של תרכובות HIT בפיתוח תרופות לשחפת.

היתרון המרכזי של השיטה שלנו הוא חיסכון בזמן ובכוח אדם. היא מחליפה את בדיקת CFU (יחידות יוצרות מושבות) בבדיקה מבוססת לוסיפראז. בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את הטכניקה הזו יתקשו להשיג עקביות בפיפטאージュ ידני לעומת אוטומציה.

טכניקת פיפטור נסמכת היא קריטית. גדלו תאי THP1 ב-RPMI במצע מלא, תוך שמירה על צפיפות תאים של 0.2 עד מיליון תאים למיליליטר של מצע בין מעברים.

השתמש בספקטרופוטומטר כדי למדוד את ה-OD600 של תרחיף חיידקים בצמיחה פעילה. לאחר מכן, חשב את צפיפות החיידקים באמצעות מקדם ההמרה שבו 0.1 OD600 שווה ל-3×10⁷ חיידקים למילליליטר. העבר בפיפט כמות מספקת של חיידקים עבור MOI של 10 ל-1 אל תוך מבחנה לצנטריפוגה חדשה.

לאחר מכן, השקיעו את החיידקים בצנטריפוגה ב-3,000 ×g למשך 10 דקות. כדי לבצע אופסוניזציה לחיידקים, הוסיפו 50 µL של סרום אנושי ל-450 µL של RPMI 1640 והשתמשו בתמיסה זו כדי לסספנד מחדש את משקע החיידקים בריכוז של 1×10⁸ חיידקים ל-500 µL של מצע. הניחו לתערובת להדגיר בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות.

בשלב הבא, השתמשו במערך ספירת תאים (hemocytometer) ובמיקרוסקופ הפוך כדי לקבוע את צפיפות תרבית תאי ה-THP1. לאחר מכן, בתוך מבחנות צנטריפוגה סטריליות, השקיעו את התאים ב-100 $\times$g בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות. שאבו את הנוזל העליון (supernatant) והשביו את התאים ב-RPMI במדיום מלא בצפיפות של מיליון תאים ל-mL.

הוסיפו PMA עד לריכוז סופי של 40 nanograms per milliliter. תערובת זו היא תערובת בידול. ערבבו M.tuberculosis שעבר אופסוניזציה עם תערובת בידול של THP1 ביחס MOI של 10 ל-1.

העבירו מנות של 100 µL מהתערובת הסופית לכל באר בפלטה לבנה בעלת תחתית שטוחה עם 96 באערים. לאחר מכן, הניחו לדפנציה ולהדבקה להדגר בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לח הכולל 5% carbon dioxide למשך הלילה. למחרת, השתמשו ב-100 µL של RPMI כדי לשטוף את הבאערים פעמיים.

לאחר מכן, הוסיפו תרכובות מדוללות לריכוזים הרצויים ו-RPMI במדיום מלא. הדגרירו את הפלטות למשך שלושה ימים. בעת שימוש בפיפטות רב-ערוציות, הקפידו על לחיצה איטית ויציבה של הבוכנה והניחו תמיד את קצות הפיפטה באותה נקודה בתוך כל באר כדי למזער את ההפרעה לתאי ה-THP1.

לאחר הדגירה, שאבו את המצע מהבארים והוסיפו 50 µL של ריאגנט לבדיקת לוסיפראז לכל באר. לאחר מכן, השתמשו במדבקות איטום שקיפות לאיטום הפלטות. דגרו את הפלטות בטמפרטורה של 22 °C למשך חמש דקות, ולאחר מכן השתמשו בלומינומטר כדי לקבל קריאה של שנייה אחת לכל באר.

כדי לגומה תאי THP1, לאחר הכנת תערובת הגיומה כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה, חלק 100 µL מתערובת הגיומה לתוך כל באר בלוח 96 באערים שקוף המכיל תאים. דגור את התאים בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לח עם 5% carbon dioxide למשך הלילה. למחרת, שאב את המצע מהבארים והשתמש ב-RPMI 1640 כדי לשטוף אותן פעמיים.

הוסיפו לבארות 100 µL של תרכובות המדוללות ב-RPMI חסר. לאחר מכן, דגרו את התאים למשך שלושה ימים. המיסו 0.5 g של MTT ב-100 mL של PBS כדי להכין תמיסת מומנה בריכוז של 5 mg/mL.

לאחר מכן, בצעו סטריליזציה של התמיסה באמצעות סינון. שעתיים וחצי לפני סיום תקופת הדגירה של שלושה ימים, הוסיפו 25 µL של תמיסת MTT לכל באר של תאים והשלימו את תקופת הדגירה. הכינו 50% N,N-dimethylformamide או DMF על ידי ערבוב של 250 milliliters של DMF עם 250 milliliters של מים דה-יוניים.

הכינו את תמיסת המיצוי של MTT באופן הבא. הניחו 100 גרם SDS בבקבוק של 500 מיליליטר והוסיפו 300 מיליליטר של 50%DMF. השתמשו בחום נמוך כדי לאפשר ל-SDS להתמוסס.

הוסף 10 milliliters של חומצה אצטית טהורה ו-12.5 milliliters של חומצה כלורית בריכוז one molar. לאחר מכן, השלם את נפח הבקבוק עד לסימון של 500 milliliter באמצעות 50%DMF. בתום תקופת הטיפול, הוסף 100 microliters של בופר מיצוי לכל באר.

דגרו את התערובת בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לח הכולל 5% carbon dioxide למשך לילה. למחרת, קראו את הבליעה ב-570 nm. כדי לבצע בדיקת resazurin, גדלו M.tuberculosis ב-7H9 ADST עד לשלב ה-midlog.

דללו את התרבית באמצעות 7H9 ADST עד ל-OD600 של 0.01. השתמשו ב-7H9 ADST כדי לדלל את התרכובות לרכזים כפולים מרכז חשיפה. העבירו מנה של 100 microliters מכל תרכובת מדוללת לכל באער בלוח 96 באערים שקוף.

העבירו 100 µL של תרחיף החיידקים המדולל לכל באר. דגרו את הפלטות בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לח במשך חמישה ימים. המיסו 10 mg של resazurin ב-100 mL של מים דה-יוניים.

וסטריליזציה של התמיסה באמצעות סינון. הוסיפו 30 µL של תמיסת רזזורין (resazurin) לבארי. לאחר מכן, דגרו את התאים למשך 48 שעות.

צמיחה של חיידקים מסומנת על ידי שינוי צבע מכחול לוורוד. בצע ניתוח כמותי בהתאם לפרוטוקול הכתוב. תרשים פיזור זה מציג את נתוני הלומניסצנציה הגולמיים שנמדדו ביחידות לומניסצנציה יחסיות עבור טיפול בריכוזים שונים של rifampicin בתאי M.tuberculosis ו-THP1.

בגרף זה מוצגים אחוזי ההפחתה והלומננסיה בבארים שעברו טיפול בהשוואה לבארים שלא טופלו. Rifampicin מסוגל להפחית 99.9% מיחידות האור היחסיות, או RLUs, מ-M.tuberculosis תוך-תאי בריכוז של 0.1 micrograms per milliliter. תוצאה זו דומה לתוצאות שפורסמו בעבר שנקבעו על פי CFU.

באיור זה מוצגת הציטוטוקסיות הנגרמת על ידי ריכוזים עולים של G1-1H שנעשה בהם שימוש בבדיקת MTT. ריכוזים של 10 ושלושה מיקרו-מול נמצאים בבירור מתחת לסף ה-IC 50. איור זה מראה את ההשפעות של ריכוזים שונים של האנטיביוטיקה apramycin על המרת רזאזורין על ידי M.tuberculosis.

ה-MIC90 במצע נוזלי היה בין 2.5 לחמישה µg/mL. ערך זה גבוה במעט מהערך שפורסם בעבר, 1.5 µg/mL, אך הוא עדיין נמצא היטב בטווח הקביל.

כפי שהודגם כאן, התאיידות הופכת למשמעותית בכל הניסויים הכוללים זמני דגירה ממושכים. לכן, יש להקפיד על לחות גבוהה בדגריות כדי למנוע אי-עקביות. לאחר שילטהו בטכניקה זו, היא יכולה לספק נתונים תוך-תאיים מהימנים בתוך ארבעה ימים בלבד.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לנהוג בעדינות עם תאי THP1, ולהקפיד על עקביות בפיפטינג במידה ומבצעים זאת ללא אוטומציה. לאחר ביצוע פרוצדורה זו, ניתן להשתמש בשיטות אחרות, כגון סריקה בעלת תוכן גבוה (high content screening), כדי לקבוע אם התרכובות שהתגלו הן בקטריוסטטיות או בקטריצידיות. לאחר פיתוחו, סלל פרוטוקול זה את הדרך עבור חוקרים בתחום הגילוי של תרופות לשחפת להערכה מהירה של יעילות תרכובות נגד MTB בתוך מקרופאגים אנושיים.

אל תשכחו שהעבודה עם microbacterium tuberculosis היא מסוכנת. השתמשו באמצעי זהירות ובציוד מתאים בעת טיפול במיקרואורגניזם זה.