שיטות העצמי הוא השילוב של Biopolymers Megamolecular על ממשק האוויר-LC הייבוש
7 באפריל 2017
שיטה לשילוב עצמי מושרה-הייבוש של biopolymers megamolecular על ממשק הגבישים-נוזלי אוויר מסופקת כאן. מתודולוגיה זו תהיה שימושית לא רק להבנת הפוטנציאלים מקרוסקופית של biopolymers, אלא גם כשיטת הערכה לחומרים רכים בתחומי ביו וסביבתיים.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא להעריך את ההשפעה של אוויר ייבוש גבישי נוזלי או ממשק אוויר-LC על אוריינטציה של ביופולימרים מגה-מולקולריים כגון פוליסכרידים, מיקרו-צינורות ו-DNA כהתנהגויות דינמיות חזותיות בקנה מידה מילימטרי. מסר זה יכול לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי המבנה המפזר כגון ארגון עצמי של ביופולימרים בסביבה מתייבשת שבה אורגניזמים חיים זחלו על הקרקע לפני כ-500 מיליון שנה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מאפשרת לקחת תצוגות צד של הדגימה בתהליך הייבוש מבלי להתייבש במישור האופקי.
כדי להתחיל בהליך זה, הוסף 0.5 גרם סאקרה ל 100 מיליליטר מים. מכסים את המיכל בניילון נצמד ומערבבים את התמיסה בחום של כ- 80 מעלות צלזיוס למשך יותר מ -12 שעות. לאחר מתן אפשרות לתמיסות מסטיק הסאקרה והקסנתם להתקרר, צנטריפוגה את תמיסת הסאקרה כדי להסיר זיהומים.
כעת, הכינו תמיסת טובולין של 0.5 אחוז משקל במאגר בריטון-רובינסון על קרח. מערבבים 50 מיקרוליטר מתמיסת הטובולין עם 5 מיקרוליטר GpCpp. לאחר מכן דגרו את התמיסה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות כדי לקבל מיקרו-צינורית יציבה או גרעין MT.
לאחר מכן, מערבבים 950 מיקרוליטר מתמיסת הטובולין ו -50 מיקרוליטר של תמיסת הטובולין המכילה GpCpp. לאחר מכן, אפשר לתמיסה לשבת במשך יום אחד בכ-25 מעלות צלזיוס כדי לקבל תמיסת MT יציבה של 0.5 אחוז משקל. לאחר מכן, הכינו תמיסת DNA של 0.5 אחוז משקל ותמיסת חיץ Tris-EDTA.
שמור את תמיסות הדגימה הביופולימרית במשקל 0.5 ב-25 מעלות צלזיוס לניסוי הייבוש. חותכים יריעת סיליקון לצורה מתאימה בעובי של מילימטר אחד. הרכיבו תא פתוח בצד אחד המורכב ממרווח הסיליקון ושתי שקופיות זכוכית ללא שינוי.
תקן את שני צידי התא בעזרת קליפסים כפולים כדי למנוע מהתמיסות לדוגמה לדלוף החוצה. בעזרת קצה פיפטה בגודל נקבוביות של מילימטר אחד, הוסף לאט לאט 100 עד 300 מיקרוליטר מכל תמיסת ביופולימר של 0.5 אחוז משקל לכל תא בכ-25 מעלות צלזיוס. הסר בועות אוויר מהתא באמצעות מחט מזרק.
לאחר מכן, הכניסו את התאים לתנור עם סירקולטור אוויר למשך 18 שעות בחום של 60 מעלות צלזיוס בלחץ אטמוספרי לאידוי. כיוון פעולה מנוגד לזה של כוח הכבידה. מיקום זה מיושם גם על הניטור עבור הסקירות האחרונות.
השתמש במנורת הלוגן של 100 וואט עם מקור אור משטח שטוח על פני שטח רחב כדי לספק אור נראה ישר. כוונן את המקטבים ל-45 מעלות ו-135 מעלות באמצעות המחזיקים. תקן את מיקומי מקור האור, המקטבים, שלב הדגימה והמצלמה באמצעות מסילה אופטית ועמדת מוט.
הנח את שלב הדגימה בין שני המקטבים. לאחר מכן, מקם את המצלמה במרחק של כ-20 סנטימטרים משלב הדגימה כדי לאפשר מיקוד. בזמנים הנתונים המצוינים בפרוטוקול הטקסט, הנח את דגימות הביופולימר בין המקטבים על הבמה במקביל למישור ה- XZ וכסה את המכשיר בווילון שחור.
לבסוף, צלם את הדגימות דרך מקטבים חוצים ליניאריים באמצעות מצלמת רפלקס דיגיטלית עם עדשה אחת עם עדשת זום סטנדרטית. הוערכה אינטגרציה עצמית ממיקרו-דומיין למקרו-דומיין בממשק ייבוש אוויר-LC. לפני הייבוש נצפו אזורים בהירים עם אור מועבר במצב מפוזר.
לאחר הייבוש, האזור שמתחת לממשק האוויר-LC ותמיסת הסאקרה הפך גבוה ועוצמת תמיסת הקסנטין פחתה עם מקרו-דומיינים קטנים. ניתוח מרחבי-זמני הראה כי עוצמת השיא סביב ממשק נוזל האוויר והעובי גדלו, מה שמצביע על כך שהמיקרו-דומיינים מתחילים להתמצא מממשק האוויר-LC ולצמוח לתחום בקנה מידה מילי-מקביל לממשק. תמונות מיקרוסקופיות של קיטוב של שלב נוזל הסקרנה הראו אזור כחול אחד, כלומר נוצר מקרו-דומיין יחיד.
שלב נוזל קסנטן גאם הראה אזורים כחולים, צהובים וורודים, כלומר המקרו-דומיינים המרובים נוצרו בכיוונים שרירותיים. לפני הייבוש, תמיסות הסאקרה וה-MT הראו מצבי LC דומים עם תחומים מפוזרים. במהלך הייבוש, פתרון ה-MT עבר אינטגרציה עצמית והדומיינים המפוזרים שולבו במקרו-דומיין יחיד.
תמיסת ה-DNA לא הראתה כיוון ספציפי בשלב הנוזלי. שיא הייבוש של הסאקרה הראה שבירה כפולה משמעותית וצרורות גליים נצפו עבור רשומת הייבוש של MT. תיעוד ייבוש ה-DNA הראה מקרו-דומיינים בצורת גרגר בכיוונים שרירותיים.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום ההנדסה הביו-רפואית המשתמשים בביופולימרים לחקור הדמיה של דינמיקת זרם האוויר על תהליכי הייבוש וההרטבה בגישות גיאומטריות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה לשילוב עצמי המושרה על ידי ייבוש של ביופולימרים מגאו-מולקולריים בממשק אוויר-נוזל גבישי. הטכניקה נועדה להבנת התנהגותם של ביופולימרים בסביבת ייבוש, דבר הרלוונטי הן ליישומים ביו-רפואיים והן ליישומים סביבתיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביופולימרים
- חומרים רכים
- יישומים ביו-רפואיים
רקע
- ביו-פולימרים מגא-מולקולריים כוללים פוליסכרידים, מיקרוטובוליים ו-DNA.
- הבנתה של הארגון העצמי של ביו-פולימרים היא קריטית לתחומי מדעים שונים.
- מחקר זה בוחן את הדינמיקה של ביו-פולימרים תחת תנאי ייבוש.
- הטכניקה מאפשרת תצפיות מהצד של הדגימות במהלך תהליך הייבוש.
מטרת המחקר
- להערכת השפעת הממשק בין האוויר לגביש הנוזלי (LC) על אוריינטציית הביו-פולימרים.
- לוויזואליזציה של התנהגויות דינמיות של ביו-פולימרים בקנה מידה של מילימטרים.
- למענה על שאלות הנוגעות לארגון עצמי של ביו-פולימרים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת תמיסת sacran על ידי המסה של 0.5 גרם ב-100 מיליליטר מים.
- ערבוב התמיסה בטמפרטורה של כ-80 °C למשך למעלה מ-12 שעות.
- סנטריפוגציה של תמיסת ה-sacran להסרת זיהומים.
- תצפית על התנהגות הביופולימר במהלך תהליך הייבוש.
תוצאות עיקריות
- התנהגויות דינמיות של ביופולימרים הודגמו ויזואלית בהצלחה.
- תהליך הייבוש השפיע על האוריינטציה של הביופולימרים.
- מבטים מהצד סיפקו תובנות ייחודיות לגבי תהליך האינטגרציה העצמית.
- לשיטה זו פוטנציאל ליישומים בתחומים שונים.
מסקנות
- שיטת השילוב העצמי המושרה על ידי ייבוש יעילה לחקר ביופולימרים.
- טכניקה זו עשויה לשפר את ההבנה של התנהגות ביופולימרים בסביבות טבעיות.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול התקדמות במחקר ביו-רפואי וסביבתי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
שיטה זו מאפשרת ויזואליזציה של השתלבות עצמית של ביופולימרים מגא-מולקולריים בממשק גבישי נוזל-אוויר במהלך ייבוש, ומספקת תובנות לגבי התנהגות של חומרים רכים הרלוונטית ליישומים ביו-רפואיים וסביבתיים. באמצעות לכידה של שינויים מרחביים-זמניים בסדר האוריינטציה תחת אידוי מבוקר, היא תומכת בהסרה של סיכונים מכניסטיים באפיון ראשוני של ביופולימרים. גישה זו מספקת פלטפורמה ניתנת להרחבה וללא סימון להערכת הארגון של ביופולימרים מבלי להפריע למצבים טבעיים, ובכך היא עונה על צרכים של תיקוף יעדים ופיתוח בדיקות בקווי גילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של דינמיקת התארגנות עצמית של ביופולימרים תחת עקה של ייבוש, ובכך מבהיר קשרים פונקציונליים בין פוליסכרידים, חלבוני שלד התא ו-DNA.
- ערך תפעולי: מספק פרוטוקול דימוי הניתן לשחזור במבט צדי, המשתמש באור מקוטב בצורה מוצלבּת כדי לנטר אינטגרציה של דומיינים בקנה מידה של מילימטרים ללא ארטיפקטים של ייבוש אופקי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: מייצר מדדי birefringence ומורפולוגיית דומיינים כמותיים המשקפים שינויים ביישור המולקולרי במהלך התאיידות הממס.
- ערך תפעולי: תומך בסטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות עיצוב תא פתוח בצד אחד ויישור קבוע של המקטבים (polarizers), המאפשר השוואה עקבית בין סוגים שונים של ביופולימרים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מקשר בין אינטגרציה עצמית מושרית-ייבוש in vitro לבין תהליכי התייבשות טבעיים של רקמות, ובכך מציע מערכת רלוונטית למחלות לצורך חקר תפקוד מחסום ברקמות עור או רקמות כלי דם.
- ערך תפעולי: מסייע בביסוס ביטחון חיזוי על ידי קשר בין התנהגות ממשק אוויר-נוזל (air-LC interface) לבין מעברים של פאזות בביופולימרים במסה, הניתנים לצפייה באמצעות מיקרוסקופיית קיטוב.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים, תומכת בבדיקת היפותזות בתהליכי תיקוף מטרה (target validation) ומאפשרת הכנת ביופולימרים המוכנים לבדיקה עבור סריקות המשך ומחקרים מכניסטיים.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת השערות על ידי הדמיה של האופן שבו תנאי ייבוש מניעים את אוריינטציית הביו-פולימרים מדומיינים מיקרוסקופיים למקרוסקופיים, ובכך מספקת מידע על מעורבות המטרה תחת עקה סביבתית.
- סריקה: מאפשרת מוכנות לבדיקות באמצעות הכנה סטנדרטית של תמיסות sacran, מיקרוטובולי ו-DNA בתאי סביבה מבוקרים.
- אנליטיקה: מספקת פלטים כמותיים באמצעות ניתוח עצימות ועובי של דומיינים ביריפרנגנטיים, מה שמאפשר השוואה של קינטיקת השילוב העצמי בין מחלקות שונות של ביו-פולימרים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרצף פרה-קליני על ידי מידול של שינויים מבניים המושרים על ידי ייבוש, הרלוונטיים לתפקוד מחסום אפיתליאלי או לעיצוב מחדש של המטריקס החוץ-תאי.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה הניתנת לשימוש חוזר להערכת יציבות פורמולציות של ביו-פולימרים תחת עקת דהידרציה, ישימה עבור פרויקטים מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מפחית עמימות מכניסטית בהרכבה עצמית של ביופולימרים על ידי תצפית ישירה על אינטגרציה המכוונת על ידי ממשק אוויר-LC.
- ערך תפעולי: מבטיח הדירות באמצעות הרכבת תאים סטנדרטית, אידוי מבוקר טמפרטורה ויישור אופטי קבוע.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות go/no-go בבחירת ביופולימרים על ידי חיזוי תוצאות מבניות מושפיעות ייבוש בשלב מוקדם של הגילוי.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של מועמדים לביופולימרים על בסיס התנהגות האינטגרציה העצמית ויציבות האוריינטציה שלהם.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות במיקרוסקופיית קיטוב ובטיפול בביו-פולימרים תחת תנאי הידרציה מבוקרים.
- התהליך תלוי בפסים אופטיים, מקטבים, מקורות אור הלוגניים ותאי סביבה להבטחת אידוי יציב.
- נדרש סטנדרטיזציה של טעינת הדגימה, הסרת בועות ואיטום כדי למנוע ארטיפקטים של שוליים במהלך הייבוש.
- התאמה למערכות מודל שונות מחייבת תיקוף של הריכוז, תאימות התמיכה (buffer) וקינטיקת הגרעין עבור כל ביו-פולימר.
- מגבלות מעשיות כוללות רגישות לרעידות, תנודות בלחות והצורך בתנאי דימיון בשדה חשוך כדי למנוע פוטובליצ'ינג (photobleaching).
