25 בנובמבר 2017
מאמר זה מציג את פרוטוקול עבור הכנת דגימות המי-גרון הקלת תצוגה רב ממדית של קיפול ווקאלית רטט, במטרה לחקור היבטים שונים ביופיזיקלי של הפקת הקול של בני אדם ויונקים אנושיות.
על מנת להבין כיצד נוצר הקול אצל בני אדם ויונקים, חשוב לחקור את רטטי מיתרי הקול. מאחר שקשה לחקור אותם בתוך הגוף, נעשה שימוש בגרונות שהוצאו כדי להשיג מידע מפורט יותר על התנהגותם ועל תכונותיהם של מיתרי הקול. בסרטון זה, נדגים כיצד להקים מערך של חצי-גרון (hemi-larynx).
מחצית אחת של הגרון מוסרת על מנת לאפשר תצפית על רעידות מיתרי הקול לא רק מלמעלה אלא גם מהצד. דבר זה מועיל לחקר מאפייני רטט שנותרים נסתרים במערך קונבנציונלי המשתמש בגרון שלם. בהדגמה זו, ייעשה שימוש בגרון של אייל אדום.
מכיוון שדגימות הלרינקס המשמשות למחקר מוקפאות בדרך כלל בהקפאה מהירה בחנקן נוזלי ומאוחסנות במקפיא, יש להפשיר את הדגימה הנבחרת כראוי כדי לא לשנות את התכונות הביומכניות של הרקמה. ראשית, הכניסו את הלרינקס הקפוא לאוטוקלאב כפול או לכל שקית פלסטיק אחרת עם איטום עמיד למים. הוסיפו גם משקולת, המסייעת לשמור על הלרינקס מתחת לפני המים.
אטמו את השקית והניחו אותה במקלח מים בטמפרטורה של כ-30 °C עד שהגרון יפשיר לחלוטין. לאחר שהגרון הפשיר במלואו, הוציאו אותו מהשקית ונקו אותו ביסודיות בעזרת תמיסת סליין. אם קיימים, הסירו מבנים עודפים כגון שרירי צוואר חיצוניים או עצם הלשון.
עבור חלק מהשאלות במחקר ביו-אקוסטי, ניתן להשאיר את המבנים שמעל הלרינקס (גרון) שלמים, אך הדבר מגביל את הנראות של מיתרי הקול מלמעלה. קצרו את הקנה לאורך של כ-45 סנטימטרים, כדי שניתן יהיה להשתמש בו מאוחר יותר להרכבת הלרינקס על צינור אספקת אוויר. לפני המשך ההכנה, בדקו תמיד את הלרינקס לאנומליות אפשריות ברקמה ולסדקים המופיעים לעיתים כתוצאה מתהליך ההקפאה המהירה.
השלב הבא כולל חשיפה של מחצית אחת מס and cartilage של בלוטת התריס (thyroid cartilage). ראשית, הסירו את שרירי הגרון החיצוניים באמצעות סכין מנתחים. התחילו את הליך החיתוך בחיתוך אנכי ראשוני דרך החלק הקדמי של ה-thyroid cartilage.
הנחו את החיתוך בזהירות יותר לכיוון הצד שיש להסירה, כדי למנוע נזק לרצועת הקול שיש לשמר ולחקור. אם הסחוס קשיח מדי עקב התגבשות (ossification), השתמשו במסור קטן. לאחר מכן, חתכו את סחרון הטבעת (cricoid cartilage) במישור הסגיטלי המרכזי.
בצעו את החתך בצורה אנכית בין הסחוסים האריטנואידיים (arytenoid cartilages) ועצרו בערך במפלס האופקי של המגרעת התירואידית התחתונה (inferior thyroid notch). חברו את שני החתכים באמצעות חתך אופקי שמתחיל בקצה התחתון של החתך האנכי בסחוס הקריקואיד (cricoid cartilage) ומוביל לעבר המגרעת התירואידית התחתונה. קפלו את צד הלרינקס (larynx) המיועד להסרה לכיוון הקצה האנטריורי, ובצעו חתך אנכי דרך הרקמה הרכה בצד הפנימי של הסחוס התירואידי (thyroid cartilage).
זהו הרגע הקריטי ביותר בכל ההליך. לכן, יש לגלות זהירות רבה בעת ביצוע החתך מהחיבור הקדמי של מיתרי הקול ועד לסחוס התריס. אם סחוס התריס נחתך כראוי, הגלוטיס שיתקבל יכיל תמיד מרווח קדמי קטן.
כדי לחשוף את מיתרי הקול ולהשיג תצפית עליונה טובה, לעיתים מומלץ להסיר גם את המבנים שמעל למיתרי הקול. במקרים מסוימים, רקמות הגרון הרכות הפנימיות מאבדות את הקשר שלהן לסחוס התיירואיד לאחר הליך החיתוך ומפריעות למיתרי הקול. במצב זה, הסרת רקמה מיותרת זו היא הכרחית.
לבסוף, הסר חלק קטן מהסחוס התריסי האחורי כדי להקל על קירוב מיתרי הקול דרך הסחוסים האריטנואידיים. לגרון יש כעת חריץ בצורת L התואם את סידור לוחות הבסיס בצורת L שנעשה בו שימוש בהרכבה. הצד השמאלי של חציו-הגרון מספק מבט מדיאלי שבו ניתן לראות את החתכים בסחוס התריסי ובסחוס הקריקואידי, יחד עם מיתר הקול הנותר והסחוס האריטנואידי.
ההערכה הניסוית עבור חצאי-גרון מורכבת משלושה חלקים בסיסיים. צינור אספקת אוויר המוביל אוויר מחומם ומלחח אל תוך הגרון. לאחר מכן, שתי לוחיות שקופות המשמשות כתחליף לחלקי הגרון שהוסרו, ופינים לקירוב של מיתר הקול הנחקר ולהייצוב הגרון.
כעת, נחבר את הלרינקס (גרון) לצינור אספקת האוויר. מרחו קרם מקבע עבור תותבות על הצינור וחברו את הלרינקס באמצעות הקנה שלו. הקרם המקבע משמש כדבק ואוטם מרווחים פוטנציאליים.
הדק את הקנה באמצעות רצועת פלסטיק מהודקת או כל סוג אחר של תפס מתאים. כסה גם את קצוות החתך בעזרת קרם לקיבוע תותבות והצמד את הפלטות השקופות. ייצב את סחוס התריס והקרב את מיתרי הקול באמצעות הפינצטות.
בשלב זה, התקנת חצי הגרון מוכנה לשימוש. הפעל את זרימת האוויר ובדוק אם ישנן דליפות. אם אוויר בורח הצידה, אטום את הרווחים על ידי הוספת כמות נוספת של קרם מקבע.
כדי לצפות ברטט מיתרי הקול בזמן אמת, ניתן להשתמש באור סטרובוסקופי. היישום העיקרי של מערך החצי-גרון הוא התבוננות ברטט מיתרי הקול לא רק מלמעלה אלא גם מהצד. למטרה זו, נעשה שימוש בשתי מצלמות וידאו מהירות מסונכרנות.
אחת למבט מלמעלה ואחת למבט מהצד. כאן אנו רואים את רעידת מיתרי הקול של חצי-הלרינקס, שתועדה על ידי שתי מצלמות מסונכרנות הפועלות במהירות של 6,000 פריימים לשנייה. הפאנל השמאלי מציג את המבט מלמעלה והפאנל הימני מציג את המבט מהצד.
מיתרי הקול רוטטים בקצב של כ-70 מחזורים לשנייה, והסרטונים שהוקלטו מוצגים כאן בהילוך איטי. הרווח שבין מיתרי הקול ללוח הזכוכית נקרא הגלוטיס (glottis). ניתן לכמת אותו על ידי מדידת השטח שלו ככל שהוא משתנה עם הזמן.
כאן, שטח מיתרי הקול (glottal area) מבוטא בפיקסלים. הוא שווה לאפס כאשר מיתר הקול נמצא במגע עם לוח הזכוכית, ואינו אפס כאשר אוויר זורם דרך המעבר הקולי (glottis). ניתוח של האות האקוסטי הנובע מתהליך הרטט של מיתרי הקול בחצי-גרון (hemi-larynx) מראה כי אירועי העירור האקוסטיים העיקריים מתרחשים בשני מועדים במהלך מחזור רטט אחד.
ברגע הפתיחה של מפתח הגרון, כאשר מיתר הקול מאבד מגע עם לוח הזכוכית, וברגע הסגירה של מפתח הגרון כאשר מיתר הקול הגיע שוב למגע מלא עם לוח הזכוכית. באנימציה הבאה, שטח המגע המשתנה בזמן של מיתר הקול עם לוח הזכוכית מוצג בכתום עבור מחזור רטט אחד. כאן, מערך חצי-גרון (hemi-larynx) משמש כדי לתקף שיטה הנקראת אלקטרוגלוטוגרפיה או EGG.
אות ה-EGG שנרכש בו-זמנית מוצג כאן בכחול. קיימת קורלציה טובה למדי בין שטח המגע של מיתרי הקול לבין אות ה-EGG. דבר זה מתועד בפירוט רב יותר במחקר שנערך לאחרונה על ידי הקבוצה שלנו.
בחלק האחרון של סרטון זה, אנו מציגים שיטה חדשנית להערכת רטט מיתרי הקול בתלת-ממד, הנקראת ניתוח תנועה גלוטלית כימוגרפית. בכימוגרמה דיגיטלית, מידע תמונה הנמצא לאורך קו אחד בתוך וידאו במהירות גבוהה מוערך עבור כל פריים של הווידאו וממופה משמאל לימין. הכימוגרמה שמתקבלת מציגה את תנועת מבנה מיתרי הקול לאורך קו הסריקה כפי שהיא מתפתחת לאורך זמן.
כימוגרמות (Chemograms) נוצרות הן עבור המבט מלמעלה והן עבור המבט מהצד, כאשר קווי הסריקה הכימוגרפיים ממוקמים בדיוק במרכז הרצועה הקולית. ההסטה הזמנית של קצוות הרצועה הקולית מותוות. הגרף בצבע תכלת מראה את ההסטה הצידית של הרצועה הקולית, והגרפים בצבעי אדום וירוק מראים את ההסטה האנכית של הקצה התחתון והעליון של הרצועה הקולית, בהתאמה.
ניתן לשלב את המידע המתקבל כדי לסנתז אנימציה המציגה את תנועת המיתרי הקול בשני ממדים כפי שהיא נראית בקו האמצע של הגלוטיס. בסרטון זה, סיפקנו מדריך ליצירת מערך של חצי-גרון (hemi-larynx). הצגנו מספר יישומים פוטנציאליים להערכת רעידות מיתרי הקול לא רק מלמעלה אלא גם מהצד, ובכך הוספנו נתונים אמפיריים קריטיים להבנה טובה יותר של היבט מרכזי בייצור הקול.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
מאמר זה מציג פרוטוקול להכנת דגימות של חצי-גרון (hemi-larynx) המאפשרות תצפית רב-ממדית על רעידות מיתרי הקול. גישה זו מאפשרת לחקור היבטים ביופיזיקליים שונים של הפקת קול בבני אדם וביונקים שאינם בני אדם.
הבנת הביומכניקה של מיתרי הקול היא קריטית להפחתת סיכונים בתיקוף המטרה (target validation) בפיתוח טיפוליים הקשורים לקול, במיוחד עבור הפרעות הכוללות בקרה נוירו-שרירית או אלסטיות של הרקמה. מערך החצי-גרון (hemi-larynx) מאפשר תצפית תלת-ממדית על דינמיקת הרטט, ומספק נתונים כמותיים וניתנים לשחזור התומכים בהפחתת סיכונים מכניסטית במודלים פרה-קליניים. גישה זו מגבירה את הביטחון החזוי על ידי קישור תצפיות מבניות לתוצרים תפקודיים, ובכך מספקת בסיס להחלטות go/no-go בשלבים מוקדמים של תהליכי הגילוי.
מערך ההמי-לרינקס (hemi-larynx) משתלב בתהליכי גילוי מוקדמים ככלי לסריקה פנוטיפית עבור מטרות הקשורות לקול, ומספק נתונים מכניסטיים התורמים לזיהוי מובילים (lead identification) ולקידום פרה-קליני.