הקרנת איכות הסביבה של Aeromonas hydrophila, Mycobacterium spp. Pseudocapillaria tomentosa במערכות דג זברה

המטרה הכוללת של טכניקת דגימה זו היא להפחית את מספר הדגים המשמשים לניטור בריאות ולייעל את המחזור, העלות והרגישות של זיהוי פתוגנים, כולל בעת סינון יבוא בהסגר. טכניקה זו עוזרת להגדיר את חוקי הבריאות של מושבות המקלט. שיטה זו היא כלי שימושי בעת קריאה או הערכה של יעילות הטיפול.

אחד היתרונות העיקריים של טכניקה זו הוא סינון ומיון של יבוא בבידוד. זה מחזק את תוכנית האבטחה הביולוגית של המתקן הימי. כדי להתחיל את הפרוטוקול, הגדר מיכל נקי של שמונה ליטר מתוך מערכת מחזור.

מלאו את המיכל בכשמונה ליטר מים שמקורם בבורות. הוסף שני חרוזי קרמיקה או קוביות ספוג של ביומדיה מהמערכות למסך. לאחר מכן, הוסף אחד לעשות Danio rerio לליטר, תוך שימוש בדגים מסוג בר מהרקע הגנטי הדומיננטי במתקן, למשל A B. בחר לפחות שישה דגים.

האכילו את הדגים פעם ביום. גוונו את הדיאטות כדי לוודא שהזקיפים חשופים לכל הדיאטות המשמשות במתקן דג הזברה. כדי לבצע את החלפת המים, העבירו את הזקיפים בביומדיה למיכל זמני.

רוקן לחלוטין את מיכל הזקיף ונקה אותו. מלאו מחדש את מיכל הזקיף במי בור בלבד והניחו את הזקיפים והביומדיה בחזרה. לאחר חשיפת הזקיפים למים במשך ארבעה חודשים, המתת חסד של הדגים בשיטה מאושרת כגון טבילה בתמיסת מנת יתר של 2-פנוקסיאתנול.

כדי לאשר את המוות, המתן עשר דקות לאחר הפסקת תנועת האופרקולום. תפסו את הגופה בעזרת מלקחיים והקפיאו אותה לחלוטין בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס במיכל מזוהה. הכינו ספוגית יבשה סטרילית עם פיר פלסטיק ולבשו כפפות.

אתר את המשטח לספוגית. בחר משטח בור עם זרימה נמוכה, קיר הבור על פני המים, והסר כל פריט המונע גישה נוחה למשטח. לאחר מכן, הסר את הספוגית על ידי הסרת האריזה החיצונית וחשוף את קצה הכותנה הסטרילי לאוויר.

ספוג את דופן הבור מעל חמישה עד 10 סנטימטרים כדי לספוג את המים והביופילם בגובה פני השטח של מי הבור. לאחר מכן עטפו את הספוגית לאחור או שברו את הקצה לצינור צנטריפוגה סטרילי. סמן את הדגימה ושלח אותה לבדיקת PCR או הקפיא ב-80 מעלות צלזיוס שליליות.

כדי לבצע ניתוח בוצה במיקרוסקופיה, השתמש במזרק של 60 מיליליטר כדי לשאוב את הבוצה בתחתית הבור. מחלקים את הדגימה לצינורות של 15 מיליליטר. הברג את הכובעים ותייג את הצינורות.

צנטריפוגה של צינורות 15 מיליליטר בכוח הכבידה פי 175 עד 250 למשך עשר דקות בצנטריפוגה עם דליים מתנדנדים. שפכו את הצינורות. לאחר הסילוק, שמור את המשקעים.

לאחר מכן, הכינו את התמיסה הרוויה בסוכר על ידי ערבוב 227 גרם סוכר גרגירי ו -177 מיליליטר מים חמים בעזרת מערבל מגנטי. מלאו את הצינורות באמצע הדרך בתמיסה רווית הסוכר. הברג את הכובעים וערבב היטב את המשקעים עם התמיסה.

מניחים את הצינורות בדלי הנדנדה של הצנטריפוגה וממלאים אותם עד למעלה בתמיסה רוויה בסוכר. הנח כיסוי אחת בעדינות על גבי כל צינור כך שהיא תהיה במגע עם התמיסה רווית הסוכר. שימו לב שארבעת הצינורות לכל דגימה של 60 מיליליטר הם למקרה שחלק מזכוכית הכיסוי נופלת ונשברת במהלך הצנטריפוגה.

לאחר השלמת הסיבוב, הרם את זכוכית הכיסוי והנח אותה על שקופית זכוכית, ולאחר מכן סמן את השקופית בעיפרון או בעט טוש. במקרה שמתרחשות יותר מדי שברי זכוכית כיסוי, מלאו את רוב הצינור בתמיסה רווית הסוכר וצנטריפוגה את הצינור. ממלאים עד למעלה בתמיסה רווית הסוכר, ואז מניחים בעדינות את הכיסוי וממתינים 30 דקות.

חפש את ביצי הפסאודו-קפילריה טומנטוזה במיקרוסקופ. זהה את התקעים הדו-קוטביים בהגדלה של 400X. כדי לסנן בעלי חיים מיובאים בהסגר לביצי P.tomentosa, הניחו את הזכר והנקבה Danio rerio במיכל והוסיפו את מגש ההטלה במיכל אך השתמשו בו כאן לאיסוף צואה.

לאחר שבוע יש להסיר את מכשיר הרבייה, ולקצור את הבוצה שנאספה במכשיר הגידול כפי שתואר קודם לכן. שאפו את הבוצה בתחתית מיכל או בור בעזרת מזרק של 60 מיליליטר והעבירו את הדגימה לצינור של 60 מיליליטר. סגור את הצינור עם החלק העליון של הבורג שלו ותייג את הצינור.

השלך את המזרק. נענע את צינור ה-60 מיליליטר והעביר 15 מיליליטר לצינור של 15 מיליליטר. סגור את הצינור עם החלק העליון של הבורג שלו ותייג את הצינור.

צנטריפוגה של צינור 15 מיליליטר בכוח הכבידה פי 175 עד 250 למשך עשר דקות בצנטריפוגה עם דליי נדנדה. שפכו את הצינורות ושמרו את המשקעים בצינור. הסר את הספוגית על ידי הסרת האריזה החיצונית וחשוף את קצה הכותנה הסטרילי לאוויר.

ספוג את המשקעים בצינור למשך 15 שניות. נדן את הספוגית לאחור או שבור את הקצה לצינור צנטריפוגה סטרילי. הוספת תווית לדוגמא.

יש להקפיא בטמפרטורה שלילית של 80 מעלות צלזיוס ולשלוח לבדיקת PCR. באמצעות שיטת ספוגית הבור של 115 דגים שנבדקו, Mycobaterium chelonae זוהה בחמישה אחוזים ו-Mycobaterium haemophilum זוהה בשלושה אחוזים מהדגימות והיו המינים הפתוגניים היחידים שזוהו. מאותן מערכות, 49 ספוגיות בור חשפו את נוכחותם של חמישה מינים מיקובטריאליים.

יחסי הסיכויים מראים שטכניקת ספוגית הבור היא אלטרנטיבה חשובה לשימוש הבלעדי בזקיפים כדי לסנן את מתקן דג הזברה לאיתור מיקובקטריום. הדגימות הסביבתיות שימשו גם לסריקת Aeromonas hydrophila שזוהו בדגים, בוצה ודגימות פני השטח התומכות ביכולת של הטכניקות המוצעות לסנן את הביוטופ של הדגים. Mycobacterium chelonae ו-Mycobacterium fortuitum מתגלים בתדירות גבוהה יותר על ידי PCR במקלוני בור פני השטח מאשר בדגימת הדגים.

לאחר השליטה הדגימה אורכת מספר דקות בלבד וניתן לבצע איתור ביצי פסאודו-קפילריה טומנטוזה תוך שעה. טכניקה זו הופכת את הבדיקה הסביבתית לחלק מרכזי בתוכנית ניטור הבריאות השגרתית. שיטות אלו יכולות לסייע לענות על שאלות מפתח בתחום הפתולוגיה של דגים, כגון הקשר בין ביופילם חיידקים לזיהום חיידקי.