אינדוקציה של תגובה דלקתית בתרבויות Hepatocyte הראשי מעכברים

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד בהצלחה הפטוציטים תפקודיים של עכברים, לצורך חקר הביטוי וההפרשה של ציטוקינים דלקתיים כגון CRP ו-IL6 בתגובה למתווכים של תגובת הפאזה החריפה של הכבד. שיטה זו עשויה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח הנוגעות לתפקוד התאי הכבדי ולתרומתם של ציטוקינים כבדיים לסביבה דלקתית ממושכת, כפי שניתן למצוא במחלה כרונית של הכליות. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת כלי חסון לניתוח פשוט, מהיר וניתן לשחזור של מטבולומיקה של הכבד ודלקת, כמו גם לבחינת התגובה לתרופות.

כדי להתחיל, חממו מראש את תמינת הפרופוזיה של הכבד ואת תמינת עיכול הכבד במקלח מים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הגדירו משאבת פרופוזיה כפי שמוצג כאן. לאחר מכן, השתמשו בתמינת הפרופוזיה של הכבד כדי למלא בזהירות מראש את מערכת הצינורות של המשאבה.

נסו להימנע מהיווצרות בועות אוויר במערכת. הכינו את המיקרוסקופ הסטריאוטקטי להליך הפרפוזיה. לאחר הרדמת עכבר תורם בהתאם לפרוטוקול הכתוב, הניחו את החיה המורדמת על פד סופג.

השתמשו בסרט דביק כדי לקבע את גפיו של העכבר. לאחר מכן, גלחו וחטאו את בטנו של העכבר. לאחר מכן, השתמשו במספריים כירורגיים עם קצוותים חדים-קהים כדי לבצע לפרוטומיה בבטנית מהפיובס ועד לגבול הקרניאלי של הכבד.

בצעו חתך בדופן הבטן משני הצדדים במיקום זנבי (caudal) לסרעפת. חשפו את הווריד הרחב התחתון (inferior vena cava או IVC) על ידי הזזה זהירה של המעי לצד ימין באמצעות מקלוני צמר סטריליים. בעזרת מספריים כירורגיים עדינים בעלי קצוות חדים, בצעו חתכים לטראליים לרוחב הסרעפת שמעל הכבד ופתחו את חלל בית החזה.

לאחר מכן, השתמשו במשי 5-0 כירורגי כדי לקישור את ה-IVC החזי. בעזרת קטטר IV ממוגן, בצעו קנולציה של ה-IVC התת-כלייתי. חברו את משאבת הפרפוזיה והתחילו בפרפוזיה של הכבד.

אם הפעולה בוצעה כהלכה, הכבד אמור להתחיל להבהיר ולהנפח באופן מיידי. לאחר מכן, בעזרת מספריים כירורגיים עדינים, חתכו את הווריד השער (portal vein), כדי לאפשר ניקוז תקין של דם ומדיום פרפוזיה. לאחר ביצוע פרפוזיה לכבד עם כ-30 milliliters של מדיום פרפוזיה לכבד, הפסיקו את פעולת משאבת הפרפוזיה.

עברו למדיום עיכול כבד והפעילו מחדש את המשאבה. עם השלמת הפרפוזיה, הסירו את הקנולה. חשפו בעדינות את האזור המרכזי של הכבד ואתרו את רקמת החיבור המחברת בין האונות של הכבד.

תפסו את סיבי החיבור המרכזיים והסִירו בזהירות את כל הרקמות המקבעות את הכבד במקומו. לאחר מכן, הוציאו בעדינות את הכבד. העבירו מיד את האיבר לתוך מבחנה קונית מ-polypropylene בנפח 50 milliliter המכילה 15 milliliters של תמיסת עיכול כבד (liver digest medium).

בזמן העבודה תחת מנדף תרביות תאים, העבירו את הכבד מהמבחנה הקונית מポリפרופילן בנפח 50 מיליליטר אל צלחת תרבית רקמות סטרילית. בעזרת פינצטה סטרילית, קרעו בעדינות את ארבעה האוני של הכבד. אם הפעולה בוצעה כהלכה, תרשום תמיסת העיכול עכירות עקב בידוד של hepatocytes מהכבד.

באמצעות טיפ של פיפטה סטרילית בנפח 25 מיליליטר, סננו את מדיום העיכול העכור דרך מסנן תאים מניילון בנקבים של 70 מיקרומטר אל תוך פפיל פלסטיק קוני חדש בנפח 50 מיליליטר, כדי להסיר חלקיקי רקמה שלא עובדו ושאריות תאים. סובבו במרכז פוגה את התסננת המאוחדת ב-50 ×g בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך שתי דקות, לאחר מכן שאבו את supernatant המכיל שאריות תאים עודפות והשתמשו ב-25 מיליליטר של 1X William's Medium E קר כדי לחדד בעדינות את התאים. לאחר חזרה על פעולות הסינון והשטיפה של ההפטוציטים שלוש פעמים, שאבו את ה-supernatant כדי להסיר שאריות תאים עודפות.

יש להשעות מחדש את התאים ב-25 milliliters של 1X William's Medium E חמים המכיל תוספים להפשרה ולהזריעה של הפטוציטים ראשוניים, ולסנן את התוךית דרך מסננת תאים חדשה מנילון של 70 micrometer אל תוך מבחנה קונית של 50 milliliter. לאחר ספירת התאים, יש להזריעם ב-two milliliters של William's Medium E המכיל תוספים להפשרה ולהזריעה של הפטוציטים ראשוניים, בתוך פלטת תרבית תאים של שש בארות מצופה בקולגן. לאחר שתי החלפות של המצע כדי להרעיב את התאים בסופו של דבר, יש לטפל בתאים ב-PBS כחומר נשאי (vehicle), 25 nanograms per milliliter של FGF23, 100 micrograms per milliliter של LPS, או 50 nanograms per milliliter של IL6 במצע נטול סרום.

דגרו את התרביות למשך 24 שעות. לאחר הכנת RNA באמצעות ערכת עמודת ספין (spin column kit) לפי הוראות היצרן, הוסיפו 200 ננוגרם של ה-RNA המבודד לפקעת PCR. לאחר מכן, הוסיפו לפקעת 14 מיקרוליטר של מים נקיים מאנדונוקלאז (endonuclease-free water) וארבעה מיקרוליטר של reverse transcriptase.

מקם את מבחורת ה-PCR בטרמוסייקלר והפעל את תוכנית השעתוק ההפוך הבאה להפקת cDNA. לצורך ביצוע qPCR כמותי, ערבב את רכיבי תערובת ה-QPCR master mix הבאים במבחורה על קרח. ערבב את תערובת ה-master mix באמצעות וורטקס.

לאחר מכן, חלקו תשעה מיקרוליטרים מהתמיסה לכל באער של פלטת 96 באערים. הוסיפו בזהירות מיקרוליטר אחד של cDNA לכל באער, והכינו שלושה באערים עבור כל דגימה. לבסוף, הריצו את הדגימות במכשיר real-time PCR ונתחו את הנתונים בהתאם לפרוטוקול הכתוב.

כאן מוצגת תמונה מייצגת במיקרוסקופיה של אור של תאים מבודדים ומטופחים ראשוניים. ניתוח אימונו-ציטוכימי מדגים כי הפטוציטים המבודדים מביעים רמה גבוהה של albumin וכן של fibroblast growth factor receptor 4. בניסוי זה, הפטוציטים הראשוניים המבודדים טופלו ב-FGF23, LPS או IL6 למשך 24 שעות, ורמות ה-mRNA של CRP ו-IL6 נותחו באמצעות quantitative real-time PCR.

LPS, IL6 ו-FGF23 העלו באופן משמעותי את הביטוי של CRP ו-IL6. כפי שמוצג כאן, תמיסות העל של תרביות תאים מהפטוציטים ראשוניים מבודדים נותחו באמצעות ELISA למדידת רמות CRP. כפי שהודגם בניתוח QPCR, טיפולים ב-LPS, IL6 ו-FGF23 העלו באופן משמעותי את רמות ה-CRP בתמיסות העל של התאים בהשוואה לתאים שטופלו ב-PBS.

לאחר השליטה בטכניקה זו, ניתן לבצעה תוך מספר שעות בודדות במידה שהיא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לשמור על סביבה סטרילית. בשל העבודה עם תרבית ראשונית, צמצום הסיכון לזיהום אפשרי הוא הגורם החשוב ביותר להשגת תוצאות אופטימליות.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבודד בהצלחה הפטוציטים של עכברים למחקר של תפקודי תאי כבד שונים, כגון ביטוי והפרשה של ציטוקינים כבדיים.