Name: אוסף העופות זרע על ידי עיסוי Cloacal ובידוד של ה-DNA של הזרע (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: למדו איסוף זרע מעופות זכרים באמצעות עיסוי קלואקלי ואת שיטת בידוד ה-DNA המותאמת לזרע עופות. הפרוטוקול מאפשר מחקרים באקולוגיה התנהגותית ואבולוציונית ובאפיגנטיקה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים חוזה Noguera לקבלת סיוע מוקדם עם עיסוי cloacal, ותמיכה ג'פרי Kittilson עבור המעבדה. עבודה זו נתמכה על ידי פרס ND EPSCoR FAR0022429 כדי BJH. עלויות הפרסום בנדיבות נתמכו על ידי NDSU במחלקה למדעי הביולוגיה.

פרוטוקול זה כרוך נושאים בעלי חוליות, אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) באוניברסיטת המדינה של צפון דקוטה.
1. זרע מהאוסף ציפור שיר באמצעות עיסוי cloacal
הערה: עיסוי Cloacal שיטת איסוף זרע יעיל על ציפורים reproductively פעילים בלבד, אך ניתן לבצע בהצלחה מחוץ לעונת הקינון במצבים המתאימים בשבי. פעילות הרבייה צריך להיקבע עבור היעד מינים לפני באמצעות עיסוי cloacal. ניתן להשתמש בטכניקה זו על ציפורי בר על לכידת או על ציפורים מוחזק בשבי.
<ol><li>החל זכר ציפור, (גידול בתנאי) לאחיזה של סיטרה ביד האחרת, להעביר את הציפור אל היד הדומיננטית עם הצד הגחון שלו נוגע כף היד (איור 1).<ol>
<li>ודא כי הראש של העוף הקרוב קצה לרוחב של כף היד. בקלילות לאבטח ראש וגוף באמצעות פינקי, טבעת, באצבעות. זה משאיר פתח וזנב של העוף חשוף.</li>
		<li>להשאיר את הרגליים של העוף רופף או בקלילות מאופקת באמצעות כף היד.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55324/55324fig1.jpg"> איור 1 : גריפ עבור עיסוי cloacal. הציפור מאובטח בקלילות ביד הדומיננטית עם הצד הגחון שלו נוגע את דקל ובראש מאובטח על ידי אצבע הזרת. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55324/55324fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<ol start="2"><li>למקם את דומיננטי האצבע והאגודל משני צדי בסוף נעלה קלואקה וצבטתי קלות את האצבעות יחד תוך הפעלת לחץ קל מאוד לכיוון הזנב ( איור 2). קלואקה אוורט, חשיפת רירית cloacal (ורוד פנימי). הערה: אם הציפור לא כיום לייצר זרע, בליטה cloacal יכול להיות קטן, קלואקה, קשה, אוורט. עם ניסיון, קל להבחין בין cloacas של הזכרים reproductively פעיל, לא פעיל5,11.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55324/55324fig2.jpg"> איור 2 : אצבע המיקום ואת בליטה cloacal. אוורט קלואקה על ידי הפעלת לחץ קל עד הסוף מעולה (א). ב זכר ציפורי שיר reproductively פעיל, ברור בליטה cloacal המשרד (B). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55324/55324fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<ol start="3"><li>עם היד הלא דומיננטית, במקום משטח של האצבע המורה על הצד הגבי של בסיס הזנב לייצב את היד, ולאחר מכן מקם קצה האגודל מתחת קלואקה everted. הערה: תמונה ממוזערת קצרה וחלקה הוא יתרון לביצוע עיסוי cloacal, מגן על הציפור מהפציעה.</li>
	<li>להזיז את האגודל-הדומיננטי עמוק, cranially עם לחץ בינוני, להישאר מתחת קלואקה קרבנותיו. המשך עד גומר הציפור. תלוי הפרט, זה בדרך כלל לוקח בין קווים 1 ו מספר עשרות.</li>
	<li>ברגע שהציפור גומר, לאסוף את הזרע צינור microhematocrit. חזור על עיסוי cloacal להשיג שופך מרובים. הערה: ציפורי שיר מ חום בהיר של זרע בדרך כלל יש עקביות עבה במקצת. חומרים בהיר או כהה הוצאת from קלואקה הן לא זרע, עשויים לזהם את דגימת הזרע. המראה של כמות קטנה של דם על קלואקה או מעורבת עם הזרע נגרמת בדרך כלל על ידי לחץ רב מדי בעיסוי.</li>
	<li>להפקת DNA, מקם את הזרע לתוך צינור microcentrifuge עם µL 20 ל- x 1 PBS (pH 7.4). הערה: זרע המאוחסן ב- 1 x PBS אינו מתאים הפריה מלאכותית, אך יכול לשמש להפקת DNA במועד מאוחר יותר כאשר הוא מאוחסן ב- 80 ° C טוב, מגניב יכול להיות בטמפרטורת החדר או מקורר, אבל צריך להיות במצב נוזלי כאשר דגימת הזרע הוא מופקד.<ol>
<li>לאשר הנוכחות של הזרע בדגימה על-ידי הצגת כמות קטנה של המדגם מדולל תחת מיקרוסקופ תרכובת (איור 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחסן הזרע מדולל ב-80 מעלות צלזיוס עד מיצוי.</li>
</ol>2. הפקת דנ א בזרע ציפור
הערה: פרוטוקול זה נבדק עם מספר ערכות חילוץ מסחרי של DNA, אך עברו רק מוצלח בעת שימוש ב- DNA אחד ערכת12. צעדים שעברו שינויים בפרוטוקול ערכת מסומנים באמצעות *.
<ol><li>להכין פתרון 1 מ' של dithiothreitol (DTT) במים ולערבב באמצעות vortex.*<ol>
<li>Aliquot הפתרון DTT ואחסן אותו ב-20 ° C עד מיד לפני השימוש. כל דגימה לצורך פריסה מדחיסה דורש 10 µL של 1 מ' DTT solution.*</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכנת מאגר המכיל 20 מ מ טריס-קלרנית, pH 8.0; 20 מ מ EDTA; 200 מ"מ NaCL; 4% מרחביות. כל דגימה לצורך פריסה מדחיסה דורש µL 90 של buffer.* הזה<ol>
<li>אחסן את המאגר בטמפרטורת החדר. אם זה יש זירז, לחמם את זה עד 56 ° C כדי dissolve.*</li>
	</ol>
</li>
	<li>מחממים אינקובטור המכיל של רוקר או שאכר כ- 65 ° C.*</li>
	<li>מיד לפני תחילת החילוץ, מערבבים 10 פתרון DTT µL עם µL 90 המאגר מוכן בשלב 2.2 עבור כל הדגימה כדי לחלץ, למשל 900 µL מאגר בתוספת 100 µL DTT פתרון אם חילוץ 10 דוגמאות. תערובת זו ייקרא DTT-buffer.*</li>
	<li>להוסיף 70 µL 1 x PBS המדגם כולו זרע מדולל, לערבב היטב באמצעות vortex.*</li>
	<li>להוסיף 100 µL DTT-buffer וכדי לפתור proteinase K µL 10 המדגם. מערבולת במשך 20 שניות, ואז דגירה בחממה preheated למשך שעה על הנדנדה או shaker.*</li>
	<li>להוסיף 200 µL מאגר AL ו- 200 µL EtOH טרי (100%) ו מערבולת עבור 20 seconds.*</li>
	<li>להעביר את הדגימה כל עמודה ספין, centrifuge 1 דקה-g 6,000 x. להשליך את הצינור אוסף.</li>
	<li>במקום העמודה על צינור חדש ולהוסיף µL הכין 500 מאגר AW1. Centrifuge 1 דקה-g 6,000 x. להשליך את הצינור אוסף.</li>
	<li>במקום העמודה על צינור חדש ולהוסיף µL הכין 500 מאגר AW2. צנטריפוגה במשך דקה אחת ב 6,000 x ג למחוק את זרימה דרך ומקום העמודה חזרה ברכבת התחתית.</li>
	<li>Centrifuge 3 דקות ב- 20,000 g x. להשליך את הצינור אוסף ומניחים את העמודה על צינור microcentrifuge 1.5 mL.</li>
	<li>Pipet 35 µL של AE מאגר ישירות על גבי קרום עמודה, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 minutes.*</li>
	<li>Centrifuge 1 דקה-g 14,000 x. להשליך את העמודה ספין ולאחסן דגימות שחולצו ב-80 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>

<ol><li>Briskie, J. V., Montgomerie, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1349186">Sperm size and sperm competition in birds.</a> Proc. R. Soc. B. 247, 89-95 (1992).</li>
<li>Monaghan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+and+life+histories%3A+the+long+and+the+short+of+it%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Telomeres and life histories: the long and the short of it.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1206, 130-142 (2010).</li>
<li>Carrell, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+of+the+male+gamete%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Epigenetics of the male gamete.</a> Fertility and Sterility. 97 (2), 267-274 (2012).</li>
<li>Burrows, W. H., Quinn, J. P. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/ps/article-abstract/16/1/19/1564432?redirectedFrom=fulltext">The collection of spermatozoa from the domestic fowl and turkey.</a> Poultry Science. 16 (1), 19-24 (1937).</li>
<li>Wolfson, A. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/4510381?seq=1#page_scan_tab_contents">The cloacal protuberance: a means for determining breeding condition in live male birds.</a> Bird-Banding. 23 (4), 159-165 (1952).</li>
<li>Kast, T. L., Ketterson, E. D., Nolan, V. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/4089416?seq=1#page_scan_tab_contents">Variation in ejaculate quality in dark-eyed juncos according to season, stage of reproduction, and testosterone treatment.</a> The Auk. 115 (3), 684-693 (1998).</li>
<li>Helfenstein, F., Podevin, M., Richner, H. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s00265-009-0871-x">Sperm morphology, swimming velocity, and longevity in the house sparrow Passer domesticus.</a> Behav. Ecol. Sociobiol. 64, 557-565 (2010).</li>
<li>Purchase, C. F., Earle, P. T. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jai.12070/abstract">Modifications to the IMAGEJ computer assisted sperm analysis plugin greatly improve efficiency and fundamentally alter the scope of attainable data.</a> J. Appl. Icthyol. 28, 1013-1016 (2012).</li>
<li>Gill, P., Jeffreys, A. J., Werrett, D. J. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/318577a0">Forensic application of DNA 'fingerprints'.</a> Nature. 318 (12), 577-579 (1985).</li>
<li>Criscuolo, F., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1600-048X.2008.04623.x/abstract">Real-time quantitative PCR assay for measurement of avian telomeres.</a> J. Avian Biol. 40, 342-347 (2009).</li>
<li>Lovette, I. J., Fitzpatrick, J. W. <a target="_blank" href="http://www.birds.cornell.edu/homestudy/handbook-of-bird-biology">Cornell Lab of Ornithology Handbook of Bird Biology, 3rd Edition</a>. , Wiley-Blackwell, Princeton University Press. ISBN 9781118291047 (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="https://www.scribd.com/document/54238221/QIAamp-DNA-Micro-Handbook">QIAamp DNA Micro Handbook</a>. , Third edition (2014).</li>
<li>Carter, K. L., Robertson, B. C., Kempenaers, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+differential+DNA+extraction+method+for+sperm+on+the+perivitelline+membrane+of+avian+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ecol%22%5BJournal%5D)">A differential DNA extraction method for sperm on the perivitelline membrane of avian eggs.</a> Mol. Ecol. 9, 2149-2154 (2000).</li>
<li>Birkhead, T. R., Buchanan, K. L., Devoogd, T. J., Pellatt, E. J., Catchpole, C. K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0003347296904236">Song, sperm quality and testes asymmetry in the sedge warbler.</a> Anim. Behav. 53, 965-971 (1997).</li>
<li>Lüpold, S., Calhim, S., Immler, S., Birkhead, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+morphology+and+sperm+velocity+in+passerine+birds%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+B%22%5BJournal%5D)">Sperm morphology and sperm velocity in passerine birds.</a> Proc. R. Soc. B. 276, 1175-1181 (2009).</li>
<li>Samour, J. H., Smith, C. A., Moore, H. D., Markham, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semen+collection+and+spermatozoa+characteristics+in+budgerigars+%28Melopsittacus+undulates%29%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Rec%22%5BJournal%5D)">Semen collection and spermatozoa characteristics in budgerigars (Melopsittacus undulates).</a> Vet. Rec. 118, 397-399 (1986).</li>
<li>Stelzer, G., Crosta, L., Bürkle, M., Krautwalt-Junghanns, M. E. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/232663050_Attempted_Semen_Collection_Using_the_Massage_Technique_and_Semen_Analysis_in_Various_Psittacine_Species">Attempted semen collection using the massage technique and semen analysis in various psittacine species.</a> J. Avian Med. Surg. 19 (1), 7-13 (2005).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

אנו מתארים שיטה פשוטה ואמינה איסוף זרע מעופות קטנים ובינוניים במצב פעיל reproductively, חילוץ DNA של הזרע העופות.
פרוטוקול מיצוי DNA זרע מתואר שינוי ערכה של פשטות, אבל היה מעודן לשימוש על זרע העופות. הזרע הם עמידים בפני פירוק על ידי מיצוי סטנדרטי כימיקלים9,13, דגימות זרע שנאסף passerines קטן למדי (בדרך כלל כמה microliters). גורמים אלה מציגים אתגרים הם בהצלחה להתגבר על-ידי שימוש של הריכוז המתאים של DTT המקננת ב 65 º C. באמצעות שיטה זו, ...

ציפורים הן נושאים אידיאלי עבור מחקרים שכללו איכות הזרע, תחרות1, זרע טלומר dynamics2, אפיגנטיקה3ונושאים דומים, הם נמצאים בשימוש נרחב המחקר הביולוגי, זרע ניתן בקלות לטעום באמצעות cloacal עיסוי. עיסוי cloacal היא טכניקה ידני עדין, לא פולשנית עבור איסוף זרע מן הציפורים-4,-5,-6. דוגמאות חוזרות ניתן להשיג בקלות, אין כלים מיוחדים נדרשים, עושה את זה פשוט לבצע בשדה או מעבדה. למרות עיסוי cloacal כבר בשימוש במשך עשרות שנים, קשה ללמוד לכתוב תיאורים זמינים. פרסום זה מיועד להפחית את הזמן ואת אי הוודאות מעורב לימוד עיסוי cloacal.
הזרע שנאסף ציפורים באמצעות עיסוי cloacal שניתן להשתמש מיד תנועתיות-הערכת-4,-7 או הזרעה מלאכותית8או קפוא לשימושים אחרים כגון הדמיה מתקדמות והפקת דנ א. דגימות זרע מציפורי שיר מ הם קטנים, אך מכיל זרע בצפיפות. ה-DNA מופק באמצעות ערכת חילוץ מסחרי עבור פשטות, עם שינויים כדי להתגבר על התכונות מגן מיוחדות של זרע9. לאחר החילוץ, טלומרים זרע ניתן למדוד באמצעות qPCR10.

<table><tbody><tr><td>צינורות נימיים מיקרוהמטוקריט</td><td>פישרברנד</td><td>22-362566</td><td>ניתן להשתמש בכל ספק. צינורות קטנים יותר עשויים להיות יעילים יותר לאיסוף דגימות זרע קטנות, כגון מעופות עוברים קטנים מאוד כמו דרור סתת.</td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>כל</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>כל משמש</td><td></td><td>לאחסון דגימות זרע לפני מיצוי DNA.</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td>ניתן להשתמש בכל ספק.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>1233508</td><td>ניתן להשתמש בכל ספק.</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td>ניתן להשתמש בכל ספק.</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1614363</td><td>ניתן להשתמש בכל ספק.</td></tr><tr><td>ערכת מיקרו QIAamp DNA</td><td>Qiagen</td><td>56304</td><td>Qiagen QIAamp ערכת מיקרו DNA מומלצת במיוחד. פרוטוקול מיצוי DNA זה נוסה עם ערכות מסחריות אחרות אך ללא הצלחה רבה. הסיבות לכך אינן ידועות לנו.&nbsp;</td></tr></tbody></table>

אוסף העופות זרע על ידי עיסוי cloacal ובידוד של ה-dna של הזרע

Avian Semen Collection by Cloacal Massage and Isolation of DNA from Sperm

איסוף זרע עשויה להיות שימושית עבור מגוון רחב של יישומים כולל מחקרים שכללו איכות זרע, זרע טלומר dynamics, אפיגנטיקה. ציפורים נמצאים בשימוש נרחב הנבדקים במחקר ביולוגי והם אידיאליים עבור מחקרים שכללו דגימות זרע חוזרות ונשנות. עם זאת, מעט משאבים זמינים כעת עבור אלה המעוניינים ללמוד כיצד לאסוף לחלץ את ה-DNA של הזרע העופות. כאן נתאר עיסוי cloacal, טכניקה ידני עדין, לא פולשנית עבור איסוף זרע העופות. למרות טכניקה זו נוצר בספרות, זה יכול להיות קשה ללמוד מן התיאורים זמינים. כמו כן, אנו מספקים מידע עבור חילוץ דנ א בזרע העופות באמצעות ערכת חילוץ מסחרי עם שינויים. עיסוי cloacal יכול לשמש בקלות על ציפור זכר קטן-בינוני במצב הרבייה. בעקבות אוסף, הזרע שניתן להשתמש באופן מיידי עבור מבחני תנועתיות או קפוא להפקת DNA בעקבות הפרוטוקול כפי שיתואר בהמשך. פרוטוקול החילוץ זה היה מעודן לזרע העופות, נעשה בהצלחה על דגימות שנאסף מספר מינים ציפורי שיר מ (פאסר דומסטיקוס Spizella passerina, Haemorhous mexicanus, migratorius ציור ), אחד columbid (ליוויה יונה).

עיסוי cloacal, ה-DNA חילוץ באמצעות שהפרוטוקול המתואר בוצע מספר מינים ציפורי שיר מ, אחד columbid (טבלה 1). הנוכחות של זרע זרע הדגימות שנאספו על ידי עיסוי cloacal אושר על-ידי הצגת כמות קטנה של הדגימות מדולל תחת מיקרוסקופ מתחם בהגדלה X 400 (איור 3). לאחר חילוץ DNA דגימות זרע שנאספו מן הבית דרורים באמצעות פרוטוקול המתואר כאן, שמונה דגימות היו פועלים בג'ל עם סולם הדנ א (שלוש דוגמאות ניתן לראות באיור4). להקות שונות ללא...

פרוטוקול זה מתאר עיסוי cloacal, טכניקה ידני פולשני עבור איסוף זרע מן הציפורים, והפקת DNA מן העופות הזרע באמצעות ערכת חילוץ מסחרי עם שינויים.

אוסף העופות זרע על ידי עיסוי Cloacal ובידוד של ה-DNA של הזרע

Collection of semen may be useful for a wide range of applications including studies involving sperm quality, sperm telomere dynamics, and epigenetics. ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לאסוף זרע מעופים זכרים ולבודד DNA מדגימות הזרע. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות מפתח באקולוגיה התנהגותית ואבולוציונית הקשורות לתחרות בין זרעים ולהורשה אפיגנטית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא קלות השימוש בה.ניתן לבצע עיסוי קלואקלי במהירות בשטח או במעבדה, ושיטת מיצוי ה-DNA משתמשת בערכה זמינה מסחרית עם התאמות. ניתן להשתמש בטכניקה זו בציפורים ברים או בשבוי במהלך עונת הרבייה, ובמצבים מסוימים של ציפורים בשבוי היא עשויה להיות יעילה לאורך כל השנה. אחזו את הזכר הפעיל רבייתית באחיזת מחבנד ביד הבל דומיננטית.לאחר מכן העבירו את הציפור ליד הדומיננטית, כאשר הצד הבטני נוגע בכף היד והראש נמצא בשפה הלטראלית של כף היד. כעת קבעו בעדינות את הראש והגוף באמצעות האצבע הקטנה, האצבע הטבעתית והאצבע האמצעית. כעת פתח השקה וזנב הציפור חשופים.ניתן להשאיר את הרגליים משוחררות או להחזיק אותן קלות באמצעות כף היד. לאחר מכן, הפכו את הקלואקה על ידי הנחת האצבע המורה והאגודל של היד הדומיננטית משני צדדי הקצה העליון שלה, תוך לחיצה קלה וכיוון של הלחץ לעבר הזנב. רירית הקלואקה הוורודה צריכה להופיע בבירור, אלא אם כן הציפור אינה מייצרת זרע.עם הניסיון, קל להבחין בין הקלואקה של זכרים פעילים מינית לזו של זכרים שאינם פעילים. כדי לאסוף זרע, הניחו את כרית האצבע המורה של היד הלא-דומיננטית על הצד הגבי של בסיס הזנב לצורך יציבות, ולאחר מכן הניחו את קצה האגודל ממש מתחת לקלואקה שהוצאה החוצה. מומלץ מאוד להשתמש בציפורן אגודל קצרה וחלקה.כעת הזז את האגודל עמוק לכיוון הקרניאלי (למעלה) בתנועה חזרנית עם לחץ בינוני, תוך שהנך נשאר מתחת לקלואקה עד שהציפור תגמר. תהליך זה עשוי לקחת תנועה אחת בלבד או מספר עשרות תנועות. ברגע שהציפור גמרה, אסוף את זרע הזרע הצמיגי בצבע חום בהיר לתוך צינור מיקרוהמאטוקריט.חומרים לבנים או כהים הם זיהומים, בעוד שכל כמות של דם מעידה על הפעלת לחץ רב מדי. במידת הצורך, חזור על העיסוי כדי לקבל מספר פליטות.כדי לאשר את נוכחותם של תאי זרע בדגימה, יש לבחון כמות קטנה של הדגימה המדוללת תחת מיקרוסקופ אורקלבי בהגדלה של 400X. לאחר מכן, יש לאחסן את דגימות הזרע בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד למועד השימוש. פרוטוקול זה הוא התאמה של ערכה מסחרית.הכינו מנות (aliquots) של 10 µL של DTT בריכוז 1 M במים, ואחסנו אותן בטמפרטורה של 20- °C. רגע לפני תחילת הפקת ה-DNA, ערבבו עבור כל דגימה מנה אחת של DTT עם מנה אחת של tris chloride. לאחר מכן, הוסיפו 70 µL של PBS לכל דגימה וערבבו את התערובות באמצעות וורטקס.לאחר מכן, הוסיפו לכל דגימה תערובת בופר DTT אחת ו-10 µL של תמיסת proteinase K. כדי לערבב את הדגימות, ערבבו אותן במכשיר vortex למשך 20 שניות. כעת, העבירו את הדגימות לאינקובטור בטמפרטורה של 65 °C על שייקר, והדגירו את הדגימות למשך שעה אחת עם ערבול עדין.לאחר הדגירה, הוסיפו 200 µL של buffer AL ו-200 µL של ethanol 100% טרי, וערבבו את הדגימות במערבל Vortex למשך 20 שניות. לאחר מכן, העבירו כל דגימה לעמודת ספין (spin column) וסבבו את הדגימות בצנטריפוגה למשך דקה אחת ב-6,000G. השליכו את מבחנת האיסוף והניחו את העמודות על מבחנות חדשות.הוסיפו 500 microliters של buffer AW1 לעמודה, וסובבו את העמודות שוב. שוב, השליכו את מבחנת האיסוף והניחו את העמודות על מבחנות חדשות. כעת הוסיפו 500 microliters של buffer AW2 וחזרו על מחזור הסבב.בשלב הבא השליכו את הנוזל שעבר (flowthrough), והחזירו את עמודת הספין לצנטריפוגה לסבב של שלוש דקות, הפעם ב-20,000G. לאחר מכן השליכו את מבחנת האיסוף והניחו את העמודה על מבחנה למיקרו-צנטריפוגה. כעת, הוסיפו ישירות על ממברנת העמודה 35 µL של buffer AE והמתינו חמש דקות בטמפרטורת החדר כדי שהתמיסה תבצע אלוציה של ה-DNA.לאחר מכן, העבירו את באפר האלוציה עם ה-DNA אל נבובת המיקרו-צנטריפוגה באמצעות סבוב של 60 שניות. כעת השליכו את העמודים ואחסנו את ה-DNA בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. שיטות עיסוי הקלואקה והפקת ה-DNA המתוארות שימשו בהצלחה במספר מיני שפיריונים ובמין אחד של יונה.כאשר בבדיקת אלקטרופורזה של ה-DNA המופק מופיעים פסים ברורים ללא מריחה, הדבר מעיד על בידוד מוצלח של DNA באיכות גבוהה. דוגמה זו היא של DNA מזרע של דרור בית. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו אוספים בעדינות דגימות זרע מעופים זכרים בוגרים באמצעות עיסוי קלואקאלי, וכיצד למקץ DNA מדגימות זרע אלו באמצעות ערכה למיצוי.ברגע שהטכניקה נלמדת, ניתן לבצע עיסוי קלואקלי תוך שניות ספורות אם הוא מבוצע כהלכה.

avian-semen-collection-cloacal-massage-isolation-dna-from

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

פרוטוקול עבור בידוד והפעלת spermatids מן...

בידוד במבחנה הפעלת Caenorhabditis elegans זרע

סרטון זה מדגים את השאיפה המלעורית של זרע אפידידימלי מחולה עם אזוספרמיה, מצב המאופיין בהיעדר זרעונים בזרע. ההליך כולל חיטוי אזור שק האשכים, שאיבת נוזל אפידידימלי באמצעות מזרק עם תמיסת תרבית מיוחדת ועיבוד הדגימה שנאספה כדי לבודד זרעונים ברי קיימא. הזרעונים המוכנים מוכנים לאחר מכן לשימוש בהליכים מתקדמים לטיפול בפוריות.

טכניקה לשאיפה ועיבוד מלעורי של זרע אפידידימלי

מוטציות De novo בקו הנבט הזכרי עשויות לתרום לתוצאות בריאותיות שליליות בדורות הבאים. כאן אנו מתארים פרוטוקול לשימוש במודל מכרסמים טרנסגני לכימות מוטציות בתאי נבט זכריים המושרות על ידי גורמים סביבתיים.

המהונדס מכרסמים Assay עבור תדר Mutant תאי ניבט זכר כימות

בנייר זה, אנו שואפים לתאר את הביצועים של הטכניקה צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות ויישומו בחקר הפיזיולוגיה של זרע.

אוסף זרע באיכות דיפרנציאלית בעזרת צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

הפריה חוץ גופית היא טכניקה בשימוש נפוץ עם מגוון רחב של אורגניזמים מודל לשמור על אוכלוסיות מעבדה לייצר עוברים מסונכרנים עבור יישומים במורד הזרם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המיישם טכניקה זו עבור אוכלוסיות שונות של הדגים טטרה מקסיקני, Astyanaxמקסיקני.

אוסף המשחק ו הפריה חוץ גופית של Astyanax מקסיאנוס

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור העשרת החומר העשיר pachytene, עגול spermatocytes, ו להאריך spermatocytes מתוך האשכים עכבר למבוגרים באמצעות סרום מתמשך פרה אלבומין הדרגתי עם מעבדה סטנדרטית ציוד.

העשרה של פכיטנא ספרציטים וספרטידים מאשכים עכבר באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטית

כאן אנו מציגים שיטה פשוטה ויעילה לבודד תאי חיידקים מיוטיים ופוסט-מיוטיים חיים מערכי עכבר בוגרים. באמצעות ציטוקסיות נמוכה, צבע מחייב DNA סגול-נרגש ומיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנה, ניתן לבודד אוכלוסיות תאי זרע מועשרים מאוד עבור יישומים רבים במורד הזרם.

בידוד של תאי זרע מורין באמצעות צבע מחייב DNA סגול-נרגש תא חרוש

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע הקלטות חשמליות מתאי זרע של יונקים בתצורת תא שלם, במטרה להקליט ישירות את פעילות תעלות היונים. השיטה הייתה חיונית בתיאור הפרופילים האלקטרופיזיולוגיים של מספר תעלות יוני זרע וסייעה לחשוף את זהותם המולקולרית והוויסות שלהם.

רישום זרמים חשמליים על פני קרום הפלזמה של תאי זרע של יונקים

פרוטוקול זה מתאר שיטה לסינון זרע איכותי עם אינדקס פיצול DNA נמוך על ידי שימוש במאפייני תנועתיות הזרע ותיגמוטקסיס. השיטה משתמשת בנתיב שחייה אופקי בצורת U, המאפשר לזרע איכותי להגיע לצד הנגדי דרך טיפות חיץ, בעוד שזרע מת, פסולת תאים וזיהומים אינם נכללים.

טכניקת שחייה אופקית בצורת U להכנת זרע איכותי עם אינדקס פיצול DNA נמוך

הליך זה נועד לזהות מטבוליטים המועברים מזרע לביציות במהלך ההפריה על ידי שימוש בתיוג איזוטופים יציב עם גלוקוז 2H2O או U13C ואחריו ניתוח מטבולומי. אבות עם תווית דאוטריום מחוברים לסכרים לא מסומנים. עוברים שנאספו לפני ההשתלה מנותחים על ידי ספקטרומטריית מסה כדי למיין מטבוליטים אבהיים (דאוטרטים) ואימהיים (לא דאוטרטים).

תיוג איזוטופ יציב in vivo לזיהוי ספקטרומטריית מסה של מטבוליטים אבהיים המועברים מזרע לביצית במהלך ההפריה

פרוטוקול זה מציג טכניקת מיקרו-שאיירה פשוטה לבידוד תאים סומטיים (SCs) חיוניים מזרע סוסי מוקפיא. בניגוד לגישות המסורתיות, טכניקה זו מונעת תרביות ממושכות במבחנה ומתגברת על זיהום זרע, ומאפשרת שימוש מיידי בשכפול תאים סומטיים.

טכניקת מיקרואספירציה פשוטה לבידוד תאים סומטיים מזרע סוסי משומר כתורמים גרעיניים לשכפול

למדו איסוף זרע מעופות זכרים באמצעות עיסוי קלואקלי ואת שיטת בידוד ה-DNA המותאמת לזרע עופות. הפרוטוקול מאפשר מחקרים באקולוגיה התנהגותית ואבולוציונית ובאפיגנטיקה.

אוסף העופות זרע על ידי עיסוי Cloacal ובידוד של ה-DNA של הזרע

גלה סרטונים נוספים