כינון של נוקלאוזום עם דיפרנציאלי איזוטופ שכותרתו היסטונים אחות

המטרה הכללית של פרוטוקול ביוכימי זה היא ליצור נוקלאוזומים בעלי היסטונים אחים המסומנים באיזוטופים שונים, לשימוש במיפוי תגובות של מודיפיקציות לאחר תרגום בו-זמנית בשני ההיסטונים האחים. המטרה הכללית של פרוטוקול ביוכימי זה היא ליצור נוקלאוזומים בעלי היסטונים אחים המסומנים באיזוטופים שונים, לשימוש במיפוי מודיפיקציות לאחר תרגום בו-זמנית בשני ההיסטונים האחים.

שיטה זו, בשילוב עם טכניקות ברזולוציה גבוהה למיפוי מודיפיקציות פוסט-טרנסלציונליות כגון ספקטרוסקופיה של מסות, נותנת מענה לשאלות מפתח בביולוגיה של הכרומטין, כמו אילו מנגנונים תורמים להיווצרותם של נוקלאוזומים שעברו מודיפיקציה סימטרית? היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן להקימה בקלות במעבדה ביוכימית, כיוון שהיא משלבת פרוטוקולים סטנדרטיים לשחזור נוקלאוזומים עם מתודולוגיות נפוצות לטיהור חלבונים. שני מאגרים של היסטון H3 ישמשו לשחזור האוקטמר.

H3 המסומן בחנקן 15 המכיל תג פוליהיסטידין בקצה האמינו, ו-H3 המסומן בפחמן 13 המכיל תג זיקה לסטרפטאווידין בקצה האמינו. התחל את הפרוצדורה על ידי המסה של מנות ההיסטונים הליופיליזות, כולל שני סוגי ההיסטון H3, בבופר פריסה (unfolding buffer). לכל מבחנה המכילה כ-5 mg של היסטונים, הוסף 1 mL של בופר פריסה וערבב באמצעות פיפטה, אך אין להשתמש בוורטקס.

שמרו את המבחנות על קרח למשך 30 דקות כדי לאפשר פריסה מלאה. לאחר מכן, מדדו את הבליעה ב-280 nanometers כדי לקבוע את הריכוז המדויק של כל היסטון. ערבבו את ההיסטונים של הליבה ביחסים מולריים שווים, תוך הקפדה לכלול 50% מכל אחד משני מאגרי ההיסטון H3.

השתמשו בבופר פריסה (unfolding buffer) כדי להתאים את ריכוז החלבון הסופי לכ-1 mg/mL. העבירו את התערובת לממברנת דיאליזה עם סף של 6 kDa, ובצעו דיאליזה כנגד 1 עד 2 ליטר של בופר קיפול מחדש (refolding buffer) מקורר בטמפרטורה של 4 °C.

ביום למחרת, אספו את החומר שעבר דיאליזה והסירו משקעים באמצעות סרכז במיקרוצנטריפוגה למשך חמש דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס במהירות מקסימלית. לאחר קביעת ריכוז האוקטמר, השתמשו ביחידת סינון צנטריפוגלית עם סף של 10 kilodalton כדי לרכז את האוקטמר לנפח סופי של כ-2 milliliters. יש להגיע לריכוז אוקטמר שבין 50 ל-100 micromolar.

הכינו את הסינון בג'ל על ידי חיבור עמודת סינון הג'ל למערכת FPLC. בצעו שיווי משקל באמצעות שני נפחי עמודה (CV) של תמיסת קיפול מחדש (refolding buffer) שעברה סינון של 0.22 micrometer וניקוז גזים. הזריקו את החומר המרוכז בקצב זרימה של one milliliter לדקה ואספו מקטעים של one to 1.5 milliliter.

כדי להתחיל בפרוצדורה זו, איסוף את הפראקציות הרלוונטיות המכילות אוקטמרים טהורים וקבע את הריכוז כפי שתואר קודם לכן. חבר עמודת nickel nitrilotriacetic acid או עמודת nickel NTA בנפח של 1 mL למערכת ה-FPLC. בצע שיווי משקל עם 10 CV של באפר קיפול (refolding buffer) שעבר סינון של 0.22 µm וניקוון, בקצב זרימה של 1 mL לדקה.

העבירו את האוקטמר המטוהיר דרך ה-nickel NTA בקצב זרימה של 1 mL לדקה. אספו את השטוף (flow through). בצעו אלוציה באמצעות 10 CV של בופר קיפול מחדש (refolding buffer) המכיל 250 mM imidazole בקצב זרימה של 1 mL לדקה.

אסוף את אלוציית ה-nickel NTA. את הטיהור המבוסס על סטריפטאווידין (streptavidin) יש לבצע באופן אידיאלי בחדר קר. שיווי משקל של עמודת זיקה (affinity column) מסחרית של סטריפטאווידין בנפח של מיליליטר אחד יבוצע עם 10 CV של באפר קיפול (refolding buffer) המכיל 250 millimolar imidazole, תוך שימוש במערך של זרימה בכבידה במגש (batch gravity flow).

העבירו את תמיסת האלוציה של ה-nickel NTA דרך עמודת זיקה של streptavidin. אספו את השבירה (flow through). בצעו אלוציה באמצעות 10 CV של בופר קיפול מחדש (refolding buffer) המכיל 2.5 millimolar desthiobiotin.

אספו את התמיסה שנשטפה (elution). לאחר מדידת ריכוז האוקטמר בתמיסה, הוסיפו כמות של פרוטאז TEV הנמוכה פי 10 מריכוז האוקטמר והניחו לתגובה להימשך במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C. למחרת, העבירו את התערובת לממברנת דיאליזה עם סף של 50 kilodalton ובצעו דיאליזה מול בופר קיפול (refolding buffer) במהלך הלילה בטמפרטורה של 4°C.

רכז את האוקטמר האסימטרי המטוהה באמצעות יחידת סינון צנטריפוגלית עם סף של 10 kilodalton לנפח של מיליליטר אחד עד שניים. ריכוז האוקטמר הצפוי הוא 20 עד 50 micromolar. שחזור נוקלאוזום דורש DNA המכיל רצף למיקום נוקלאוזומים.

כוון את ריכוז המלח של ה-DNA ל-2 M sodium chloride באמצעות תמיסת סטוק של 5 M sodium chloride. ערבב את ה-DNA עם האוקטמר ועם באפר קיפול מחדש (refolding buffer) לפי יחס האוקטמר ל-DNA האופטימלי שנקבע בבדיקה בקנה מידה קטן. הוסף את האוקטמר אחרון כדי למנוע כל אפשרות של ערבוב האוקטמר וה-DNA בריכוז מלח נמוך מ-2 M.

העבירו את התערובת לממברנת דיאליזה עם סף חיתוך של six kilodalton ובצעו דיאליזה כנגד ליטר אחד של באפר קיפול (refolding buffer) למשך לילה בטמפרטורה של four degrees Celsius. למחרת, הפחיתו את ריכוז המלח של באפר הדיאליזה באופן מדורג, תוך השארת הדגימה בכל באפר sodium chloride למשך שלוש שעות לפחות.

בשלב הבא, העבירו את ממברנת הדיאליזה לכוס כימית עם ליטר אחד של באפר בדיקה והמשיכו בדיאליזה למשך הלילה בטמפרטורה של 4 °C. למחרת, אספו את הדגימה שעברה דיאליזה. הסירו כל משקע שנוצר באמצעות סבוב בצנטריפוגת מיקרו למשך חמש דקות בטמפרטורה של 4 °C במהירות מקסימלית.

רכז את הדגימה באמצעות יחידת סינון צנטריפוגלית עם סף של 30 kilodalton לנפח סופי של כ-300 microliters. מדוד את ריכוז ה-DNA באורך גל של 260 nanometers. הריכוז הסופי צריך להיות בטווח של 10 עד 20 micromolar.

יש לאחסן את הדגימה בטמפרטורה של 4 °C למשך מספר שבועות. פרופיל אלוציה של סינון ג'ל של תערובת ההיסטונים המקופלים מחדש מראה את האוקטמרים של ההיסטונים נשטפים בנפח של כ-70 milliliters. ג'ל SDS PAGE מראה את הסטוכיומטריה הנכונה של ההיסטונים.

מאגר האוקטמרים המשוחזר, המכיל את שלושת סוגי האוקטמרים, עובר תהליך של טיהור זיקה בשרשרת (tandem affinity purification). בידודם של המינים האסימטריים מאומת באמצעות נוכחות תג הזיקה. לאחר מכן, תגי הזיקה מוסרים בעזרת פרוטאז TEV.

שחזור נוקלאוזומים בקנה מידה קטן, תוך שימוש ביחסים מולריים שונים של DNA לאוקטמר, הראה כי יחס של אחד לאחד הוא האופטימלי. שחזור נוקלאוזומים בקנה מידה גדול בוצע תוך שימוש ביחס המולרי האופטימלי של DNA לאוקטמר, ונצפתה סטוכיומטריה נכונה של ארבעת ההיסטונים בליבה. ספקטרוסקופיית NMR של נוקלאוזומים המסומנים באיזוטופים שונים אישרה את נוכחותם של היסטוני H3 אחיים המסומנים בחנקן 15 ובפחמן 13.

בדוגמה זו ליישום, נוקלאוזומים שסומנו באופן דיפרנציאלי באיזוטופים ופספורפלו באופן אסימטרי בטבעת C 10 של היסטון H3 הגיבו עם GCN5 acetyltransferase. ואת האצטילציה של ליזין 14 בהיסטון H3 בשני עותקי ה-H3 עקבו בזמן אמת באמצעות ספקטרוסקופיית NMR. הניתוח גילה כי פוספורילציה של טבעת C 10 של היסטון H3 מעוררת את האצטילציה של ליזין 14 בהיסטון H3 על ידי GCN5 ב-cis בהשוואה ל-trans.

ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצעה בחמישה ימים אם היא מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לשחזר נוקלאוזומים המכילים היסטונים אחיים בעלי מאפיינים שונים.