Name: הכנה של כרומוזום Meiotic מתפשטת העכבר Spermatocytes (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: למד הכנת כרומוזומים מיוטיים מתפשטים מתאי זרע של עכבר לחקר מיוזיס זכרי. השיטה מאפשרת תצפית בשלבי פרופאזה 1 ומנגנוני סגירת שברי DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים להכיר את הסיוע הטכני של אביגיל האריס. הם גם מכירים כהן פאולה, קים הולוויי שעזרת כדי למטב את הפרוטוקול של הכנת השטח-התפשטות גרעינים של העכבר spermatocytes. המחברים גם מעריך קריאה ביקורתית של כתב היד על-ידי קארן שינדלר.
עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 GM106262 כדי K.M.B.

כל השיטות מעורבים עכברים מנוצל אתיות גבוהה וסטנדרטים רווחה, אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת דרקסל.
1. הכנה של פתרונות וכלים הדרושים
<ol><li>להכין היפוטוניק החילוץ מאגר לייצוגית ב 50 מ של מים כיתה מעבדה הנדסה גנטית, pH 8.2-8.4 (טבלה 1). להפוך את הפתרון טרי כל הזמן, לשמור על הקרח, והשתמש בתוך 2 h הכנת כפולות; הדבר נחוץ למטב את הפחתת ואת פרוטאז עיכוב פעילות של DTT ושל PMSF, בהתאמה. השתמש 10 מ"ל של מצגת עבור כל זוג של העכבר האשכים.</li>
	<li>להכין פתרון סוכרוז 100 מ מ (טריים בכל פעם) על-ידי הוספת 0.342 גר' סוכרוז 10 מ"ל של הנדסה גנטית מעבדה כיתה מים. להתאים את ה-pH ל 8.2</li>
	<li>להכין פתרון מקבע (1% paraformaldehyde (PFA), 0.15% טריטון X-100, pH להתאים ל- 9.2 עם 1 N HCl או 1 N NaOH) חודשי טריים ומאגר זה בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. לדלל 16% זמינים מסחרית PFA המוצא מניה עד 4% ב- PBS 1 X לשימוש כמו מניה עבודה ולאחר מכן לאחסן 4% aliquots ב-20 ° C.<ol>
<li>כדי להכין את הפתרון מקבע, להוסיף 10 מ של פתרון PFA 4% ו- 600 µL של 10% טריטון X-100 30 מ של 1 X PBS, מערבבים היטב, ולהתאים את רמת ה-pH ל 9.2 עם 1 N HCl או 1 N NaOH. אחסן את הפתרון מקבע צינור חרוטי 50-mL עטוף בנייר אלומיניום בטמפרטורת החדר (עבור לא יותר מ 4 שבועות).</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין פתרונות כביסה (בעוד שקופיות מתייבשים על 30 דקות האחרונות) עם תמונה-פלו 200: 0.4% צילום-פלו 200/PBS (320 µL של צילום-פלו 200 ב- 80 מ של 1 X PBS) ו- 0.4%, פלו צילום 200/dH2O (160 µL של צילום-פלו 200 ב 40 מיליליטר מים כיתה מעבדה הנדסה גנטית). השתמש צנצנת Coplin 50 מ ל מלא עם 40 מ"ל של פתרונות כדי לשטוף את שקופית 10 או פחות בכל פעם.</li>
	<li>הכנת הכלים הבאים: 1. זוג מספריים כירורגיים (כדי פצעים וחתכים בעור), 1 זוג עצה בסדר מספריים כירורגיים (כדי פצעים וחתכים של הצפק), 2 זוגות של קצה ישר בסדר מלקחיים (לנתח את כל testis), 1 שוליים ישרים גילוח (כדי פצעים וחתכים כל testis), 2 זוגות של מעוקלים עצה מלקחיים (כדי לשתק כל testis) לסחוט בקוריאנית וכמה, צנצנות Coplin 50 מ ל, טפלון מודפס 3 מגלשות טבעת, האיזמל 1 עם להב מידה 11, תא humidified, צלחות פטרי 100 x 15 מ מ, סמן קבוע בסדר עצה או עיפרון, ו- a שאכר מסתובב פלטפורמה.<ol>
<li>המקום פרימיום לא טעונים precleaned שקופיות זכוכית חלבית סוף זקוף בתוך צנצנת Coplin 50 מ ל מלא עם מקבע פתרון עד השימוש. הערה: עיפרון היא עדיפה אם השקופיות ישמש לאחר מכן בהליכים הדורשים אתנול, כגון קרינה פלואורסצנטית בחיי עיר הכלאה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. spermatocyte גרעינים מתפשטת
<ol><li>המתת חסד עכבר זכר בהתאם להנחיות מוסדיים (למשל צוואר הרחם פריקה עם או בלי חנק2 CO).</li>
	<li>שימוש P10 - P20 הזכרים כדי להעריך את התאים meiotic הגל הראשון של יצירת זרע; אנו משתמשים באופן שגרתי P15 - זכרים P17 להשיג תאים של כל substages של prophase ט האשכים למבוגרים תספק תאים מחלון prophase אני יותר מדי, אבל הם גם תניב תאים postmeiotic יותר, כמו spermatids.</li>
	<li>הקציר ולשקול את האשכים (להקליט את המשקולות מזווג); ואז למקם אותם לתוך צלחת פטרי המכילות מספר טיפות של מצגת קר כדי לשמור על לחות.</li>
	<li>להחזיק בזרמה בתחתית קערה עם קצה מעוגל מלקחיים ולהשתמש תער שוליים ישרים לעשות חתך קטן קו האמצע האנכי באמצעות הקפסולה של בזרמה. בעודו מחזיק בזרמה בתחתית קערה עם מלקחיים אחד, השתמש קבוצה שנייה של קצה מעוגל מלקחיים או שוליים ישרים גילוח לסחוט בעדינות את בקוריאנית וכמה מן בזרמה.<ol>
<li>מקם את בקוריאנית לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של מצגת קר, מקפיד להימנע לשים את החלקים של הקפסולה לתוך הצינור. חזור על שלבים אלה עם בזרמה השני.</li>
	</ol>
</li>
	<li>דגירה בקוריאנית וכמה את decapsulated בצינור חרוט המכילים מצגת על קרח למשך 30-60 דקות, בהתאם לגודל של האשכים. דגירה בקוריאנית וכמה מכל זוג של האשכים במשקל של 30 מ"ג או פחות במשך 30 דקות, בקוריאנית מזוג האשכים במשקל 31-50 מ"ג במשך 30-45 דקות, ועל האשכים גדולים יותר עבור 60 דקות. לא תשנה את זמני עבור מבחן יחיד. הערה: זמן הדגירה אופטימלית עשוי להשתנות בהתאם החוויה של הנסיין, ריאגנטים המשמש העכברים שעוברים ניתוח.</li>
	<li>בעוד בקוריאנית וכמה הם המקננת במצגת, השתמש הסמן או עיפרון לתייג את הקצוות עמומה של שקופיות precleaned עם העכבר מספר, מספר שקופית ותאריך. ואז למקם את השקופיות מראש נקי בתוך צנצנת Coplin המכיל את הפתרון מקבע.</li>
	<li>בעקבות דגירה, שופכים בקוריאנית, מצגת לתוך צלחת פטרי נקי, בקוריאנית נפרד לתוך כ 3 מ מ קוטר גושים. כל סבך מניב 2 מגלשות, מספר השקופיות הניב תלוי בגודל של האשכים. הערה: אנו משיגים 8 שקופיות של פראי סוג ושקופיות 6 מ- subfertile Chtf18-null P16 האשכים (שהם קטנים יותר עקב ירידה מספרים של תאי נבט meiotic ו mitotic8). Testis מבוגר אחד במשקל של 100 מ ג או יותר יהיה צפוי להניב שקופיות 16.</li>
	<li>23 מקום µL של 100 מ מ פתרון סוכרוז לתוך טבעת אחת ציפוי טפלון מודפס, 3 טבעת שקופיות ולהוסיף אחד קווצת בקוריאנית וכמה הטבעת.  ולאחר מכן שימוש מעוקל עצה מלקחיים להחזיק את סבך, מינצ בעדינות את בקוריאנית עם תער 11 גודל עד הפתרון הופך מעוננים. הערה: לא overmince כמו התוצאה תהיה כרומוזומים מפוצלים. שימו לב כי הכרומוזומים מפוצלים יכול להיות גם מעידה על הפנוטיפ המוטנטי.</li>
	<li>הסרת לכלוך, להוסיף עוד 23 µL של סוכרוז פתרון ולהשתמש micropipette כדי בעדינות pipette את התערובת למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לסייע להפריד את התאים ההשעיה.</li>
	<li>הסר שקופית תטבול את הצנצנת Coplin המכילה מקבע פתרון, להטות את השקופית מעל הצנצנת אז זה droplet נדיב אחד אוסף בפינה התחתונה של השקופית.<ol>
<li>Pipet 20 µL של סוכרוז השעיה תא מטבעת של השקופית המודפסת טבעת 3 טפלון לתוך ה-droplet מקבע על פרמיה מזוגג שקופיות זכוכית, pipet המתלים לאורך 2 - 3 פעמים. הערה: ה-droplet מקבע צריך להיות גדול מספיק באמצעי אחסון כך תוספת של 20 μL של התליה תא סוכרוז אליו מאפשרת כיסוי על פני השקופית כולה כאשר התערובת היא התפשטה (ראה 2.11 להלן).</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאט לאט להטות את השקופית לצד מול ה-droplet כדי להפיץ את התליה תא לאורכו של השקופית. ואז לאט לאט להטות את השקופית בחזרה כדי להפיץ את התליה תא לרוחב השקופית כדי לכסות את זה לחלוטין. הימנע שמתפשטת ההשעיה באותו האזור של השקופית יותר מאשר פעם אחת אחרת שהתאים יחפוף אחד עם השני.</li>
	<li>מיד למקם שקופית שטוח בתוך תא humidified, חזור על השלבים 2.8 ל 2.11 עד כל גושים של בקוריאנית וכמה שימשו כדי להפוך את שקופיות. חשוב לא להעביר תא humidified במהלך תהליך הייבוש כדי למנוע קורע חופפים תאים.</li>
	<li>לאפשר שהשקופיות דגירה בתוך תא humidified מכוסה בטמפרטורת החדר במשך 2.5 h כך הם יבש לאט, לא לגמרי. לחות גבוהה, ייבוש איטי בשלב זה הם חשובים להבטיח הפצה נאותה של כרומטין. לאחר מכן להסיר את הכיסוי של התא, לאפשר את השקופיות מילה נהדרת לחלוטין מינימום 30 נוספים.</li>
	<li>מקום שקופיות (גב אל גב או בתבנית זיגזג) בתוך צנצנת Coplin המכיל פתרון צילום-פלו 200/1 X PBS 0.4% לשטוף את השקופיות פעמיים, 5 דקות כל אחד, על-ידי בעדינות לזעזע את Coplin ג'אר על פלטפורמה מסתובבת שאכר. להשתמש בפתרון טריים עבור כל כביסה, למנוע שקופיות שונים עכברים בצנצנות נפרדות עבור כל אחד שוטף.</li>
	<li>לשטוף את השקופיות בצנצנת Coplin המכיל 200/dH2O 0.4% צילום-פלו לפתרון 5 דקות פעם תוך כדי לזעזע.</li>
	<li>הסר שקופיות מחלוקה Coplin ג'אר (שטיפה אחרונה), בזהירות לנגב את הקצוות ואת תחתית של השקופיות כדי להסיר עודפי נוזלים, ולמקם שקופיות במיקום זווית, כמעט זקוף יבש. נסיינית אשר בקיא בכל טכניקה זו ניתן לעבד ולהכין השטח-התפשטות גרעינים של 4 או 5 עכברים ביום אחד.</li>
	<li>פעם יבש (15-20 דקות), לעבד שקופיות מיד immunofluorescence מכתים או חנות ב-80 מעלות צלזיוס בתוך קופסת השקופיות סגורים היטב מוגן מפני אור לכל היותר 3 שבועות (בהתאם החלבונים היעד חישובו; תוצאות אופטימליות ניתן להשיג אם מוכתם באותו יום או תוך שבועיים).<ol>
<li>אם מאוחסן ב- 80 ° C, ואז אפשר שקופיות לבוא לטמפרטורת החדר, לשטוף בצנצנת Coplin המכיל 1 X PBS או בלוק במשך 5 דקות לפני צביעת. הערה: פרוטוקולים רבים מוכתמים immunofluorescence שונים תספק תוצאות טובות; מתייחסים אל ברקוביץ ואח עבור פרוטוקול immunostaining8.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Handel, M. A., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+mammalian+meiosis%3A+regulation%2C+dynamics+and+impact+on+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility.</a> Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).</li>
<li>Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+drying-down+technique+for+the+spreading+of+mammalian+meiocytes+from+the+male+and+female+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline.</a> Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).</li>
<li>Counce, S. J., Meyer, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+the+synaptonemal+complex+and+the+kinetochore+in+Locusta+spermatocytes+studied+by+whole+mount+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy.</a> Chromosoma. 44, 231-253 (1973).</li>
<li>Speed, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiosis+in+the+foetal+mouse+ovary.+I.+An+analysis+at+the+light+microscope+level+using+surface-spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading.</a> Chromosoma. 85, 427-437 (1982).</li>
<li>Ashley, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+Rad51+distribution+on+chromatin+during+meiosis+in+male+and+female+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates.</a> Chromosoma. 104, 19-28 (1995).</li>
<li>Baker, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+mouse+mLh1+in+DNA+mismatch+repair+and+meiotic+crossing+over%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over.</a> Nat Genet. 13, 336-342 (1996).</li>
<li>Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+association+of+Rad51+protein+with+selected+sites+in+meiotic+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).</li>
<li>Berkowitz, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+CHTF18+causes+defective+meiotic+recombination+in+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice.</a> PLoS Genet. 8, e1002996(2012).</li>
<li>Gomez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sororin+loads+to+the+synaptonemal+complex+central+region+independently+of+meiotic+cohesin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes.</a> EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).</li>
<li>Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+cohesins+in+mitosis%2C+meiosis%2C+and+human+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease.</a> Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).</li>
<li>McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cohesin+in+gametogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Cohesin in gametogenesis.</a> Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).</li>
<li>Rankin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+elaboration%3A+making+sense+of+meiotic+cohesin+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics.</a> FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).</li>
<li>Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+CNTD1+is+critical+for+meiotic+crossover+maturation+and+deselection+of+excess+precrossover+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites.</a> J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).</li>
<li>La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+short-term+culture+of+mouse+spermatocytes+for+analysis+of+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis.</a> Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).</li>
<li>Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+premature+G2%2FM-phase+transition+in+pachytene+spermatocytes+includes+events+unique+to+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis.</a> Dev Biol. 169, 557-567 (1995).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

כדי לקבל מספר גבוה של איכות להפיץ. ובכן, טוב spermatocyte גרעינים, השלבים הקריטיים ביותר של פרוטוקול זה לכלול זמן הדגירה המתאים של בקוריאנית וכמה מצגת, המתאימה הא של וכמה בקוריאנית, והעסיק הטכניקה כדי התפזר התליה תא סוכרוז השקופיות מצופה מקבע. אנחנו דגירה בקוריאנית וכמה מן האשכים של הזכרים פראי סוג החל היום לאחר הלידה 15 לבגרות במצגת למשך 45 דקות, תוך האשכים מ וזהובה בגילאי Chtf18-עכברים null מודגרת למשך 30 דקות בלבד כי האשכים בגודל חצי ומכילים באופן משמעותי פחות בתאי הנבט8. מניסיוננו, דג...

עכברים הם בשימוש נרחב כאורגניזם מודל ללמוד מיוזה ביונקים. ניתן להעריך תהליכים התפתחותיים רגילים והן פגמים להתרחש במהלך המיוזה. ניתן לאפיין את ציר הזמן ואת ההתקדמות של תכונות בולטות להתרחש במהלך prophase ו- substages, כמו גם שפע של חלבונים ספציפיים המעורבים בתהליכים מכריע רגולציה של מיוזה פראי סוג ועכברים מוטנטים. מספר תהליכים מיוחדים המתרחשים במהלך המיוזה שניתן יהיה ללמוד בפירוט (נבדקה הנדל ו Schimenti1). אלה כוללות מערך כפול-strand break (DSB) ה-DNA ותיקון, רקומבינציה, היווצרות קומפלקס synaptonemal, ו כרומוזום סגרגציה.
היבט חשוב של הלומדים תהליכים meiotic הוא היכולת לבחון גרעינים המכילים כרומוזום הומולוגי הנפתרות חזותי, שטיחות טוב יותר להבחין ולזהות את substages של prophase אני Prophase אני מורכבת 5 substages זה מאופיינים בתכונות ספציפיות, כולל הקמת המתחם synaptonemal (SC). SC הוא חלבון ה-tripartite לגרדום המאפשר שיוך ו DNA כפול-strand break לתקן של homologs. במהלך leptonema, homologs ישר כפי צירית יסודות SC ברורים. אז מצורף של אלמנטים מרכזיים למתחם synaptonemal במהלך zygonema מקלה על שיוך ופיזית חיבור (synapsis) בין זוגות של homologs. במהלך pachynema, synapsis של homologs הופך מוחלט, הדי ג'יי ג'יי אברהמס נוצרות מתוך תיקון של אוכלוסיה בחירה של מעברי כפול-גדיל DNA באמצעות רקומבינציה הומולוגית. SC פירוק במהלך diplonema, ומאפשר homologs desynapse אבל יישארו מצורפים centromeres שלהם ועל אתרים של הדי ג'יי ג'יי אברהמס. בסופו של דבר במהלך diakinesis, homologs recondense ומתרחשת המעבר מפה של1.
מבחינה היסטורית, השמת השטח של כרומטין meiotic הניב כמה גרעינים, במיוחד אלה של שלבים המוקדמים של prophase אני2. כתוצאה מכך, שונו שיטות אלה כדי לשפר את ההפרדה של תאים ברקמות (קרי testis או שחלה), בטכניקה של כרומטין meiotic מתפשטת, את התשואה של גרעינים meiotic באיכות גבוהה עבור הערכה2,3, 4. בנוסף, שיטה זו הוכיחה להיות שימושי בשימור גרעינית, כרומטין כרוך חלבונים גרעינים meiotic כפי שמגלה immunolocalization שפורסמו טכניקות5,6,7. לכן, השיטה בתחילה מתוארת על ידי פיטרס2 והפגינו כאן תשואות הרבה גרעינים spermatocyte פרץ נפרד המכיל homologs שעברו את substages leptotene, zygotene, pachytene, diplotene ו diakinesis של prophase אני.
בטכניקה של הכנת השטח-התפשטות גרעינים (נקרא גם ניתוח התפשטות כרומטין) נעשה שימוש נרחב ללמוד מיוזה בתחומי ביולוגיה הרבייה של התא. שקופיות המכילה השטח-התפשטות הגרעינים ניתן לאחר מכן immunostained עם נוגדנים חלבונים עניין או נתון צביעת כסף, ולאחר מכן נותחו עם מיקרוסקופ. השיטה זו דומה עבור עכברים גם זכר וגם נקבה, למרות השינויים שתוארו עבור עכברים הנשי2. חשוב להימנע overmince וכמה בקוריאנית. הגרעינים חייב גם להיות להתפשט כך בעקבות immunostaining homologs, חלבונים הקשורים נראים בבירור עם מיקרוסקופ. השטח-התפשטות הגרעינים ניתן מוכן תוך שעות ספורות גם immunostained מיד או המאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס לכל היותר 3 שבועות לפני מפשיר ו- immunostaining. עם זאת, תוצאות אופטימליות מתקבלים בצורה הטובה ביותר עבור חלבונים מסוימים אם immunostaining מתבצע באופן מיידי או בתוך 2 שבועות של הכנת השטח-התפשטות גרעינים. שקופיות יכול להיות immunostained עם פרוטוקול תקני באמצעות נוגדנים חלבונים של עניין, ואחריו הדגירה עם חלבונים מצומדת כדי פלורסנט נוגדנים משניים או צבע, ולאחר מכן עם תמונה עם פלורסצנטיות מיקרוסקופ8. ב 21-15 יום לאחר הלידה יש רקמות מספיקות לכל זוג של האשכים פראי סוג להניב שקופיות 6-10, עכברים בוגרים (כולל מבוגרים) תניב עוד שקופיות. עם זאת, פראי סוג עכברים 6 שבועות של גיל ומעלה גם תניב התאים יותר פוסט-meiotic (קרי spermatids) בשקופיות בעקבות immunostaining. בנוסף, כל substages של prophase אני יכול להיות שנצפו בעכברים לנוער ומבוגרים. האשכים מן הזכרים כמחנכת ימים 10 15 תניב הרבה יותר תאים leptotene ו- zygotene. עכברים שגילם יום כמחנכת 14 עד 15 תניב יותר גרעינים pachytene ו- diplotene.
כאן אנחנו מתארים ומדגימים שיטה בשימוש נרחב של הכנת השטח-התפשטות גרעינים של העכבר spermatocytes.

<table><tbody><tr><td>פוטו-פלו 200</td><td>קודאק</td><td>1464510</td><td></td></tr><tr><td>16% פרפורמלדהיד (תמיסה מימית פורמלדהיד)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>RT 15710</td><td>לדלל תמיסה של 16% ל-4% מלאי עבודה עם 1X PBS ולהקפיא את הכמות ב-20 מעלות; C</td></tr><tr><td>טפלון מודפס 3 שקופיות טבעת</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>63418-11</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות זכוכית חלבית פרימיום לא טעונות</td><td>מספר מותגים</td><td></td><td>מסחריים נקו שקופיות באלכוהול אתילי או איזופרופיל והניחו לטפטף להתייבש לפני השימוש; שקופיות תווית על קצה חלבי עם טוש או עיפרון קבוע בהתאם לשימוש לאחר מכן בשקופיות</td></tr><tr><td>מספריים כירורגיות (טיפים חדים ובוטים)</td> <td>כלי</td> <td>מדע עדינים14001-12</td><td>מותג שונה מסוג דומה יעבוד</td></tr><tr><td>מספריים כירורגיות עם קצה דק (טיפים חדים)</td> <td>Fine Science</td><td>Tools 14058-11</td><td>מותג שונה מסוג דומה יעבוד</td></tr><tr><td>מלקחיים ישרים עם קצה עדין</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td>מותג אחר מסוג דומה יעבוד</td></tr><tr><td>מלקחיים מעוקלים עם קצה בינוני</td><td>פישר</td><td>16100110</td><td>מותג אחר מסוג דומה יעבוד</td></tr><tr><td>ידית אזמל</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>מותג שונה מסוג דומה יעבוד</td></tr><tr><td>עכבר אנטי-SYCP3</td><td>Abcam</td><td>ab97672</td><td>השתמש בשעה 1:300</td></tr><tr><td>חלבון אנטי צנטרומר (נגזר מסרום מטופל CREST אנושי)</td> <td>נוגדנים משולבים</td><td>15-234-0001</td><td>השתמש בשעה 1:50</td></tr><tr><td>תא</td><td></td><td></td> לח <td>אנו משתמשים בכלי תרבות מרובעים Nunc 500 ס"מ / באר עם נייר לח מגבות</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ שדה רחב עם מיקרו-מערכות אפיפלואורסצנטיות</td><td>Leica</td><td>כל דגם סטנדרטי</td>צנצנות קופלין מספר מותגים מסחריים קיבולת 50 מ"ל; קוטר 40 מ"מ (1.6 אינץ'), מכיל 10 שקופיות (גב אל גב)צלחות פטרי מספר מותגים מסחריים בקוטר 100X15 מ"מ, פוליסטירן סטרילי לא מטופל <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הכנה של כרומוזום meiotic מתפשטת העכבר spermatocytes

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes

בתרבית של המיוזה היא תהליך התפתחותי דינמי כי מתרחשת בתאי הנבט, ניתן ללמוד מאופיין. באמצעות שיטה כדי להפיץ את הגרעינים על פני השטח של שקופיות (ולא לזרוק אותם מגובה), נדגים שיטת אופטימיזציה על העכבר spermatocytes אשר תוארה לראשונה בשנת 1997. בשיטה זו נעשה שימוש נרחב במעבדות ללמוד בתרבית של המיוזה כי זה מניב שפע של גרעינים איכותיים שעברו substages של prophase אני וכמה בקוריאנית ממוקמים תחילה בתמיסה היפוטוניק להתנפח spermatocytes. ואז spermatocytes משתחררים אל פתרון סוכרוז ליצירת השעיה תא, גרעינים פזורים על גבי מדרון זכוכית ספוג מקבע. בעקבות immunostaining, מגוון של חלבונים שהם נוגעים לתהליכים meiotic יכולים להיבדק. לדוגמה, חלבונים של המתחם synaptonemal, מבנה התלת-צדדי המחבר בין כרומוזום הצירים/הליבות של homologs יחד, ניתן בקלות לאבחן. רקומבינציה meiotic חלבונים, אשר מעורבים תיקון של מעברי כפול-גדיל ה-DNA על ידי רקומבינציה הומולוגית, יכול להיות גם immunostained כדי להעריך את ההתקדמות של prophase אני. כאן אנחנו מתארים ומדגימים בפירוט טכניקה בשימוש נרחב ללמוד בתרבית של מיוזה ב spermatocytes של נער או מבוגר זכר עכברים.

היכולת של שיטה זו לספק מספר רב של השטח להפיץ גרעינים המכילים homologs שלם תלוי בשלושה גורמים עיקריים: 1) זמן הדגירה המתאים של בקוריאנית וכמה במאגר היפוטוניק (דהיינו האם) כדי להשיג שלמאחה מתנפח spermatocyte הגרעינים פרץ, אך לא מתפוררות מ ממושך דגירה של מצגת, 2) micropipetting טיפות סוכרוז של תאים כדי לקבל השעיה מופרדים של גרעינים זה לא מקובצים יחד ו- 3) הטיית כל מקבע מצופה לשקופיות בכיוון אחד בכל פעם לא אחורה וקדימה. לאחר התפשטות מוכן, משטח גרעינים יכול להיות immunostained עם נוגדנים fluor...

מיוזה הוא תהליך התפתחותי שבו נוצרות גמטות דרך סבב אחד של שכפול ה-DNA, שני סיבובים רצופים של כרומוזום סגרגציה. מיוזה יונקים יכולים להיבדק על ידי ניצול טכניקה כדי להכין ממרחים כרומוזום meiotic. . הנה, נדגים שיטה של הכנת השטח-התפשטות גרעינים של העכבר spermatocytes.

הכנה של כרומוזום Meiotic מתפשטת העכבר Spermatocytes

Mammalian meiosis is a dynamic developmental process that occurs in germ cells and can be studied and characterized. Using a method to spread nuclei on ...

המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להכין פריסות של כרומוזומי מיוזה מספרמטוציטים של עכבר כדי לאפשר את חקר המיוזה הזכרית. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה הרבייתית בנוגע למנגנונים המסדירים את הרקומינציה המיוטית ואת ההפרדה הכרומוזומלית. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מניבה שפע של גרעיני ספרמטוציטים בשלבים שונים של המיוזה, ובמיוחד תאים הנמצאים בתתי-השלבים של פרופאזה 1.הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כיוון שקושי רב הוא להסביר בכתב את הטכניקה המשמשת לפריסת גרעיני הספירמטוציטים על עלויות. התחל בשקילת זוג אשכים שהוצאו מעכברי זכר מגיל לאחר הלידה ועד גיל בוגר, והנח את הדגימות שנשקלו בצלחת פטרי המכילה מספר טיפות של תמיפת מיצוי היפוטונית קרה. כדי להוציא את השפופרות, השתמש בקצוות של פינצטה מעוקלת כדי להחזיק אשך אחד כנגד תחתית הצלחת, והשתמש בלהב תער ישר כדי לבצע חתך אנכי קטן בקו האמצע דרך קפסולת האשך.השתמשו בסט שני של פינצטות קמורות או בלהב תער ישר כדי לסחוט בעדינות את הרנורי השבלה (seminiferous tubules) מהאשך ולהעבירם למבחנה קונית של 15 milliliter המכילה 10 milliliters של חוצץ מיצייה היפוטוני קר, תוך הקפדה להימנע מאיסוף חלקי קפסולת האשך יחד עם הרנורים. כאשר כל הרנורים נאספו, הניחו את המבחנה הקונית על קרח למשך 30 עד 60 דקות, בהתאם לגודל האשכים. בזמן דגירת הרנורים,

preparation-of-meiotic-chromosome-spreads-from-mouse-spermatocytes

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ביציות נוטים aneuploidy בשל טעויות הפרדה כרומוזום במהלך ההבשלה meiotic. ביצים Aneuploid יכול לגרום לבעיות פוריות הפלות או הפרעות התפתחותיות כמו תסמונת דאון. כאן אנו מתארים שיטות להציג חומרים הבחירה לתוך ביציות ושיטות מחקר התבגרות meiotic ולהעריך ploidy.

הביצית Microinjection עכבר, הבשלה ו Ploidy הערכה

מטרת טכניקה זו סקווש צנורית הוא להעריך במהירות תכונות cytological של פיתוח העכבר spermatocytes תוך שמירה על תקינות הסלולר. שיטה זו מאפשרת הלימוד בכל שלבי יצירת זרע, ניתן ליישם בקלות לצד הביוכימי והמולקולרי ביולוגי גישות אחרות לצורך המחקר של העכבר מיוזה.

טכניקה סקווש צנורית וכמה לניתוח Cytological של יצירת זרע שימוש במודל עכבר

Oogenesis ביונקים ידוע להיות מועדת לטעויות, במיוחד עקב כרומוזום missegregation. כתב יד זה מתאר שיטות הכנה כרומטין להפיץ prophase העכבר, מפה של אני, oocytes ביים השני. טכניקות יסוד אלה מאפשרים לימוד חלבוני כרומטין מכורך כרומוזום מורפולוגיה ברחבי oogenesis יונקים.

כרומטין להפיץ את ההכנות לניתוח של העכבר Oocyte התקדמות מן Prophase כדי מפה של השני

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור העשרת החומר העשיר pachytene, עגול spermatocytes, ו להאריך spermatocytes מתוך האשכים עכבר למבוגרים באמצעות סרום מתמשך פרה אלבומין הדרגתי עם מעבדה סטנדרטית ציוד.

העשרה של פכיטנא ספרציטים וספרטידים מאשכים עכבר באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטית

כפולות משטח גרעיני הם כלי הכרחי עבור לימוד אירועי כרומוזום במהלך meiosis. כאן אנו מדגימים שיטה כדי להכין ולדמיין כרומוזומים מיוטיים במהלך prophase הייתי מתוך הדגים הספרציטים.

הכנת כרומוזום מיוסטי כפולות מדגים בזימטציטים

כאן אנו מציגים שיטה פשוטה ויעילה לבודד תאי חיידקים מיוטיים ופוסט-מיוטיים חיים מערכי עכבר בוגרים. באמצעות ציטוקסיות נמוכה, צבע מחייב DNA סגול-נרגש ומיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנה, ניתן לבודד אוכלוסיות תאי זרע מועשרים מאוד עבור יישומים רבים במורד הזרם.

בידוד של תאי זרע מורין באמצעות צבע מחייב DNA סגול-נרגש תא חרוש

מאמר זה מדווח על עיכוב in vivo של CENP-E באמצעות ניתוח בטן והזרקת GSK923295 באשכים, מודל רב ערך לחלוקה מיוטית גברית. באמצעות בדיקות אימונופלואורסצנטיות, ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת, אנו מראים כי עיכוב CENP-E גורם לחוסר תיאום כרומוזומים וחוסר יציבות גנומית בזרעונים של עכברים.

הערכה תפקודית של קינזין-7 CENP-E בזרעונים באמצעות עיכוב Vivo , אימונופלואורסנציה וציטומטריית זרימה

שגיאות מיוטיות בסינפסות ורקומבינציה נפוצות בביציות של יונקים. ניתוח קפדני של חלבונים המעורבים בתהליכים אלה חיוני להבנה כיצד ומדוע ביציות משתבשות לעתים קרובות. הטכניקות המוצגות כאן מאפשרות ניטור מקיף של רקומבינציה וסינפסות כדי להעריך את איכות הביציות בעכברים.

הכנת התפשטות כרומוזומים מיוטיים מביציות עכבר להערכת סינפסה ורקומבינציה

וידאו זה מתאר פשוטים, חוסך זמן טכניקה ניתוק אוטומטי רקמות באמצעות Dissociator gentleMACS להכין תא בודד השעיות של splenocytes העכבר.

הכנת תא בודד השעיות מן הטחול עכבר עם Dissociator gentleMACS

Dissociating תאים סוגי רקמות ספציפיות דורש פרמטרים ספציפיים תסיסה רקמות לקבל כמות גדולה של תאים קיימא culturable. GentleMACS Miltenyi dissociator מייעל את המשימה עם פרוטוקול, פשוט מעשית. בפרסום זה השימוש במנגנון הזה על רקמת הריאות הוא הסביר.

הכנה סטנדרטית של תא בודד השעיות מתוך רקמת הריאה באמצעות עכבר Dissociator gentleMACS

למד הכנת כרומוזומים מיוטיים מתפשטים מתאי זרע של עכבר לחקר מיוזיס זכרי. השיטה מאפשרת תצפית בשלבי פרופאזה 1 ומנגנוני סגירת שברי DNA.

הכנה של כרומוזום Meiotic מתפשטת העכבר Spermatocytes

גלה סרטונים נוספים