Name: ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש במבחנה דגם של מחסום אנושי דם-מוח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: חקור מעבר לימפוציטים דרך מחסום דם-מוח אנושי במודל מבחנה. שיטה זו מאפשרת ניתוח ברמת תא בודד של אוכלוסיות לימפוציטים נדירות ומסייעת בהבנת מחלות דלקתיות במערכת העצבים המרכזית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מרכז המחקר השיתופי CRC TR128 "ייזום/אפקטור לעומת מנגנוני רגולציה בטרשת נפוצה - התקדמות לקראת התמודדות עם המחלה" (פרויקט A9 ל-H.W. ו-C.C.G., פרויקט B1 ל-N.S.).

1. Cell תרבות לתאי אנדותל כלי הדם המוח האנושי (HBMEC) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי של צלוחיות תרבית תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את הפתרון פיברונקטין, להוסיף 10 מ&quot;ל PBS כדי צינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל. הוספת 150 μL פיברונקטין ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכסות את תחתית בקבוק תרבות תא T-25 להוסיף 2 מ&quot;ל של פתרון פיברונקטין. דגירת בקבוק תרבות תאים עבור 3 שעות לפחות ב 37 מעלות צלזיוס בחממה. ניתן לאחסן צלוחיות מצופות פיברונקטין עבור 2 שבועות ב 37 ° C / 5% CO 2. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זריעת תרבית תאים של HBMEC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון פיברונקטין לשאוב מן החלק התחתון של בקבוק תרבית תאים. להוסיף 7.2 x 10 4 HBMEC / cm² מושעה 6 בינוני מ&quot;ל ECM-B (= ECM-B בתוספת 5% בסרום שור העובר, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, ואת תוספת צמיחת תאים 1% אנדותל). לדגור על 37 מעלות צלזיוס / 5% CO 2. בדוק צמיחת תאים יומי באמצעות מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי המדיום כל 3 ימים.קציר או פיצול תאים, כאשר HBMEC להגיע לכ 80% המפגש. HBMEC אמור לשמש בין קטע 1 ו 15 כדי למנוע אובדן של מאפיינים פיסיולוגיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר HBMEC. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן Accutase פתרון על ידי ערבוב Accutase (1x) עם PBS ביחס של 1: 1. שמור Accutase פתרון ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים עד לשימוש נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר בינוני ECM-b מבקבוק תרבות תא צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. לשטוף HBMEC על ידי הוספת 5 מ&quot;ל PBS לתחתית הבקבוק תרבית תאים. לשאוב PBS וחוזר על שלב הכביסה פעמים נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף מ&quot;ל 2 מחומם מראש Accutase פתרון. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. לאחר מכן, HBMEC מחדש תלוי בחוזקה על ידי קשה על בקבוק תרבית תאים מספר פעמים. ניתוק תא נשלט באמצעות מיקרוסקופ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ECM-ב-בינוני נשמרו קודם צינור 15 מ&quot;ל מתווסף בחזרה את הבקבוק תרבית תאים בהקדם HBMEC להתחיל לנתק. יש לשטוף את החלק התחתון של הבקבוק שוב ושוב עד ביותר HBMEC הםמושעה מחדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את ההשעיה לתא צינור צנטריפוגה 15 מ&quot;ל. צנטריפוגה XG 300 10 דקות בטמפרטורת החדר. בטל supernatant מחדש להשעות תאים 1 מ&quot;ל בינוני ECM-B. ספירת תאים לדלל את ההשעיה התא כדי להשיג ריכוז סופי של 3 x 10 5 HBMEC לכל מדיום ECM-b מ&quot;ל. </li></ol></li></ol> 2. הכנת התא מוסיף תרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציפוי של מוסיף תרבית תאים הערה חשובה: אל תיגע הממברנה של מוסיף תרבית תאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL פתרון פיברונקטין (ראה 1.1.1) לכל כנס תרבית תאים (איור 1 א) ו אחד טובה של צלחת 96-היטב שטוחה תחתונה (שליטה אופטית היטב). דגירה של 3 שעות לפחות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר פתרון פיברונקטין הדגירה לשאוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL HBMEC השעיה לבית מוסיף תרבית תאי השליטה האופטית היטב. להוסיף 600 μl בינוני ECM-B לתא התחתון של התאמוסיף תרבות. הדגירה של 3 - 4 ימים 37 ° C / 5% CO 2 עד שלמות מחסום (1B איור) הוא הגיע, לבדוק צמיחת תאים על ידי הערכה מיקרוסקופית של HBMEC בבקרה האופטית היטב. הערה: צמיחת תאים מעבר ארבעה ימים אינה מומלצת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: כדי לחקות את התנאים דלקתיות לשאוב את המדיום מן המגירה התחתונה ולהחליפו בינוני ECM-B בתוספת 500 U / mL IFN-γ / TNF-α 24 שעות לפני assay את ההגירה. </li></ol></li></ol> 3. בקרת איכות עם כחול אוונס ביום של Assay גלגול נשמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת פתרון כחול אוונס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין PBS / B27 פתרון תערובת 10 מ&quot;ל PBS עם 200 μl תוסף B27 באמצעות צינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל. לדלל פתרון מניות כחול אוונס (20 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​PBS) 1: 1000 עם PBS / B27. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> assay חדירות הכחולה אוונס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את המדיום מן המגירה התחתונה ואחריו התא העליוןשל כנס תרבות תא אחד המכיל בשכבת HBMEC ומחוברת. להוסיף 100 פתרון כחול μL אוונס אל הכנס תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 600 μL PBS / B27 לתא התחתון דגירה במשך 60 דקות ב 37 ° C / 5% CO 2. מוציאים בזהירות את הכנס תרבית תאים באמצעות מלקחיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידה כחולה אוונס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PBS / B27 מן המגירה התחתונה ולהעביר 100 μL בכל לשתי בארות של polystyrol שחור 96-גם צלחת תחתית שטוחה. הכנס צלחת בקורא צלחת פרו טקאן Infinite M200 ולקבוע z-מיקום אופטימלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עירור מדוד של הגדרות בהתאמה באמצעות כחול אוונס (למשל: עירור: 620 ננומטר, פליטת: 680 ננומטר, רוחב פס עירור: 9 ננומטר, רוחב פס הפליטה: 20 ננומטר, שיפור 175x, 25 הבזקים, זמן של אינטגרציה: 20 מיקרו-שניות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע פונקציות מחסום HBMEC להשוות רכשה נתונים כדי עקומת סטנדרט המתאר חלחול כחול אוונס ברחבי HBMEC בנקודות זמן שונות לאחר זרעתאי ing (1B איור, מימין). </li></ol></li></ol> 4. Assay הגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תאי הדם ההיקפיים mononuclear (PBMC). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 10 מ&quot;ל RPMI לתוך צינור 15 מ&quot;ל צנטריפוגה ולהוסיף 200 תוספת μL B27. ספירת תאי PBMC צנטריפוגות ב XG 300 5 דק &#39;. Re- להשעות PBMC לריכוז סופי של 5 x 10 6 תאים / מ&quot;ל RPMI / B27. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרה של assay ההגירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב בינוני מהתא הנמוך ואחריו התא העליון של מוסיף תרבית תאים המכילים monolayers HBMEC ומחוברות (איור 1 א). לפי התורם להוסיף 100 ההשעיה μL PBMC כל אל מוסיף תרבית תאים וגם אחד טוב של צלחת 24-היטב לכל (בשליטה במבחנה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 600 μL RPMI / B27 לתא התחתון של מוסיף תרבית תאים 500 μL אל PBMC הבקרה במבחנה דגירה 6 שעות ב 37 ° C / 5% CO 2. </li&gt; </ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר שהועבר PBMC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את כנס תרבית תאים באמצעות מלקחיים ובזהירות לשטוף תחתון עם 400 μL PBS בלי לגעת הממברנה. מחק את כנס תרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 20 μL זרימת ספירת fluorospheres (כ 1000 חרוזים / μL) אל המגירה התחתונה של תרבית תאים להכניס כמו גם לשליטה במבחנה ומערבבים היטב. העברת 1 מ&quot;ל של וכתוצאה ההשעיה PBMC לזרום cytometry צינורות. </li></ol></li></ol> 5. Cytometry זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת דוגמאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה PBMC XG 300 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן פתרון נוגדן ידי הוספת נוגדני מצומדות fluorochrome כדי 100 μL cytometry זרימת החיץ (PBS / 1% BSA / 2 מ&quot;מ EDTA) לדגימה. לקבלת התוצאות המוצגות להלן 1 μL CD4-FITC, 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 μL CD56-PC7, 1 μL CD8-A700, ו 1 μL CD16-A750 שימשו לדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-להשעות PBMC ב 100 μL של פתרון נוגדן דגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 250 μL cytometry זרימה חיץ צנטריפוגות XG 300 5 דק &#39;. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת המדגם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re- להשעות PBMC בכמות הנדרשת (משתנה בהתאם cytometer זרימה בשימוש) של זרימת cytometry חיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת PBMC צבעונית באמצעות cytometer זרימה עם גלאי אקטיבי בין 525 ו 700 ננומטר אורך גל לזהות fluorospheres זרימת הספירה (עירור 488 ננומטר, פליטת 525 - 700 ננומטר). (השלבים הבאים הם דוגמא אם זרימת Gallios cytometer המופעל באמצעות תוכנת Kaluza G משמשת:. (1) הפעל את המחשב (2) כאשר מערכת ההפעלה נטענת במלואו, להתחיל cytometer הזרים על ידי לחיצה על &quot;cytometer על&quot; כפתור . (3) טען את פרוטוקול רכישת בהתאמה ידי לחיצה על כפתור &quot;פרוטוקול פתוח&quot;. (4) בחר את הפרוטוקול נדרש ובחר &quot;לפתוח&quot;. (5) שכפל את הפרוטוקול עבור כל דגימה על ידי לחיצה עם ימיןעכבר כפתור על הפרוטוקול גלוי הקרוסלה הווירטואלית בלחיצה שמאלה על המגרש &quot;כפול&quot;. (6) סמן כל דגימה ברשימה המדגמת. (7) העביר דגימות העמדות המצוינות של הקרוסלה ולהתחיל הרכישה.) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח מדגם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרם פתוח וכתוצאה cytometry נתונים באמצעות התוכנה המתאימה. קביעת מספר תת-האוכלוסיות של ריבית transmigrated PBMC כמו גם תאי מבארות מלאות במבחנה ב וזרימת fluorospheres לספור באמצעות תוכנת ניתוח בהתאמה. (דוגמה לאסטרטגיה gating ניתנת בחלק התוצאות (איור 1 C: כדי לנתח גלגול תת NK תאים, בחר תחילה הלימפוציטים ערוץ פיזור ולצדדים (SSC) מול העלילה ערוץ פיזור קדימה (FSC) לימפוציטים הם. אז מוצג CD3 לעומת העלילה CD56 ו CD56 + CD3 -. תאי NK נבחרים כדי להבחין בין תת-תאי NK, תאי NK מוצגיםעלילה לעומת CD16 CD56 ו CD16 בהיר CD56 לעמעם / - כמו גם CD16 עמום CD56 + תאי NK נבחרים. בנוסף, fluorospheres ספירת זרימה נבחרו מתוך חלקת FSC מול SSC ובהמשך יוצג חלקת ערוץ עם פליטה בין 525 ו 700 ננומטר לעומת הזמן כדי לקבוע את מספרם.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחשב את מספר התאים הכולל של כל דגימה, לנרמל למספר המזוהה של תאים באמצעות fluorospheres ספירת זרימה: <img alt="משוואה" src="/files/ftp_upload/55390/55390eq1.jpg" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת אחוז התאים נדדו כמו יחס בין תאים הכולל יועברו, תאים הכוללים בבקרה חוץ הגופייה. </li></ol></li></ol>

המחבר/ים הצהירו על ניגודי האינטרסים הפוטנציאליים הבאים ביחס למחקר, המחבר ו/או הפרסום של מאמר זה: א.ס.-מ. ול-U.B. אין גילויים פיננסיים. ט.ס.-ה. קיבלה הוצאות נסיעה וכנסים מביוג'ן. N.S קיבלה כבוד של דוברים ומועצה מייעצת מביוג'ן ונוברטיס פארמה, כמו גם הוצאות נסיעה מביוג'ן. ה.ו. קיבל תגמול על שירותו בוועדות מייעצות מדעיות/ועדות היגוי עבור Bayer Healthcare, Biogen, Merck Serono, Novartis ו-Sanofi-Genzyme. הוא גם קיבל כבוד ותמיכה בנסיעות מ-Bayer Vital GmbH, Bayer Schering AG, Biogen, CSL Behring, Fresenius Medical Care, Glaxo Smith Kline, GW Pharmaceuticals, Lundbeck, Merck Serono, Omniamed, Novartis ו-Sanofi-Genzyme. הוא קיבל תגמול כיועץ מביוג'ן, מרק סרונו, נוברטיס וסאנופי-ג'נזים. HW קיבלה תמיכה מחקרית מבאייר ויטל, ביוג'ן, ג'אנזים, מרק סרונו, נוברטיס, סאנופי-אוונטיס גרמניה וסאנופי ארה"ב. C.C.G. קיבלה כבוד דובר והוצאות נסיעה על השתתפות בפגישות מ-Genzyme, Novartis Pharma GmbH ו-Bayer Health Care.

כאן אנו מציגים טכניקה לחקור גלגול לימפוציטים פני מחסום דם-המוח האנושי. בניתוח חוץ גופית של הגירה לימפוציטים אל CNS חשוב ללמוד תהליכים בסיסיים של extravasation הלימפוציטים, שינויים מחלות הקשורות פוטנציאל, גישות טיפוליות חדשות. שינויים אחדים של המודל מחסום הדם-מוח אפשריים. לדוגמא, תאים מהתא העליון יכולים להיות מנותחים לחקור את ההרכב של אוכלוסיית התאים שאינם שהועברה. יתר על כן, הטיפול בשכבה HBMEC עם IFN-γ ו...

הגירה לימפוציטים מהדם אל רקמות היא קריטית עבור מעקב חיסוני. רצף של אינטראקציות מולקולריות ספציפיות מבטיח extravasation באתר מסוים לתוך מעי דק, עור, בלוטות לימפה, מערכת העצבים המרכזית (CNS), ורקמות אחרות 1. שינויים הגירה לימפוציטים מעורבים בפתופיזיולוגיה של מספר מחלות פרושות לרווחה 2. הגירה אל החיסונית-חסוי CNS מוסדר בחוזקה ושינויים בהתאם התהליך הזה מעורבים במחלות הקשורות למערכת העצבים המרכזית כמו encephalomyelitis 3, neuromyelitis אופטיקה, שבץ, טרשת נפוצה (MS) 2, 4, 5, 6, 7. לכן, חשוב ללמוד extravasation הלימפוציטים להבין טוב יותר פתופיזיולוגיה המחלה ולפתח כלים עבור<html> צמחים וטיוב של מחלה 8 ניטל, 9, 10, 11, 12. לימפוציטים להגר לתוך CNS באמצעות מסלולים נפרדים. Extravasation דרך venules postcapillary לחלל תת-עכבישי דרך מחסום נוזל המוח והשדרה-דם בתוך מקלעת דמית ולרוחב את מחסום הדם-מוח תוארו 1, 13, 14, 15. הגירה דרך מחסום הדם-מוח מתבצעת על ידי האינטראקציה של לימפוציטים עם תאי אנדותל 14. בניגוד לתאי אנדותל בפריפריה, תאי אנדותל של CNS לבטא כמויות גבוהות של מולקולות צומת חזק, ובכך בהחלט להגביל את כמות התאים והחלבונים מסוגל לחצות את מחסום הדם-מוחנַעֲרָה = &quot;Xref&quot;&gt; 16. תוצאות דלקת התרופפות של צמתים הדוקים ומשרה את הביטוי של מולקולות הדבקה; ובכך, שיפור הגירה לימפוציטים לתוך CNS 1, 17, 18. Extravasation דרך מחסום הדם-מוח הוא תהליך רב שלבי. לימפוציטים לקשור את תאי האנדותל ואז לגלגל לאורך האנדותל בתהליך בתיווך בעיקר על ידי selectins 1, 15. לאחר מכן, אינטראקציות בין וכמוקינים מופרשים על ידי האנדותל ואת קולטני chemokine בהתאמה הביעו על לימפוציטים לגרום לשינויים קונפורמציה של integrins, ובכך לקדם הדבקת חברת אל תאי אנדותל 1. לבסוף, לימפוציטים או זחילה לאורך המכשול אנדותל נגד זרימת הדם לפני transmigrating לחלל perivascular, או לעכב באופן מיידי וישיר Transmigrate באתר של הדבקת חברת 1, 19, 20. כל הצעדים הללו של extravasation הלימפוציטים ניתן לנתח במבחנה באמצעות טכניקות ברורות 21. זמן לשגות מיקרוסקופ וידאו משמש ללמוד את הקשירה הראשונית מתגלגל 15. מבחני הדבקה לספק מידע מפורט על מעצרו משרד אנדותל מחסומים 22. מבחני גלגול נשמות, כפי שהודגם כאן מאפשרים ניתוח של גלגול חיסוני תאים 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29. שימוש האנושי במודל מחסום דם המוח במבחנה, אנו לאחרונה יכולים להראות כי migr גבוהקיבולת atory של CD16 הבהיר CD56 לעמעם / - תאי NK לעומת CD56 שלהם עמום CD16 + עמיתיהם שהתבטאו דומיננטיות של תת תא זה NK בתא intrathecal 21. לפיכך, הגדרת הניסוי שלנו נראה מתאים לחקות את המצב vivo.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>ללא CaCl2 או MgCl2</td></tr><tr><td>Fibronectin 1 מ"ג/מ"ל</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td><td>מפלזמת בקר</td></tr><tr><td>T-25 בקבוק תרבית תאים</td><td>Greiner BioOne</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>HBMEC</td><td>ScienCell</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pelobiotech</td><td>PB-H-6023</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ECM-b</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>תוסף צמיחת תאי אנדותל</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3472</td><td>שקוף, קוטר 6.5 מ"מ, 3.0 & מיקרו; m גודל נקבוביות</td></tr><tr><td>96 באר צלחת תחתונה שטוחה</td><td>קורנינג</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>אוונס כחול</td><td>סיגמא</td><td>E2129-10G</td><td>פתרון מלאי: 1 גרם/50 מ"ל PBS</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>50x מרוכז</td></tr><tr><td>אינסופי M200Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 בארות צלחת תחתונה שטוחה</td><td>שחורה גריינר BioOne</td><td>675086</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 48 בארות</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>ספירת זרימה פלואורוספירות</td><td>בקמן קולטר</td><td>7547053</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Gallios ציטומטר זרימה 10 צבעים</td><td>בקמן קולטר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5a</td><td>בקמן קולטר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNF ואלפא;</td><td>פפרוטק</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&gamma;</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>300430</td><td>שיבוט UCHT1</td></tr><tr><td>CD56-PC7</td><td>בקמן קולטר</td><td>A21692</td><td>שיבוט N901</td></tr><tr><td>CD16-A750</td><td>בקמן קולטר</td><td>A66330</td><td>שיבוט 3G8</td></tr><tr><td>CD4-FITC</td><td>Biolegend</td><td>300506</td><td>שיבוט RPA-T4</td></tr><tr><td>CD8-A700</td><td>בקמן קולטר</td><td>A66332</td><td>שיבוט B9.11</td></tr></tbody></table>

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

extravasation לימפוציטים לתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS) הוא קריטי עבור מעקב חיסוני. מחלות הקשורות שינויים של extravasation הלימפוציטים עלול לגרום לשינויים פתופיזיולוגיים של מערכת העצבים המרכזית. לפיכך, החקירה של הגירה לימפוציטים לתוך CNS חשוב להבין מחלות דלקתיות של מערכת העצבים המרכזית ועל מנת לפתח גישות טיפול חדשות. כאן אנו מציגים מודל במבחנה של מחסום דם-מוח האדם ללמוד extravasation הלימפוציטים. המוח כלי הדם אנוש תאי אנדותל (HBMEC) גדלים confluently על terephthalate פוליאתילן נקבובי Transwell להכניס לחקות האנדותל של מחסום הדם-מוח. תפקוד המחסום אומת על ידי אימונוהיסטוכימיה occludens zonula, ההתנגדות החשמלית Transendothelial (TEER) מדידות כמו גם ניתוח של חלחול כחול אוונס. מודל זה מאפשר חקירה של diapedesis של תת הלימפוציטים נדירים כגון CD16 בהיר CD56 לעמעם / - תאי NK. Furthermעפרות, את ההשפעות של תאים אחרים, ציטוקינים chemokines, שינויים הקשורים למחלות, ועל משטרי טיפול מובחנים על יכולת הנדידה של לימפוציטים ניתן ללמוד. לבסוף, את ההשפעה של גירויים דלקתיים כמו גם משטרי טיפול שונים על מחסום אנדותל ניתן לנתח.

תוצאות נציג מראה גלגול NK-התא תת T תאים בעזרת מודל מחסום הדם-מוח אנושי (איור 1 א) מוצגים. היושרה של monolayer HBMEC תוקף של הכתמה של המולקולה בצומת דוק ZO-1, התנגדות חשמלית Transendothelial (TEER) מדידות, וכן חלחול הכחול אוונס (איור 1B). בעקבות 3 - 4 ימי התרבות HBMEC הביע מולקולת הצומת ההדוקה ZO-1 (איור 1B, משמאל). יתר על כן, HBMEC גדל ב monolayers מפגין התנגדות חשמלית Transendothelial (באמצע <stro...

כאן, אנו מתארים מודל מחסום דם-מוח אנושי המאפשר לחקור גלגול לימפוציטים למערכת העצבים המרכזית במבחנה.

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

המטרה הכללית של בדיקת נדידה (transmigration assay) זו היא לחקור את תהליך היציאה של לימפוציטים מהכלי הדם (extravasation) אל מערכת העצבים המרכזית in vitro. שיטה זו יכולה לסייע בהעמקת הבנתנו לגבי מחלות דלקתיות של מערכת העצבים המרכזית ובפיתוח גישות טיפוליות חדשות. חלק מהיתרונות של טכניקה זו הם הנגישות הפשוטה שלה והעובדה שהיא מאפשרת ניתוח של אוכלוסיות לימפוציטים נדירות ברמת התא הבודד.שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי נדירה (transmigration) של לימפוציטים דרך מחסום הדם-מוח וניתן ליישמה במחקר של נדירה דרך מחסום הדם-נוזל הצליפולי. בנוסף, ניתן לבצע ניתוח חדירות של Evans blue כדי להעריך את השלמות של מודל מחסום הדם-מוח. התחילו בכיסוי התחתית של בקבוק תרבית תאים T-25 בשני מיליליטר של תמיסת פיברונקטין שהוכנה זה עתה, לדגירה של שלוש שעות לפחות באינקובטור לתרבית תאים בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide.בסיום הדגירה, החליפו את תמיסת הפיברונקטין ב-7.2 × 10⁴ תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של מוח אנושי, או HBMEC, בששה מיליליטר של מצע ECM-b מלא, והחזירו את הבקבוק לאנקובטור. כאשר תאי ה-HBMEC מגיעים ל-80% התמזגות (confluency), העבירו את העילוי לשפופרת קונית של 15 מיליליטר, ושטפו את התאים הדבקים שלוש פעמים עם חמישה מיליליטר של PBS. לאחר השטיפה השלישית, הוסיפו לתאים שני מיליליטר של תמיסת Accutase שחוממה מראש למשך שתי דקות ב-37 °C.לאחר מכן, הקישו בחוזקה על הבקרה מספר פעמים, ואשרו את ניתוק התאים באמצעות מיקרוסקופ אור. כאשר התאים מתחילים להיפרד מהקרקעית של הבקרה, השתמשו בעילוי שנאסף כדי לשטוף את הבקרה שוב ושוב עד שרוב ה-HBMEC יסחופו מחדש. לאחר מכן, העבירו את תגליל התאים לפפיה קונית של 15 מיליליטר לצנטריפוגציה, וסחופו מחדש את המשקע במיליליטר אחד של מצע ECM-b טרי לצורך ספירה.להכנת תאי השתלה (inserts) של תרביות תאים עבור בדיקת נדידה (transmigration assay), יש להוסיף תחילה 100 µL של תמיסת פיברונקטין לכל תאי השתלה ולבאר אחת בלוחית בעלת 96 בארות עם תחתית שטוחה. לאחר שלוש שעות ב-37 °C, יש להחליף את תמיסת הפיברונקטין ב-100 µL של HBMEC, ולהוסיף 600 µL של מצע ECM-b טרי לתאים התחתונים של תאי ההשתלה. לאחר מכן, יש להחזיר את הלוחיות למדגרת תרביות התאים למשך שלושה עד ארבעה ימים.כדי לבחון אם הושגה שלמות המחסום, שאבו את המצע מהמדורים התחתון והעליון של תבנית תרבית תאים אחת, והוסיפו 100 µL של תמיסת Evans blue שהוכנה טרי לתוך התבנית. הוסיפו 600 µL של PBS מועשר ב-B27 למדור התחתון, והחזירו את הפלטה לאינקובטור. לאחר שעה אחת, הסירו בזהירות את התבנית בעזרת פינצטה, והעבירו 100 µL של PBS B27 מהמדור התחתון לשתי בארות נפרדות בפלטת פוליסטירן שחורה בעלת 96 בארות עם תחתית שטוחה.לאחר מכן, הכניסו את הפלטה לקורא מיקרו-פלטות רב-מצב (multi-mode microplate reader), וקבעו את מיקום ה-z האופטימלי. כדי לקבוע את תפקוד מחסום ה-HBMEC, מדדו את העירור של תמיסת צבע ה-Evans blue באמצעות ההגדרות המתאימות, והשוו את הנתונים שהתקבלו לעקומת סטנדרט המתארת חדירות של Evans blue דרך ה-HBMEC בנקודות זמן שונות לאחר הזריעה. לאחר אישור היווצרות השכבה התאית הבודדת (monolayer), השביו את דגימת התאים המונונוקליאריים של דם פריפריאלי, או PBMC, לריכוז של 5×10⁶ תאים למילליטר במצע RPMI מועשר ב-B27.בשלב הבא, שאבו את המצע מהתאים התחתונים והעליונים של מספר מתאים של תבתי תרבית תאים (inserts) המכילים שכבות Einconfluent של HBMEC, והוסיפו 100 µL של PBMC מכל תורם לתבתי תרבית התאים ולבאר אחת בלוח 24 בארות עבור כל ביקורת in vitro. הוסיפו 600 µL של RPMI בתוספת B27 לתאים התחתונים של תבתי תרבית התאים ו-500 µL לבארי ביקורת ה-in vitro, והחזירו את הלוחות לדגירה באינקובטור תרביות תאים למשך שש שעות. בסיום הדגירה, השתמשו בפינצטה להוצאת תבתי תרבית התאים, תוך שטיפה זהירה של התחתית עם 400 µL של PBS ללא מגע בממברנות.לאחר מכן, ערבבו היטב 20 µL של Flow-Count Fluorospheres עם התאים בבקעות הניסוי ובבקעות הביקורת in vitro, והעבירו 1 mL מתלי Suspensions של ה-PBMC שהתקבלו למבחנות ציטומטריה זרימה מתאימות. אספו את התאים באמצעות צנטריפוגה, והוסיפו לכל דגימה את הנוגדנים המצומדים לפלואורוכרום הרלוונטיים ב-100 µL של בופר לציטומטריה זרימה. לאחר 30 דקות בטמפרטורה של 4 °C, שטפו את התאים עם 250 µL של בופר טרי לציטומטריה זרימה, ותלו את המשקעים בנפח המתאים של בופר לציטומטריה זרימה לצורך אנליזה.לאחר שכל הנתונים נאספו, פתח את תוכנת ניתוח הציטומטריית הזרימה המתאימה. כדי לנתח את נדירת תת-האוכלוסייה של תאי NK, בחר תחילה את הלימפוציטים בגרף של פיזור צדי לעומת פיזור קדמי (side versus forward scatter), והצג את התאים בגרף נקודות (dot plot) של CD3 לעומת CD56. לאחר מכן, בחר את תאי ה-NK החיוביים ל-CD56 והשליליים ל-CD3.כדי להבחין בין תתי-האוכלוסיות של תאי NK שעברו נדידה, הצג את התאים בגרף של CD56 מול CD16 ובצע בחירה (gating) לתאי CD56bright, CD16dim או שליליים, ולתאים CD56dim, CD16-positive. לאחר מכן, בחר את ה-Flow-Count Fluorospheres מתוך גרף של פיזור קדמי (forward scatter) מול פיזור צדי (side scatter). כדי לקבוע את מספר החרו지를, הצג את הנתונים הנבחרים בגרף של ערוץ המכסה אורך גל פליטה שבין 525 ל-700 ננומטר מול זמן.לבסוף, קבעו את אחוז תאי ה-NK שנדדו כיחס בין המספר הכולל של התאים שנדדו למספר הכולל של התאים בביקורת ה-in vitro. לאחר שלושה עד ארבעה ימי תרבית, תאי ה-HBMEC ביטאו את מולקולת ה-tight junction מסוג Zonula occludens-1 וגדלו בשכבות חד-שכבתיות (monolayers) המציגות התנגדות חשמלית טרנס-אנדותליאלית וחדירות מופחתת של צבע Evans blue. גרייה של השכבה החד-שכבתית של התאים האנדותליאליים באמצעות interferon gamma ו-TNF alpha למשך 24 שעות לפני בדיקת נדידה (transmigration assay) של PBMC שלמים, מובילה לעלייה בנדידה של כל אוכלוסיות הלימפוציטים שנבחנו.באופן מעניין, תאי NK מסוג CD56bright, CD16dim או שליליים, מפגילים יכולת נדידה גבוהה יותר מאשר תאי NK מסוג CD56dim, CD16-positive, הן על גבי HBMEC לא מעוררים והן על גבי HBMEC שהופעלו על ידי ציטוקינים. עם זאת, העלייה היחסית של התעתור (transmigration) דרך שכבת תאים דלקתית היא גבוהה יותר עבור תאי CD56dim באופן כללי, מה שמדמה תצפיות in vivo לפיהן תאי NK מסוג CD56bright, CD16dim-negative הם מרובים במדורה האינטרתקלית (intrathecal compartment). לאחר השליטה בטכניקה, ניתן להשלים את הפרוטוקול בתוך 10 שעות.טיפול מקדים של מערך הטרנסמיגראציה (transmigration) במעבדה (in vitro) באמצעות interferon gamma ו-TNF alpha מאפשר את חקר נדידת הלימפוציטים בתנאי דלקת. ניתן לשנות את הפרוטוקול שלנו על ידי הפעלת כוחות גזירה או על ידי שיתוף-תרבית עם תאים אחרים של מחסום הדם-מוח, כגון אסטרוציטים, כדי לספק מודל מלוטש יותר לטרנסמיגראציה של לימפוציטים אל תוך מערכת העצבים המרכזית. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן לחקור טרנסמיגראציה של לימפוציטים באמצעות מודל in vitro של מחסום הדם-מוח האנושי.

analysis-lymphocyte-extravasation-using-an-vitro-model-human-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים חקירה ניסויית של גלגול לימפוציטים על פני מודל אנדותל מחסום דם-מוח (BBB). חד-שכבה של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח האנושי (HBMECs) נוצרת במבחנה, ותאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs) המכילים לימפוציטים מתווספים לשכבה החד-שכבתית. לאחר מכן התאים מודגרים כדי לאפשר גלגול לימפוציטים, והתאים הנודדים מכומתים באמצעות ציטומטריית זרימה.

חקר גלגול לימפוציטים על פני חד-שכבת תא אנדותל מיקרו-וסקולרי

הקמת מודלים האנושיים של מחסום דם המוח (BBB) ​​יכולה להועיל למחקר לתנאי מוח הקשורים לכישלון BBB. אנו מתארים כאן טכניקה משופרת להכנת מודל BBB מגע, המאפשר coculturing של האסטרוציטים אנושיים ותאי האנדותל במוח בצדדים המנוגדים של קרום נקבובי.

שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

כאן, אנו מתארים מודל עכברי במבחנה של מחסום הדם-מוח העושה שימוש בספקטרוסקופיה של תאי עכבה, תוך התמקדות בהשלכות על שלמות תאי האנדותל וחדירות באינטראקציה עם תאי T מופעלים.

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם-מוח באמצעות ספקטרוסקופיית עכבה: התמקדות T Cell-אנדותל אינטראקציה תא

. הנה, נדגים את שיטות ויוו כימות של ליקוציט יציאה מן תמימה, מודלק, והעור מאתר ממאיר. אנו לבצע השוואת עפות בשני דגמים: transdermal FITC יישום, בחיי עיר photoconversion. יתר על כן, נדגים את התועלת של photoconversion עבור מעקב אחר ליקוציט היציאה של גידולים עורית.

לכימות ליקוציט היציאה דרך כלי הלימפה מ מאתר עור וגידולים

אנו מציגים שיטת הזריחה כדי להדגים כי לוציפר הצהוב (LY) הוא סמן חזק כדי לקבוע את החדירות הפראוטיות לכאורה של המונטמקים/D3 cell monolayers, מודל בלתי מתורבת של מחסום הדם-מוח האנושי. השתמשנו בקביעה זו כדי לקבוע את הקינטיקה של היווצרות מונאולייר מתורבת בתאי מימן מונולימקים/D3.

לוציפר צהוב-מרקר חזק הקרנף מסמן במודל תא של מכשול הדם האנושי-מוח

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לחקור ליקוי של היחידה נוירו-וסקולריים במהלך ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה ויוו. אנו הכתובת באופן ספציפי כיצד לקבוע את מחסום הדם - מוח חדירות ופעילות gelatinase מעורבים בהעברה ליקוציט לרוחב limitans עכשיו, דונלד.

להמחיש ירידת ערך של המחסומים אנדותל, גליה של היחידה נוירו-וסקולריים במהלך ניסיוני אוטואימוניות דלקת המוח וחוט השדרה In Vivo

בפרוטוקול זה, לימפוציטים ממוקמים בחדר העליון של מערכת הגירה גלגול מופרדים מהתא התחתון על ידי קרום נקבובי. כימוקין מתווסף לחדר התחתון, אשר מעורר הגירה פעילה לאורך הדרגתי כימוקין. לאחר 48 h, לימפוציטים נספרים בשני התאים כדי הגירה טרנסטייט.

הערכה של הגירה לימפוציט במערכת הגירה לשעבר של Vivo

כתב יד זה מציג פרוטוקול כדי לגרום אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית פעילה (EAE) בעכברים. שיטה לבידוד ואפיון של לימפוציטים הסתננו במערכת העצבים המרכזית (CNS) מוצגת גם כדי להראות כיצד לימפוציטים מעורבים בהתפתחות של מחלת החיסון האוטואימונית CNS.

זרימה ניתוח ציטומטרי של חדירה לימפוציטים במערכת העצבים המרכזית במהלך אנצפלומיאלטיס אוטואימונית ניסיונית

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול, שיטת תרבית תאי אנדותל מורחבת (EECM), המאפשרת התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים לתאים דמויי תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח (BMEC). תאים אלה מראים ביטוי של מולקולות היצמדות תאי אנדותל ולכן הם מודל מחסום דם-מוח אנושי המתאים לחקר אינטראקציות תאי מערכת החיסון במבחנה.

התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לתאים דמויי תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח עם פנוטיפ חיסוני בוגר

דוח זה מספק פרוטוקולים להרכבה, תרבית תאים ובדיקות על פלטפורמת μSiM לבניית מודלים של מחסום דם-מוח.

שימוש בפלטפורמת רקמת מחסום MicroSiM (μSiM) למידול מחסום הדם-מוח

פותחה שיטה להמחשת אקסטרוואזציה של צבע עקב פירוק מחסום דם-מוח (BBB) על ידי מתן שני צבעים פלואורסצנטיים לעכברים בנקודות זמן שונות. השימוש בגליצרול כחומר קריאופרוטקטנט הקל על אימונוהיסטוכימיה באותה דגימה.

הערכה של התמוטטות מחסום דם-מוח במודל עכבר של פגיעה מוחית טראומטית קלה

חקור מעבר לימפוציטים דרך מחסום דם-מוח אנושי במודל מבחנה. שיטה זו מאפשרת ניתוח ברמת תא בודד של אוכלוסיות לימפוציטים נדירות ומסייעת בהבנת מחלות דלקתיות במערכת העצבים המרכזית.

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש

גלה סרטונים נוספים