ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש במבחנה דגם של מחסום אנושי דם-מוח

המטרה הכוללת של בדיקת גלגול זו היא לחקור את החדרת הלימפוציטים למערכת העצבים המרכזית במבחנה. שיטה זו יכולה לסייע בקידום ההבנה שלנו לגבי מחלות דלקתיות של מערכת העצבים המרכזית ובפיתוח גישות טיפוליות חדשות. כמה יתרונות של טכניקה זו הם שהיא נגישה בקלות ושהיא מאפשרת ניתוח של אוכלוסיות לימפוציטים נדירות ברמת התא הבודד.

שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי גלגול לימפוציטים על פני מחסום הדם-מוח וניתן ליישם אותה לחקר גלגול דרך מחסום הנוזל הדם-מוחי השדרתי. בנוסף, ניתן לבצע ניתוח חדירה כחולה של אוונס כדי להעריך את שלמות מודל מחסום הדם-מוח. התחל בכיסוי החלק התחתון של בקבוק תרבית תאים T-25 בשני מיליליטר של תמיסת פיברונקטין טרייה שהוכנה לדגירה של שלוש שעות לפחות בחממת תרבית תאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

בתום הדגירה, החלף את תמיסת הפיברונקטין ב-7.2 פעמים 10 לתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח האנושי הרביעי, או HBMEC, בשישה מיליליטר של מדיום ECM-b שלם, והחזיר את הבקבוק לחממה. כאשר ה-HBMEC מגיע למפגש של 80%, העבירו את הסופרנטנט לצינור חרוטי של 15 מיליליטר, ושטפו את התאים הדבקים שלוש פעמים עם חמישה מיליליטר PBS. לאחר הכביסה השלישית, הוסיפו לתאים שני מיליליטר של תמיסת Accutase מחוממת מראש למשך שתי דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.

לאחר מכן הקש בחוזקה על הבקבוק מספר פעמים, ואשר את ניתוק התא על ידי מיקרוסקופ אור. כאשר התאים מתחילים להתרומם מתחתית הבקבוק, השתמשו בסופרנטנט שנקטף כדי לשטוף את הבקבוק שוב ושוב עד שרוב ה-HBMEC מושעה מחדש. לאחר מכן העבירו את תרחיף התא לצינור חרוטי של 15 מיליליטר לצנטריפוגה, והשעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום ECM-b טרי לספירה.

כדי להכין את תוספות תרבית התאים לבדיקת גלגול, הוסף תחילה 100 מיקרוליטר של תמיסת פיברונקטין לכל תוספת ולבאר אחת של צלחת תחתונה שטוחה של 96 בארות. לאחר שלוש שעות ב-37 מעלות צלזיוס, החלף את תמיסת הפיברונקטין ב-100 מיקרוליטר HBMEC, והוסף 600 מיקרוליטר של מדיום ECM-b טרי לתאים התחתונים של תוספות תרבית התאים. לאחר מכן החזירו את הצלחות לחממת תרבית התאים למשך שלושה עד ארבעה ימים.

כדי לבדוק אם הושגה שלמות המחסום, שאפו את המדיום מהתאים התחתונים והעליונים של תוספת תרבית תאים אחת, והוסיפו לתוספת 100 מיקרוליטר של תמיסה כחולה טרייה של אוונס. הוסף לתא התחתון 600 מיקרוליטר PBS בתוספת B27, והחזיר את הצלחת לחממה. לאחר שעה, השתמש במלקחיים כדי להסיר בזהירות את התוספת, ולהעביר 100 מיקרוליטר PBS B27 מהתא התחתון לשתי בארות בודדות של צלחת תחתונה שטוחה שחורה, פוליסטירול, 96 בארות.

לאחר מכן טען את הצלחת לקורא מיקרו-צלחת רב-מצבי, וקבע את מיקום ה-z האופטימלי. כדי לקבוע את פונקציית המחסום של HBMEC, מדוד את העירור של תמיסת הצבע הכחול של אוונס באמצעות ההגדרות המתאימות, והשווה את הנתונים שנרכשו לעקומה סטנדרטית המתארת חדירה כחולה של אוונס על פני HBMEC בנקודות זמן שונות לאחר הזריעה. לאחר אישור היווצרות התא החד-שכבתי, השעו מחדש את התא החד-גרעיני של הדם ההיקפי, או PBMC, לדגימה של חמישה פעמים 10 עד שישית תאים למיליליטר במדיום RPMI בתוספת B27.

לאחר מכן, שאפו את המדיום מהתאים התחתונים והעליונים של המספר המתאים של תוספות תרבית תאים המכילות את החד-שכבות HBMEC המשולבות, והוסיפו 100 מיקרוליטר של PBMC לכל תורם לתוספות תרבית התאים ולבאר אחת של צלחת של 24 בארות לכל בקרת מבחנה. הוסף 600 מיקרוליטר RPMI בתוספת B27 לתאים התחתונים של תוספות תרבית התאים ו-500 מיקרוליטר לבארות הבקרה במבחנה, והחזר את הצלחות לחממת תרבית התאים למשך שש שעות. בתום הדגירה, השתמש במלקחיים כדי להסיר את תוספות תרבית התאים, ושטוף בזהירות את התחתית עם 400 מיקרוליטר PBS מבלי לגעת בממברנות.

לאחר מכן מערבבים היטב 20 מיקרוליטר של פלואורוספירות ספירת זרימה עם התאים בבארות הבקרה הניסיוניות ובמבחנה, ומעבירים מיליליטר אחד של מתלי ה-PBMC המתקבלים לצינורות ציטומטריית הזרימה המתאימים. אסוף את התאים על ידי צנטריפוגה, והוסף את הנוגדנים המצומדים לפלואורוכרום המעניינים ב-100 מיקרוליטר של מאגר ציטומטריית זרימה לכל דגימה. לאחר 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, שטפו את התאים עם 250 מיקרוליטר של מאגר ציטומטריה זרימה טרייה, והשעו מחדש את הכדורים בנפח המתאים של מאגר ציטומטריית זרימה לניתוח.

לאחר שכל הנתונים נרכשו, פתח את תוכנת ניתוח ציטומטריית הזרימה המתאימה. כדי לנתח את תת-הקבוצה של תאי NK, בחר תחילה את הלימפוציטים בתרשים ערוץ פיזור צדדי לעומת קדימה, והצג את התאים בתרשים נקודות CD3 לעומת CD56. לאחר מכן בחר את תאי ה- NK החיוביים ל- CD56 ושליליים ל- CD3.

כדי להבחין בין תת-קבוצות תאי ה-NK המועברות, הצג את התאים בתרשים ושער CD56 לעומת CD16 עבור CD56bright, CD16dim או שלילי, ו-CD56dim, תאים חיוביים ל-CD16. לאחר מכן בחר את הפלואורוספירות של ספירת הזרימה מתרשים פיזור קדימה לעומת צד. כדי לקבוע את מספר החרוז, הצג את הנתונים שנבחרו בתרשים של ערוץ המכסה אורך גל פליטה בין 525 ל-700 ננומטר לעומת זמן.

לבסוף, קבע את אחוז תאי ה-NK שהועברו כיחס בין המספר הכולל של התאים שהועברו למספר הכולל של תאים בבקרת במבחנה. לאחר שלושה עד ארבעה ימים של תרבית, ה-HBMEC ביטא את מולקולת הצומת ההדוק Zonula occludens-1 וגדל בשכבות חד-שכבתיות המציגות התנגדות חשמלית טרנסאנדותל והפחיתו את חדירת הצבע הכחול של אוונס. גירוי של חד-שכבת תאי האנדותל עם אינטרפרון גמא ו-TNF אלפא במשך 24 שעות לפני בדיקת גלגול PBMC שלמה מביא לנדידה מוגברת של כל אוכלוסיות הלימפוציטים שנותחו.

מעניין שתאי CD56bright, CD16dim או NK שלילי מציגים יכולת נדידה גבוהה יותר מאשר CD56dim, CD16 חיובי ל-NK על פני HBMEC לא מגורה ומופעל על ידי ציטוקינים. למרות שהעלייה היחסית בגלגול דרך חד-שכבת תא מודלקת גבוהה יותר עבור תאי CD56dim בסך הכל, מחקה את התצפיות in vivo שתאי NK CD56bright, CD16dim-negative מועשרים בתא התוך-תקלי. שליטה אחת, ניתן להשלים טכניקה זו תוך 10 שעות.

טיפול מקדים במערך הגלגול במבחנה עם אינטרפרון גמא ו-TNF אלפא מאפשר לחקור את נדידת הלימפוציטים בתנאים דלקתיים. ניתן לשנות את הפרוטוקול שלנו על ידי הפעלת כוחות גזירה או על ידי גידול משותף עם תאים אחרים של מחסום הדם-מוח, כמו אסטרוציטים, כדי לספק מודל מזוקק לגלגול לימפוציטים למערכת העצבים המרכזית. אחרי הצפייה בסרטון הזה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לחקור גלגול לימפוציטים באמצעות מודל מבחנה של מחסום הדם-מוח האנושי.