Name: ברונכאלווולאר של ריאות Murine כדי לנתח דלקת תאים דלקתית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: למדו טכניקת שטיפה ברונכואלוולארית בריאות עכברים לבידוד וניתוח תאים חיסוניים וגורמים מסיסים. שיטה פשוטה ויעילה לחקר מנגנוני דלקת וזיהום בדרכי הנשימה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

LVH הוא עוזר מחקר במחלקה לביולוגיה מולקולרית ביו רפואית של אוניברסיטת גנט. ERJ נתמך על ידי UniVacFlu, מענק מספר 607690. KR נתמך על ידי פרויקט EC-FP7 FLUNIVAC.

<ol><li>Stankunas, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+protein+alleles+using+knockin+mice+and+a+chemical+inducer+of+dimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Conditional protein alleles using knockin mice and a chemical inducer of dimerization.</a> Mol Cell. 12 (6), 1615-1624 (2003).</li>
<li>Hunninghake, G. W., Gadek, J. E., Kawanami, O., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+and+immune+processes+in+the+human+lung+in+health+and+disease%3A+evaluation+by+bronchoalveolar+lavage%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Inflammatory and immune processes in the human lung in health and disease: evaluation by bronchoalveolar lavage.</a> Am J Pathol. 97 (1), 149-206 (1979).</li>
<li>Gee, J. B., Fick, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+lavage%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar lavage.</a> Thorax. 35 (1), 1-8 (1980).</li>
<li>Tornling, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid+in+bronchoalveolar+lavage+in+rats+exposed+to+quartz%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ind+Med%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid in bronchoalveolar lavage in rats exposed to quartz.</a> Br J Ind Med. 44 (7), 443-445 (1987).</li>
<li>Henderson, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bronchoalveolar+lavage+to+detect+respiratory+tract+toxicity+of+inhaled+material%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">Use of bronchoalveolar lavage to detect respiratory tract toxicity of inhaled material.</a> Exp Toxicol Pathol. 57, Suppl 1. 155-159 (2005).</li>
<li>Morris, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+analysis+of+the+lung+microbiota+of+cynomolgous+macaques+during+long-term+SHIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Longitudinal analysis of the lung microbiota of cynomolgous macaques during long-term SHIV infection.</a> Microbiome. 4 (1), 38(2016).</li>
<li>Naessens, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GM-CSF+treatment+prevents+respiratory+syncytial+virus-induced+pulmonary+exacerbation+responses+in+postallergic+mice+by+stimulating+alveolar+macrophage+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">GM-CSF treatment prevents respiratory syncytial virus-induced pulmonary exacerbation responses in postallergic mice by stimulating alveolar macrophage maturation.</a> J Allergy Clin Immunol. 137 (3), 700-709 (2016).</li>
<li>Chockalingam, A., Duraiswamy, R., Jagadeesan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+lavage+cellular+analyses+in+conjunction+with+high-resolution+computed+tomography+imaging+as+a+diagnostic+intervention+for+patients+with+suspected+interstitial+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+India%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar lavage cellular analyses in conjunction with high-resolution computed tomography imaging as a diagnostic intervention for patients with suspected interstitial lung disease.</a> Lung India. 33 (3), 287-291 (2016).</li>
<li>Crystal, R. G., Reynolds, H. Y., Kalica, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+lavage.+The+report+of+an+international+conference%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar lavage. The report of an international conference.</a> Chest. 90 (1), 122-131 (1986).</li>
<li>Baughman, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+uncertainties+of+bronchoalveolar+lavage%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">The uncertainties of bronchoalveolar lavage.</a> Eur Respir J. 10 (9), 1940-1942 (1997).</li>
<li>Singletary, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+a+common+BAL+technique+to+enhance+sample+diagnostic+value%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Assoc+Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Modification of a common BAL technique to enhance sample diagnostic value.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 47 (5), 47-51 (2008).</li>
<li>Angus, D. W., Baker, J. A., Mason, R., Martin, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+influence+of+CO2%2C+as+an+agent+for+euthanasia%2C+on+the+pharmacokinetics+of+basic+compounds+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Dispos%22%5BJournal%5D)">The potential influence of CO2, as an agent for euthanasia, on the pharmacokinetics of basic compounds in rodents.</a> Drug Metab Dispos. 36 (2), 375-379 (2008).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li>
<li>Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+the+analysis+of+extracellular+vesicles+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry.</a> J Vis Exp. (97), (2015).</li>
<li>Rubio-Navarro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+Characterization+of+Macrophages+from+Rat+Kidney+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry.</a> J Vis Exp. (116), (2016).</li>
<li>Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+of+immune+cells+within+murine+aortas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas.</a> J Vis Exp. (53), (2011).</li>
<li>Noto, A., Ngauv, P., Trautmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-based+flow+cytometry+assay+to+measure+cytotoxic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity.</a> J Vis Exp. (82), e51105(2013).</li>
<li>Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+basic+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: basic principles and applications.</a> Crit Rev Biotechnol. , 1-14 (2016).</li>
<li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5061/the-elisa-method">The ELISA method.</a> J Vis Exp. , (2016).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19066547">Immunoblot analysis.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
<li>Wunderlich, M. L., Dodge, M. E., Dhawan, R. K., Shek, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+fluorometric+immunoassay+testing+methodology+and+troubleshooting%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multiplexed fluorometric immunoassay testing methodology and troubleshooting.</a> J Vis Exp. (58), (2011).</li>
<li>Song, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+bronchoalveolar+lavage+method+based+on+suction+frequency+number+and+lavage+fraction+number+using+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Res%22%5BJournal%5D)">Standardization of bronchoalveolar lavage method based on suction frequency number and lavage fraction number using rats.</a> Toxicol Res. 26 (3), 203-208 (2010).</li>
<li>Seliger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+high-precision+flow+cytometry+based+technique+for+total+white+blood+cell+counting+in+chickens%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Immunol+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">A rapid high-precision flow cytometry based technique for total white blood cell counting in chickens.</a> Vet Immunol Immunopathol. 145 (1-2), 86-99 (2012).</li>
<li>Daniele, R. P., Elias, J. A., Epstein, P. E., Rossman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+lavage%3A+role+in+the+pathogenesis%2C+diagnosis%2C+and+management+of+interstitial+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar lavage: role in the pathogenesis, diagnosis, and management of interstitial lung disease.</a> Ann Intern Med. 102 (1), 93-108 (1985).</li>
<li>Delayre-Orthez, C., Becker, J., de Blay, F., Frossard, N., Pons, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+endotoxins+during+sensitization+prevents+further+endotoxin-induced+exacerbation+of+airway+inflammation+in+a+mouse+model+of+allergic+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exposure to endotoxins during sensitization prevents further endotoxin-induced exacerbation of airway inflammation in a mouse model of allergic asthma.</a> Int Arch Allergy Immunol. 138 (4), 298-304 (2005).</li>
<li>Delayre-Orthez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPARalpha+downregulates+airway+inflammation+induced+by+lipopolysaccharide+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Res%22%5BJournal%5D)">PPARalpha downregulates airway inflammation induced by lipopolysaccharide in the mouse.</a> Respir Res. 6, 91(2005).</li>
<li>Delayre-Orthez, C., de Blay, F., Frossard, N., Pons, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dose-dependent+effects+of+endotoxins+on+allergen+sensitization+and+challenge+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Allergy%22%5BJournal%5D)">Dose-dependent effects of endotoxins on allergen sensitization and challenge in the mouse.</a> Clin Exp Allergy. 34 (11), 1789-1795 (2004).</li>
<li>Hachet-Haas, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+neutralizing+molecules+to+inhibit+actions+of+the+chemokine+CXCL12%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Small neutralizing molecules to inhibit actions of the chemokine CXCL12.</a> J Biol Chem. 283 (34), 23189-23199 (2008).</li>
<li>Ble, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+lung+S1P%281%29+receptor+reduces+allergen-induced+plasma+leakage+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Activation of the lung S1P(1) receptor reduces allergen-induced plasma leakage in mice.</a> Br J Pharmacol. 158 (5), 1295-1301 (2009).</li>
<li>Ble, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allergen-induced+lung+inflammation+in+actively+sensitized+mice+assessed+with+MR+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Allergen-induced lung inflammation in actively sensitized mice assessed with MR imaging.</a> Radiology. 248 (3), 834-843 (2008).</li>
<li>Reber, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dissociated+glucocorticoid+receptor+modulator+reduces+airway+hyperresponsiveness+and+inflammation+in+a+mouse+model+of+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A dissociated glucocorticoid receptor modulator reduces airway hyperresponsiveness and inflammation in a mouse model of asthma.</a> J Immunol. 188 (7), 3478-3487 (2012).</li>
<li>Drent, M., Cobben, N. A., Henderson, R. F., Wouters, E. F., van Dieijen-Visser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usefulness+of+lactate+dehydrogenase+and+its+isoenzymes+as+indicators+of+lung+damage+or+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Respir+J%22%5BJournal%5D)">Usefulness of lactate dehydrogenase and its isoenzymes as indicators of lung damage or inflammation.</a> Eur Respir J. 9 (8), 1736-1742 (1996).</li>
<li>Henderson, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+bronchoalveolar+lavage+to+detect+lung+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Use of bronchoalveolar lavage to detect lung damage.</a> Environ Health Perspect. 56, 115-129 (1984).</li>
<li>Forget, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adherent+cell+perifusion+technique+to+study+the+overall+and+sequential+response+of+rat+alveolar+macrophages+to+toxic+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">An adherent cell perifusion technique to study the overall and sequential response of rat alveolar macrophages to toxic substances.</a> Environ Health Perspect. 51, 131-140 (1983).</li>
<li>Sung, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+from+welding-fume-exposure-induced+lung+fibrosis+and+pulmonary+function+changes+in+sprague+dawley+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Recovery from welding-fume-exposure-induced lung fibrosis and pulmonary function changes in sprague dawley rats.</a> Toxicol Sci. 82 (2), 608-613 (2004).</li>
<li>Majetschak, M., Sorell, L. T., Patricelli, T., Seitz, D. H., Knoferl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+possible+role+of+proteasomes+in+the+bronchoalveolar+space+of+the+injured+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Res%22%5BJournal%5D)">Detection and possible role of proteasomes in the bronchoalveolar space of the injured lung.</a> Physiol Res. 58 (3), 363-372 (2009).</li>
<li>Rehn, B., Bruch, J., Zou, T., Hobusch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+rat+alveolar+macrophages+by+bronchoalveolar+lavage+under+normal+and+activated+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Recovery of rat alveolar macrophages by bronchoalveolar lavage under normal and activated conditions.</a> Environ Health Perspect. 97, 11-16 (1992).</li>
<li>Kelly, C. A., Ward, C., Stenton, S. C., Hendrick, D. J., Walters, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+pulmonary+macrophage+and+neutrophil+function+in+sequential+bronchoalveolar+lavage+aspirates+in+sarcoidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Assessment of pulmonary macrophage and neutrophil function in sequential bronchoalveolar lavage aspirates in sarcoidosis.</a> Thorax. 43 (10), 787-791 (1988).</li>
<li>Eklund, A., Tornling, G., Blaschke, E., Curstedt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+components+in+bronchoalveolar+lavage+fluid+in+quartz+exposed+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ind+Med%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix components in bronchoalveolar lavage fluid in quartz exposed rats.</a> Br J Ind Med. 48 (11), 776-782 (1991).</li>
<li>Olsen, G. N., Harris, J. O., Castle, J. R., Waldman, R. H., Karmgard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-1-antitrypsin+content+in+the+serum%2C+alveolar+macrophages%2C+and+alveolar+lavage+fluid+of+smoking+and+nonsmoking+normal+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Alpha-1-antitrypsin content in the serum, alveolar macrophages, and alveolar lavage fluid of smoking and nonsmoking normal subjects.</a> J Clin Invest. 55 (2), 427-430 (1975).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

BAL היא טכניקה שימושית להשיג מידע ציטולוגי וביוכימי בתגובה לזיהומים או סמים. בתחילה, BAL שימש כדי לנהל את הייצור ריר מוגזם בחולים בני אדם הסובלים רעילות phosgene 3 . כיום, הטכניקה משמשת בבני אדם לחקור pathogenesis ריאות, אבחון, וניהול טיפולית של מחלות 3 , 24 . בחיות מעבדה, BAL משמש בדרך כלל כדי לעקוב אחר תגובות דלקתיות, מנגנוני החיסון, ותהליכי מחלה זיהומיות המתרחשים בדרכי הנשימה 1 , 2 . כדי לחקור את התאים הסלולר דלקתיים במודלי מחלות נשימה, BAL צריך להיות ואחריו ספירת תאים מוחלטת ודיפרנציאלית. בנוסף למספר התא המוחלט, גם מספרי התאים היחסיים מעניינים. לדוגמה, מודלים של תיקון וסרטן מראים very קטן כדי לא מגביר את מספר הסלולרי BAL. במודל זה, ההערכה של רכב הסלולר שימושית. באמצעות תא מכתים בשילוב עם מיקרוסקופ אור, תאים מסוגים שונים, כגון אאוזינופילים, נויטרופילים, מקרופאגים, לימפוציטים, ניתן לזהות המבוססת על מורפולוגיה 25, 26, 27, 28, 29, 30. Cytometry זרימה ניתן להשתמש לצורך הערכות ספציפיות, כגון לזהות פנוטיפים T-תאים שונים 7, 31. בנוסף לזיהוי אוכלוסיות התאים להסתנן לתוכם השונות, בהרכב בלתי תא הריאה יכול להיחקר באמצעות BAL. שיטות כגון ELISA, immunoblot, מערך חרוז ציטוקינים, אימונוהיסטוכימיה, ואת תגובת שרשרת פולימראז כמותיים מבוצעות על נוזל BAL לקבוע ציטוקינים, צמיחהגורמים, ורכיבים דלקתיים אחרים. כדי לקבוע נזק ריאות, דהידרוגנז חלבון ו לקטט הכולל רמות בנוזל BAL ניתן גם למדוד 32, 33. עם התפתחות כלי אבחון חדשים, אפיון גנומי proteomic של רכיבי BAL יהיה אפשרי בעתיד הקרוב. השילוב של הרחבת יכולות חישוביות וטכנולוגיות ביטוי גני תפוקה גבוהה יאפשר להגדיר פרופילי ביטוי גנים ספציפיים עבור מדינות מחלה שונות. ביצוע טכניקות אלה על נוזל BAL יכול לספק דפוסי גנים וחלבוני ביטוי לזהות המולקולות החשובות המעורבות בשלבים השונים של מחלות ריאה. המגבלה העיקרית של נתונים המתקבלים נוזל BAL היא העדר השוואתי בין ניסויי מחקר השונים 3, 9. יש רמה גבוהה שלהשתנות טכניקת השטיפה והעיבוד הבא של נוזל BAL. כדי להיות מסוגל להשוות כל ניסיון BAL, יש צורך לתקנן את הסוג של נוזל שטיפה כי מוטמע, באתר של החדרה, והחלקיק כי היא שיש לנתח מבחינת רכב הסלולר בלתי תאי. ישנם הבדלים משמעותיים במספר שברי שטיפה בין ניסויים שונים, שנע בין שנת 14 פעמים 34, 35, 36. הבדל זה עשוי להשפיע על המספרים הסלולריים הכוללים המוערכים ב הריאות. חשוב לדעת אילו BAL שבריר נוזל המכיל את רוב התאים. מילות ואחות. הראה כי כ 70% מכלל התאים נאספו ב במקטע אחד כדי שלושה 22. עם זאת, דיווחים אחרים הציעו כי השטיפה השנייה הכילה יותר תאים מאשר הראשון 37, 38 </sup&gt;. אנו יכולים להסיק ממחקרים אלה כי שטיפה עם רק שבריר אחד אינה מייצגת את הריאות כולו, מובילים לפרשנות שגויה של התוצאות. רכב noncellular של נוזל BAL מכיל מידע רב ערך על מצב הבריאות של הריאה 33, 39, 40. וריאציות הדילול של נוזל BAL תורם הבדל הכימות של השבר המסיס, וכתוצאה מכך, הבדלים בתוצאות בין ניסויים. מילות ואחות. לעומת החלבון ואת הרמות לקטט דהידרוגנאז של כל שבריר שטיפה והגיע למסקנה כי שבר השטיפה הראשון הכיל פעמים עד שלוש פעמים יותר מאשר השבריר השני. כדי לאחזר מדגם BAL נציג לצורך הניתוח, כמה שיקולים טכניים הם קריטיים. אחד מהם הוא לבצע הרדמה נאותה. חשוב מאוד לבדוק את נ&quot;צ הרגללקס על העכבר כדי להבטיח סדציה סופנית. זה לא רק חשוב מסיבות אתיות, אלא גם משום שקשה להציב ולשמר את הקטטר במקום הנכון אם העכבר אינו מורדם כראוי. שיקול טכני חשוב שני הוא המיקום של הקטטר בתוך קנה הנשימה. כאשר הקטטר מוחדר עמוק מדי, זה יכול לפגוע במבנה הריאה. בקצה הדיסטלי של הקטטר לא צריך להגיע לריאות במהלך ההליך BAL. קטטר צריך גם להיות מיוצב ומחוזק עם חוט כותנה. אם הקטטר לא התייצב, הפתרון המלוח המוזרק עשוי לזרום כלפי מעלה לתוך חלל האף במקום למטה לתוך הריאות. במהלך הזרקה ושאיפה של תמיסת המלח, חשוב להחזיק את הקטטר יציב. הנתונים המתקבלים מן הנוזל BAL חייבים לייצג את הריאה בעכברים כולו. לכן, חשוב להטמיע נפח נאות של חיץ מלוח (כלומר3 מ&quot;ל, מחולק 3 aliquots של 1 מ&quot;ל כל אחד). אין קשר לינארי בין התשואה התא לבין התשואה נוזל BAL. חשוב לאסוף את הפתרון בעדינות תוך עיסת החזה של העכבר. אם כוחות הגז הם חזקים מדי, הכדאיות, הפונקציה והמבנה של התאים בתוך דרכי הנשימה ונוזל ה- BAL עלולים להיפגע. אם נוזל aspirated אינו גלוי מזרק, בזהירות להזיז את הקטטר עמוק יותר או גבוה יותר קנה הנשימה. הודעה מיוחדת יש לתת היבטים ספציפיים של עיבוד BAL וניתוח. זה יהיה למקסם את המידע נשמר מדגימות BAL. לאחר BAL, התאים נמצאים בינוני מלח מזין עניים. לכן חשוב מאוד לעבד את דגימות תוך 1 שעות לאחר הדגימה BAL. אם יש צורך באחסון ממושך, נדרש שימוש במדיום המשלים חומרים מזינים. כדי לשמור על הכדאיות התא, למנוע צינורות המקדמים התא דבקות על פני השטח. הימנע CENtrifugation של השעיות תא במהירויות העלולות לסכן את שלמות הסלולר או כדי למנוע resuspension אחיד של תאים BAL מאוחזר. נוזל BAL המכיל תאים צריך להיות centrifuged ב 400 xg ו 4 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות. חשוב לזכור כי המתלים התא צריך להיות מוחזק על 4 מעלות צלזיוס במהלך העיבוד.

דרכי הנשימה פוגשות עלבונות רבים, אשר יכולים להוביל לדלקת, פלישת פתוגן או שינוי ממאיר. תאי אפיתל כי קו הריאות לומן טופס אחד המחסומים העיקריים של הגוף היונקים. יחד עם מקרופאגים אלכוהולים, הם מונעים איומים סביבתיים להיכנס למערכת המערכתית דרך דרכי הנשימה. דוגמאות לאיומים כאלה כוללות כימיקלים אורגניים ואי-אורגניים, חיידקים ווירוסים. כמו כן, חיסונים ספציפיים או התערבויות טיפוליות יכול להיות מתוכנן לכוון את הריאות. בכל המקרים האלה, ניתוח מפורט של התגובה מעוררת חשוב להבין, להתערב, או למנוע תהליכים ביולוגיים המתרחשים בתוך מערכת הנשימה. שטיפה ברונכואלוואלית (BAL) היא שיטה שלא יסולא בפז כדי לנתח תגובות כאלה, כמו דגימות וכתוצאה מכך מכילים מידע חשוב על תגובות דלקתיות, מנגנוני החיסון, התקדמות מחלה מדבקתשיכולות להתרחש בדרכי הנשימה ריאתי 1, 2. באמצעות BAL, אפשר ללמוד את תאי הסתננות. זאת בניגוד ריאות מעוכלות, שנותנות אוכלוסיית תא של &quot;מלוכלכת&quot;, עם הרבה תאים מתים ודביקים. BAL מבוצע על ידי החדרת תמיסת מלח לתוך bronchioles מסוף ובהמשך מתאושש הפתרון הזה. הפתרון לאחזר לאחר מכן ניתן להשתמש כדי לכמת phenotypically לנתח ריאות תושב ותאים דלקתיים הסתננות. שיטה זו מיושמת לעיתים קרובות כדי ללמוד נהירה הסלולר דגמים מחלה של דרכי הנשימה, כגון אסטמה, מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), ומודלים מחלה מדבקת. מלבד הרכב הסלולר, את ההרכב המולקולרי של דרכי הנשימה ריאתי משתקפת גם בנוזל BAL. כדי לנתח את זה, enzyme-linked immunosorbent Assay (ELISA), immunoblot, ואת ניתוח סימולטני של ציטוקינים מרובים על ידי מערך חרוז ציטוקינים יכול להיותביצע להעריך את הנוכחות של ציטוקינים chemokines. BAL היא שיטה מבוססת היטב כדי ללמוד את הזרם של תאים דלקתיים במודלים של בעלי חי מחלה דלקתיים. תצפית של נהירה הסלולר שינו (למשל, רמות גבוהות של לימפוציטים, אאוזינופילים, או נויטרופילים) יכול להוביל לתובנות טובות יותר לתוך המחלה יכולה להיות פרמטר אובייקטיבי כדי להעריך את הביצועים של התערבות טיפולית. הפרשנות המדויקת ודיר של ניתוח הסלולר BAL דורשת כי BAL מבוצע כהלכה וכי הנוזל שנאסף מטופל ועובד כראוי. המונח &quot;שטיפת הסימפונות&quot; הוצגה לפני יותר משימון שנה על ידי סטיט 3. בשנת 1961, Myrvik שהושג מקרופאגים המכתשית מן נוזל השטיפה של ריאות ארנב 3. BAL עכשיו שיטה נפוצה לנתח ולעקוב אחר הריאות במודל העכבר, אךעדיין אין דיווח על נוהל BAL מתוקנן בספרות המדעית 4 , 5 . יתר על כן, יש כנראה דרכים רבות לבצע BAL כמו ישנם מעבדות מחקר באמצעות טכניקה 3 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . חשוב כי הנתונים המתקבלים BAL מייצגים את הריאה Murine כולו, ולא רק חלק של הריאה. סוג זה של השתנות מסבך את הפרשנות וההשוואה בין התוצאות בין ניסויים שונים. הנה, הבסיסי, זול, ו לשחזור BAL הליך מתואר המאפשר איסוף של חלק הסלולר מסיס נוכח לומן של דרכי הנשימה של העכבר. בקיצור, קטטר ממוקם לתוך קנה הנשימה חשוף oעכבר הרדמה סופנית. מזרק מחובר catheter, וכן תמיסת מלח שנאגרו המכיל אתילנדיאמינטראקטיק חומצה (EDTA) הוא הציג לתוך הריאות. לומן הריאות הוא דגימה על ידי שטיפה חוזרת ונשנית עדין של תמיסת מלח באמצעות הבוכנה. הלחץ השלילי מיושם במהלך שלב זה הוא מינימלי כדי למנוע התמוטטות דרכי הנשימה. לאחר איסוף, BAL המתקבל צריך להיות מעובד נוספת כדי למנות ולזהות את התאים על ידי cytometry הזרימה.

<table><tbody><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14175-129</td><td></td></tr><tr><td>ethyleendiaminetetra חומצה אצטית (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6511</td><td>מגרה</td></tr><tr><td>23 גרם x 1 1/4 מחט</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710006030</td><td>גודל: 0.60 x 30 מ"מ</td></tr><tr><td>26 גרם x 1/2 מחט</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>4710004512</td><td>גודל: 0.45 x 12 מ"מ</td></tr><tr><td>צינורות פלסטיק</td><td>BD טכנולוגיה רפואית</td><td>427411</td><td>צינורות פוליאתילן, תעודת זהות 0.58 מ"מ (0.023 אינץ') OD 0.965 מ"מ (0.38 אינץ') 30.5 מ' (100 ')</td></tr> <tr><td>נתרן פנטוברביטל</td><td>Kela NV</td><td>514</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>PBS ללא Ca2+ Mg2+ או פנול אדום; מזרקים מסוננים</td></tr><tr><td>סטריליים של 1 מ"ל</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>5010.200V0</td> מלקחיים <td>לא פירוגניים ולא רעילים</td></tr><tr><td></td><td>כלים מדעיים עדינים GmbH&nbsp;</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים</td><td>כלים מדעיים עדינים GmbH&nbsp;</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה 50 מ"ל</td><td>TH. גייר</td><td>7696705</td> נקי מצינור צנטריפוגה <td>Rnase/Dnase/אנדוטוקסין</td></tr><tr><td>15 מ"ל</td><td>TH. גייר</td><td>7696702</td><td>ללא צינור מיקרוצנטריפוגה Rnase/Dnase/endotoxin</td></tr><tr><td>1.5 מ"ל</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>0030 120.094</td><td>פוליפרופילן</td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>תרמו פישר Scientific</td><td>75004030</td><td></td></tr><tr><td>מאגר ליסינג אמוניום-כלוריד-אשלגן (ACK)</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>מסונן סטרילי</td></tr><tr><td>חי/מת - eFluor 506</td><td>eBioScience</td><td>65-0866-18 &nbsp;</td><td>צבע כדאיות ניתן לתיקון</td></tr><tr><td>CD11c-PE-cy7</td><td>eBiosciences</td><td>25-0114-81</td><td></td></tr><tr><td>SiglecF-PE</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>552126&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MHCII-APCefluor780</td><td>Biolegend</td><td>107628&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PE-cy5</td><td>VWR</td><td>55-0031-U100&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD19-PE-cy5</td><td>eBiosciences</td><td>15-0193-83&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-V450</td><td>BD פארמינגן&nbsp;</td><td>560455&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ly6G-AF700</td><td>Biolegend</td><td>127621</td><td></td></tr><tr><td>ספירה מוחלטת חרוזים</td> טכנולוגיות <td>חיים אירופה B.V.&nbsp;</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-CD16/CD32</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142-96</td><td></td></tr><tr><td>בארות 340 ומיקרו; l צלחת אחסון</td><td>פלקון</td><td>353263</td><td>תחתית V,</td></tr><tr><td>ציטומטר זרימת פוליפרופילן</td> טבעי <td>BD צנתר Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD Biosciences</td><td>393202</td><td></td></tr></tbody></table>

ברונכאלווולאר של ריאות murine כדי לנתח דלקת תאים דלקתית

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

שטיפת ברונכואלוואולרית (BAL) היא הליך ניסיוני המשמש לבדיקת תוכן הסלולר acellular של לומן הריאות לשעבר vivo כדי לקבל תובנה לגבי מצב מחלה מתמשך. כאן, שיטה פשוטה ויעילה מתואר לבצע BAL על הריאות בעכברים ללא צורך בכלים מיוחדים או ציוד. נוזל BAL מבודד על ידי הכנסת קטטר בתוך קנה הנשימה של עכברים הרדימו סופנים, שדרכו פתרון מלוח החדיר לתוך bronchioles. הנוזל החדיר הוא חזר בו בעדינות כדי למקסם אחזור נוזל BAL ולמזער כוחות מניעים. טכניקה זו מאפשרת את יכולת הקיום, פונקציה, ומבנה של תאים בתוך דרכי הנשימה ואת נוזל BAL להישמר. טכניקות רבות ניתן להחיל להשיג הבנה נוספת של מדינת המחלה של הריאות. הנה, טכניקה נפוצה לזיהוי הספירה של סוגים שונים של תאי מערכת חיסון היאתיאר, שבו cytometry זרימה משולב עם פאנל נבחר של סמנים על פני השטח fluorescently שכותרתו תאים ספציפיים. ההליך BAL המוצג כאן יכול לשמש גם כדי לנתח סוכני זיהומיות, המרכיבים נוזל, או חלקיקים בשאיפה בתוך ריאות Murine.

לאחר ביצוע BAL עם 3x 1 מ&quot;ל של תמיסת מלח שנאגרו, נפח בין 2 ו 3 מ&quot;ל צריך להיות התאושש. נוזל BAL זה ניתן לנתח נוסף לאפיין את תוכן הסלולר noncellular. כדי לחקור את הנוכחות של ציטוקינים chemokines, 19 ELISA, immunoblot 20, ואת ניתוח סימולטני של ציטוקינים מרובים על ידי מערך חרוז ציטוקינים 21 יכול להתבצע. בנוסף, תוכן אלבומין וחלבון הכולל של נוזל זה יכול להיקבע 22. כדוגמה, כתב היד הזה מתאר כיצד לנתח את התוכן הסלולרי של נוזל BAL ידי cytometry הזרימה. הנוזל נותחו BAL נאסף עכברות Balb / cAnNCrl (גיל: 7 שבועות) 24 שעות לאחר שהם החדירו intratracheally עם lipopolysaccharide. הנוגדנים הבאים, מצמידים את fluorophore, wEre השתמשו כדי לזהות את סוגי תאים שונים: CD11c, SiglecF, MHCII, CD3ε, CD19, Ly6g, ו CD11b (ראה טבלה 1 ואת טבלת החומרים ). לצבוע את הכדאיות fixable שימש גם. באמצעות אסטרטגיה gating מבוסס על הביטוי הדיפרנציאלי של אנטיגנים על המשטחים של אוכלוסיות תאים שונות ( איור 1 ), ניתן היה לזהות מקרופאגים, תאים דנדריטים, תאי B, תאי T, נויטרופילים, ו eosinophils. ראשית, פסולת ו דבלטים היו נשלטים החוצה על בסיס פרמטרים קדימה ו-פיזור בצד. צבע הכדאיות הקל על gating על תאים חיים. לאחר מכן, CD11c תאים גבוהים ותאים נמוכים CD11c זוהו. באוכלוסייה גבוהה CD11c, מקרופאגים ותאים דנדריטים זוהה על בסיס ביטוי MHCII ו SiglecF, בהתאמה. באוכלוסייה נמוכה CD11c, תאי T ותאי B זוהו בהתבסס על ביטוי CD3ε ו- CD19, בהתאמה. בהאוכלוסייה דואר הנותרים התא, נויטרופילים אאוזינופילים זוהו מבוסס על ביטוי סמן CD11b ו Ly-6G, בהתאמה. חרוזי ספירה נוספו לקבוע את מספרי התא המוחלטים של אוכלוסיות תאים השונות על ידי השוואת היחס של אירועים חרוזים לאירועי תא 23. ספירת חרוזי אלה זוהו על סמך צופה שלהם ומאפיינים בצד פיזור (איור 1). טבלה 4 הציג סקירה של המספרים סלולריים המוחלטים של אוכלוסיות תאים השונות בנוזל BAL של עכבר נאיבי עכבר כי היה מגורה עבור 24 שעות עם 5 מיקרוגרם של lipopolysaccharide. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55398/55398fig1.jpg" /> איור 1: אסטרטגית Gating עבור זרימת איתור Cytometric של מקרופאגים, תאים דנדריטים, תאי T, תאי B, נויטרופילים, אאוזינופילים ו iנוזל BAL. תאים BAL היו מבודדים באמצעות פרוטוקול BAL המתואר. תאים היו מבודדים עכברים 24 שעות לאחר החדרת intratracheal של lipopolysaccharide. ספירת חרוזים ותאים זוהו על בסיס תכונות פיזור קדמי וצד. בשער התא, תאים בודדים זוהו באמצעות פיזור קדימה וצד. באוכלוסייה האחרונה זוהו תאים חיים. תאים CD11c גבוהה תאים CD11c נמוך זוהו אז. באוכלוסייה גבוהה CD11c, מקרופאגים ותאים דנדריטים זוהה על בסיס ביטוי MHCII ו SiglecF, בהתאמה. באוכלוסייה נמוכה CD11c, תאי T ותאי B זוהו בהתבסס על ביטוי CD3ε ו- CD19, בהתאמה. באוכלוסיית תאים הנותרים, נויטרופילים ו eosinophils זוהו על בסיס CD11b ו -6G ביטוי לי, בהתאמה. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55398/55398fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לראות א</a>גרסה גדולה יותר של דמות זו. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> אוכלוסיית תאים </td><td> מספר מוחלט של תאים בעכברים נאיביים </td><td> מספר מוחלט של תאים בעכברים LPS מגורה </td></tr><tr><td> מקרופאגים </td><td> 79,612 </td><td> 25,439 </td></tr><tr><td> תאים דנדריטים </td><td> 495 </td><td> 671 </td></tr><tr><td> תאי T </td><td> 45,271 </td><td> 28,089 </td></tr><tr><td> תאי B </td><td> 4,164 </td><td> 2,926 </td></tr><tr><td> נויטרופילים </td><td> 632 </td><td> 566,716 </td></tr><tr><td> Eosinophils </td><td> 3,483 </td><td> 4,332 </td></tr></tbody></table> טבלה 4: Represenתוצאות tative של ניתוח cytometry זרימה על נוזל BAL של נאיביות עכברים LPS-מגורה.

מצב בריאותי של הריאה משתקף על ידי סוג ומספר של תאים חיסוניים הנמצאים bronchioles של הריאה. אנו מתארים טכניקת שטיפה ברונכואלוואלית המאפשרת בידוד ומחקר של תאים לא דליקים וגורמים מסיסים ממערכת הנשימה התחתונה של עכברים.

ברונכאלווולאר של ריאות Murine כדי לנתח דלקת תאים דלקתית

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

המטרה הכללית של הליך זה היא לאסוף את התוכן התאי והבלתי-תאי של חלל הריאה באמצעות שטיפה ברונכואלוולארית (broncoalveolar lavage) לצורך אנליזות ex vivo ולהערכת מצב המחלה השוטף של בעל החיים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום האימונולוגיה הנשימתית בנוגע למנגנונים חיסוניים המושרים על ידי זיהום ודלקת, וזאת באמצעות כימות תגובות חומיות ותאיות מולדות בריאה. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם שהיא פשוטה, יעילה ובעלת הדירות גבוהה, ואינה דורשת ציוד או כלים מיוחדים.לפני תחילת הפרוצדורה, הכינו קטטר על ידי הכנסת מחט gauge 23 לתוך קטע של 0.5 סנטימטר של צינור פוליאתילן שקוף gauge 21, והניחו את בעל החיים במצב שכיבה על הגב (supine). קבעו את גפיו של העכבר וחטאו את הצוואר באמצעות 70% ethanol. לאחר מכן, השתמשו בסכין מנתחים (scalpel) כדי לבצע חתך בעור סמוך לקנה הנשימה.פתחו את העור כדי לחשוף את בלוטות הרוק והשתמשו בפינצטה כדי להפריד את הבלוטות ולחשוף את שריר הלשון (sternal hyoid muscle). השתמשו בפינצטה כדי לחתוך את השריר מסביב לקנה הנשימה. כאשר הוא נראה לעין, השתמשו בפינצטה כדי להשחיל תפר כותנה מתחת לרקמת קנה הנשימה.בשלב הבא, השתמשו במחט במידה 26 כדי לנקב בזהירות את מרכז הקנה בין שתי טבעות סחוס, והחדירו את הקטטר שהוכן מראש למשך כ-0.5 סנטימטרים אל תוך לומן הקנה. ייסבו את הקטטר באמצעות התפר. לאחר מכן, מלאו מזרק של 1 מיליליטר ב-1 מיליליטר של תמיסת מלח מאוזנת סטרילית בתוספת 100 micromolar EDTA.חברו את המזרק הטעון לקטטר והזריקו בעדינות את תמיסת המלח המאוזנת וה-EDTA אל הריאה. כאשר כל הסליין הוזרק, שאבו בעדינות את התמיסה תוך כדי עיסוי של בית החזה. חשוב מאוד לפעול בעדינות בעת ההזרקה והשאיבה של הנוזל כדי למקסם את אחזור נוזל ה-BAL ולמזער כוחות גזירה.אם הנוזל המוצק עובר דרך האף, הדק שוב את התפר לאורך הקטטר. כאשר כל השאיבה נאספה, העבר את הנוזל למבחנה של 15 milliliter על קרח וחזור על השטיפה פעמיים נוספות. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו בתוך שבע דקות אם היא מבוצעת כראוי.לאחר איסוף שטיפת ברונכואלוולרית שלישית, סבבו במערבל (centrifuge) את השאיפה המאוחדת ואחסנו את העל-נתיח בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. השעיקו מחדש את המשקע ב-200 microliters של באפר ליזיס ACK. לאחר זמן של לא יותר משתי דקות בטמפרטורת החדר, דללו את באפר הליזיס עם מיליליטר אחד של PBS קר ואספו את התאים על ידי סבוב במערבל (centrifugation).שחזרו את התליה של המשקע בנפח המתאים של PBS עבור מספר הדגימות המיועדות לניתוח, וחלקו את התאים למספר המתאים של בארות בלוחית 96 בארות לצורך הניתוח. אספו את התאים באמצעות סבב צנטריפוגה נוסף ושחזרו את התליה של המשקעים ב-50 microliters של FC Block ו-PBS. לאחר 10 דקות בטמפרטורת החדר, הוסיפו 50 microliters של תערובת הנוגדנים המתאימה למטרה לכל בארה והדגרירו את התאים למשך 30 דקות ב-4 degrees celsius תוך הגנה מאור.בסיום הדגירה, סובב את הפלטה בצנטריפוגה והסר את הנוזל העליון, תוך השהיה מחדש של המשקעים לנפח סופי של 200 microliters של FAX buffer לכל באר לצורך ניתוח בציטומטריית זרימה. באמצעות אסטרטגיית gating המבוססת על ביטוי דיפרנציאלי של אנטיגנים על פני השטח של אוכלוסיות תאים שונות משטיפה ברונכאוולאולרית, ניתן לזהות סוגים שונים של תאי מערכת החיסון. התאים והסינגלטים (singlets) מסוננים על פי מאפייני הפיזור הקדמי והצידי שלהם.מבצעים בחירה (gating) של תאים שאינם צבועים בצבע חי/מת, ולאחריהם זיהוי של תאי Cd11c High ותאי Cd11c Low. באוכלוסיית ה-Cd11c High, ניתן לזהות מקרופגים ותאים דנדריטיים על סמך ביטוי של MHC-II ו-SinglecF, בהתאמה. באוכלוסיית ה-Cd11c Low, ניתן לזהות תאי T ותאי B על סמך ביטוי של CD3/CD19 ו-MHC-II, בהתאמה.בתאים הנותרים, ניתן לזהותאוזינופילים ונויטרופילים על פי ביטוי הסמנים Cd11b או Ly-6G, בהתאמה. ניתן להוסיף חרוזי ספירה (Counting beads) כדי לקבוע את מספר התאים המוחלט של אוכלוסיות התאים השונות על ידי השוואת היחס בין אירועי חרוזים לאירועי תאים, למשל, בבעלי חיים נאיביים לעומת בעלי חיים שעברו גרייה ב-LPS. לאחר איסוף נוזל ה-BAL, ניתן לבצע טכניקות אחרות כגון ELISA, immunoblot או cytokine bead array כדי להשיב על שאלות נוספות בנוגע לתכנים שאינם תאיים בנוזל ה-BAL.לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום האימונולוגיה לחקור את התוכן התאי והבלתי-תאי של חלל הריאה בעכברים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לבצע BAL באופן יעיל וניתן לשחזור.

bronchoalveolar-lavage-murine-lungs-to-analyze-inflammatory-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

אנו מדגימים לא ניתוחי מסירה של חומרי הבדיקה לריאות של העכברים הרדים דרך קנה הנשימה. שיטה זו מאפשרת חשיפה הריאות לפתוגנים, ציטוקינים חיידקים ווירוסים, נוגדנים, חרוזים, כימיקלים, או צבעים. בנוסף, אנו מתארים קציר ועיבוד של הריאות ניקוז ריאה בלוטות לימפה (LDLNs) עבור cytometry הזרימה.

לא ניתוחי Intratracheal החדרה של עכברים עם ניתוח ריאות וניקוז ריאות בלוטות הלימפה על ידי זרימת cytometry

מקור: Venuprasad, K., et al. מתן תוך-קנה של המופילוס אינפלואנזה במודלים של עכברים לחקר דלקת בדרכי הנשימה. J. Vis. Exp. (2016)סרטון זה מדגים את האיסוף והעיבוד של נוזל שטיפת הסימפונות מעכבר שעבר המתת חסד שנדבק בהמופילוס אינפלואנזה שאינו ניתן לסוג לניתוח במורד הזרם.

איסוף נוזל שטיפת סימפונות מדגם עכבר נגוע בהמופילוס אינפלואנזה שאינו ניתן לסוג

סרטון זה מדגים את השימוש בציטומטריית זרימה כדי לזהות ולספור תאים חיסוניים שונים בנוזל שטיפה ברונכואלבאולרי. בתחילה, מזהים תאים חיסוניים בודדים באמצעות צבע כדאיות, ולאחר מכן צביעה דיפרנציאלית של חלבוני סמן פני השטח, המאפשרת ספירה מדויקת של כל סוג תא.

זיהוי וספירה של תאי מערכת החיסון בנוזל שטיפה סימפוני לפי ציטומטריית זרימה

סרטון זה מדגים טכניקה במבחנה לזיהוי תאים חיסוניים השוכנים בריאות עכברים. לאחר בידוד תאי חיסון מטרה מרקמת הריאה של העכברים, הם מסומנים על פני השטח באמצעות קוקטייל של נוגדנים מתויגים פלואורופור כנגד סמנים ספציפיים על תאי חיסון מולדים ונרכשים. בנוסף, מונוציטים, מקרופאגים ותאים דנדריטיים מסומנים באמצעות סמן תוך-תאי. לאחר מכן מזוהים סוגי התאים החיסוניים השונים באמצעות ציטומטריית זרימה.

שיטת מבחנה לזיהוי תאים חיסוניים מולדים ונרכשים השוכנים בריאות עכברים

התגובה החיסונית המארחת לזיהום הפתוגן היא תהליך מוסדר היטב. ניצול מודל חשיפת ריאות lipopolysaccharide בעכברים, ניתן לבצע הערכות ברזולוציה גבוהה של המנגנונים המורכבים הקשורים להיווצרות מחלה.

הניצול של לוע התחתון Intratracheal PAMP מנהל ושטיפה ברונכואלוואולרית כדי להעריך את תגובת מארח חיסון של עכברים

אנו מתארים שיטה לגרימת דלקת ריאות neutrophilic על ידי אתגר לlipopolysaccharide תרסיס על ידי עִרפּוּל, מודל פציעת ריאות חריפה. בנוסף, טכניקות ניתוחיות בסיסיות לבידוד ריאה, אינטובציה לקנה הנשימה ושטיפה ברונכואלוואולרית הם גם תיארו.

שיטה ליצירת ריאות neutrophilia שימוש התרסיס lipopolysaccharide

בעוד שמחקר במבחנה של אינטראקציות מארח-פתוגן מאפשר אפיון של תגובות חיסוניות ספציפיות, מודלים in vivo נדרשים כדי להתבונן בהשפעות של תגובות מורכבות. באמצעות חשיפה לקנדידה אלביקנס ואחריה זיהום ריאות בתיווך Pseudomonas aeruginosa, הקמנו מודל עכברי של אינטראקציות מיקרוביאליות המעורבות בפתוגניות של דלקת ריאות הקשורה למכונת הנשמה.

לומד קהילות חיידקים<em&gt; In vivo</em&gt;: דגם של אינטראקציה בתיווך בין מארח<em&gt; קנדידה אלביקנס</em&gt; ו<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; באיירווייס

מספר שיטות תוארו בספרות למידול דלקת ריאות חיידקית בעכברים. בזאת, אנו מתארים לא פולשנית, לא יקר, שיטה מהירה גרימת דלקת ריאות באמצעות שאיפה (כלומר, שאיפה) של בידוד חיידקי pipetted לתוך הלוע התחתון. שיטות Downstream להערכה של התגובה החיסונית המולדת ריאתי הם גם מפורטות.

שיטה לא פולשנית הטכנית ללא עתירי עבור אינדוקצית phenotyping של דלקת ריאות חיידקית הניסויית עכברים

במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול יעיל וניתן לשחזור כדי לבודד את האוכלוסיות החיסוניות של מערכת הנשימה murine. אנו מספקים גם שיטה לזיהוי של כל תאי החיסון המולדים והמסתגלים השוכנים בריאות של עכברים בריאים, באמצעות לוח ציטומטריית זרימה מבוסס 9 צבעים.

ניתוח ציטומטרי זרימה לזיהוי תאי החיסון המולדים והמסתגלים של ריאות מורין

כאן, אנו מתארים את מדידת השיעול באמצעות מערכת פלטיסמוגרפיה לא פולשנית ובזמן אמת של כל הגוף (WBP) ואת ההליכים הנורמטיביים לקצירת דגימות רקמה של עכברים ומציגים כמה שיטות להערכת דלקת בדרכי הנשימה.

שיטות לאיתור שיעול ודלקת בדרכי הנשימה בעכברים

למדו טכניקת שטיפה ברונכואלוולארית בריאות עכברים לבידוד וניתוח תאים חיסוניים וגורמים מסיסים. שיטה פשוטה ויעילה לחקר מנגנוני דלקת וזיהום בדרכי הנשימה.

ברונכאלווולאר של ריאות Murine כדי לנתח דלקת תאים דלקתית

גלה סרטונים נוספים