אידוי צמצום מצב התרבות מגביר את השחזור של גיבוש התאי אליפטית צלחות microtiter טובות

המטרה הכוללת של הליך זה היא לשפר את יכולת ההרחבה והשחזור של היווצרות כדורית אחידה באמצעות טכניקת כיסוי נוזלי ב-384 לוחות באר. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בכך שהיא מפחיתה הפעלה חוזרת מוגזמת של מדיום ממספר צלחות, ובכך משפרת את יכולת השחזור של היווצרות כדורים. פיתחנו ואימתנו את השיטה של תרבית ספרואידים תלת מימדיים לבדיקות סינון פרוקי רגליים במעבדה שלנו והמחקר שלנו היה להעריך מהו אפקט הקצה בלוחות של התרביות הרב-תאיות.

היום אדגים את ההליך יחד עם סונה, פוסטר מהמעבדה. התחל הליך זה על ידי שקלול נקודת אפס שבע חמישה גרם של נקודת התכה נמוכה והוסף אותו ל-100 מיליליטר של מדיום 5a של מקוי עם או בלי פנול אדום וללא סרום. מחממים את התמיסה במיקרוגל ומערבבים אותה כל דקה עד שתי דקות כדי להמיס לחלוטין את האגרוז.

ואז חיטוי התמיסה כדי לעקר אותה. לאחר שאפשרתם לאגרוז החיטוי להתקרר לכ-70 מעלות צלזיוס, סנן אותו דרך מסנן עליון של 500 מיליליטר נקודת אפס שניים שני מיקרומטר בקופסת זרימה למינרית. לאחר מכן, אם הפתרון כולו לא ישמש בבת אחת, ציטט אותו.

אחסן את תמיסת האגרוז המוכנה לשימוש באופן אספטי בחדר קירור או במקרר של ארבע מעלות צלזיוס למשך עד ארבעה שבועות. בעבודה בקופסת זרימה, התקן קלטת חלוקה מפלסטיק או מתכת במתקן ריאגנטים משולב. הנח את משקל הצינור לתוך כלי של 70 אחוז אתנול ולאחר מכן הכין את הקסטה.

לאחר מכן, העבירו את משקל הצינור לכלי של PBS והעבירו אותו שוב. לאחר מכן, מחממים במיקרוגל כמות מאוחסנת של תמיסת אגרוז מסוננת כדי להמיס אותה. יש להניח את קלטת החלוקה בתמיסת אגרוז ולאחר מכן להתחיל את הפרוטוקול לציפוי 384 צלחות מיקרו שטופלו בתרבית רקמות באר ב-15 מיקרוליטר של תמיסת אגרוז מסוננת.

הניחו לאגרוז בצלחת להתקרר במשך 15 עד 20 דקות לפני שתזרעו את התאים כמתואר בחלק הבא של הסרטון, או אחסנם בארבע מעלות צלזיוס והרחק מאור ישיר. לבסוף, כדי לנקות את קלטת החלוקה, הנח את משקל הצינור במים סטריליים של 70 עד 80 מעלות צלזיוס ולחץ על כפתור הפריים במתקן. זה יסיר את כל האגרוז שנותר בקצות הקסטה ובצינורות.

יש לבצע את תהליך זריעת התאים הבא בתנאים סטריליים ובתיבת זרימה למינרית. התחל בהסרת המספר הנדרש של 384 מיקרו-לוחות שטופלו בתרבית רקמות מצופה אגרוז מאחסון קר ואפשר להם להתאזן לטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. בינתיים, הכינו את מתקן הריאגנטים המשולבים לראיית תאים על ידי הכנת קלטת חלוקת צינור סטנדרטית עם 70 אחוז אתנול ו-PBS סטרילי.

לאחר מכן, באמצעות לחצני ההגדרה הידניים במתקן, התאם את עוצמת הראייה למיקרוליטר הנדרש ואת מהירות החלוקה לבינונית. השתמש באנזים דיסוציאציה של תאים רקומביננטיים כדי להסיר תאי קרצינומה של המעי הגס האנושי HCT116 מבקבוק תרבית רקמה. בכוס סטרילית, הכינו מלאי תרחיף תאים עם תאים בצפיפות של פי 2.5 10 עד הרביעי תאים למיליליטר לבאר ב -50 מיקרוליטר של מדיום גידול שלם.

אם תזרע יותר מצלחת 384 באר אחת, השתמש במערבל מגנטי כדי למנוע מהם להתיישב בתחתית הכוס. בעזרת מתקן, הוסף את 25 מאות התאים לכל באר של צלחת 384 באר. הניחו לצלחות לנוח 30 דקות בטמפרטורת החדר.

בינתיים, קח מכסה מיקרופלייט סביבתי מפחית אידוי והשתמש בפיפטה של חמישה מיליליטר, הוציא ארבעה מיליליטר של חמישה אחוז דימתילסולפוקסיד לשוקת הצד השמאלי, סוחף לאט למעלה ולמטה. חזור על תהליך זה עם שוקת הצד הימני. ודא שהנוזל שנוסף לשקתות הצדדיות אינו מתמזג במרכז המכסה ומשאיר פער להחלפת גז.

אם מוסיפים יותר מדי נוזלים, הוא יחלחל לחלק החיצוני של המכסה ולאחר מכן ייכנס לבאר החיצונית של צלחת תרבית הרקמה 384. לאחר שחלפו 30 דקות, בחנו את התאים במיקרוסקופ. מנוחה של הצלחות למשך 30 דקות מאפשרת לתאים להתיישב לחלוטין בתחתית הבאר וקרוב זה לזה, מה שחשוב להיווצרות ספרואידים בודדים לבאר.

צנטריפוגה את צלחות הזרעים למשך 15 דקות בארבע פעמים G.לאחר הסיבוב, מלאו את מאגר הנוזלים של צלחת תרבית הרקמה 384 במים סטריליים והחליפו את מכסי הצלחות הרגילים במכסים הסביבתיים המלאים בנוזל. הניחו את הצלחות באינקובטור סיבובי של 37 מעלות צלזיוס עם 95 אחוזי לחות, חמישה אחוזי CO2 ו-20 אחוז חמצן ואפשרו לתאים להצטבר לספרואידים רב-תאיים של גידול או MCTS למשך ארבעה ימים. הימנע מפתיחת דלת החממה זמן רב מדי בימים שלאחר מכן כדי שרמת הלחות לא תרד בפתאומיות.

ביום הרביעי לאחר היווצרות NCTS, השתמש במתקן כביסה אוטומטי של מיקרופלייט כדי להוסיף 30 מיקרוליטר של מדיום מחומם מראש לכל באר. החזירו את ה-MCTS לאינקובטור ואפשרו ל-MCTS לגדול עד שהם מגיעים לגודל הרצוי לניסויים. כל שלושה ימים, כדי להחליף את המדיום, התאם באופן אמפירי את גובה ה-Z של סעפת הכביסה והגדר את מהירות החלוקה ואת המהירות שבה סעפת הכביסה יורדת לבארות בקצב הנמוך ביותר כדי למזער מערבולות בבארות.

שאפו 30 מיקרוליטר בינוני לבאר והחליפו אותו ב-30 מיקרוליטר של מדיום טרי ומחומם מראש. לאחר מכן החזר את התאים לחממה. דמיין את ה-MCTS במערכת הדמיה אוטומטית בעלת תוכן גבוה באמצעות אובייקט אוויר של ארבעה X עם צמצם מספרי של 16.

באמצעות תוכנת ההדמיה, הגדר את זמן החשיפה ל-11 אלפיות השנייה ואת ה-binning ל-4 על 4. התאם את המספר והמרווח של ערימות ה-z ואת שילוב הפיקסלים לפי הצורך כדי שהניסוי יתפוס MCTS שלם בכל באר. עבד את התמונות הדו-ממדיות בשלבים כדי למדוד את שטח ה-MCTS, הציר הראשי והמשני, ההיקף והמוצקות.

אנא עיין בקוד ה-m הנלווה ובקבצי הטקסט קרא לי להוראות ספציפיות. כדי לקבוע את הישימות הפוטנציאלית של השגרה, MCTS בני שבעה ימים טופלו בריכוזים שונים של התרופות האנטי-סרטניות, פקליטקסל, PTX, וינקריסטין, וידאו, אוקסליפלטין, OXA, דוקסירוביצין, DOX, וחמישה פלואורציל, 5-FU, בשלושה ריכוזים שונים במשך ארבעה ימים. תמונות של MCTS מוצגות כאן.

תמונות אלו נותחו כדי לקבוע את האזור, הצירים העיקריים והמינוריים, ההיקף והמוצקות של MCTS שטופלו בתרופות בהשוואה לביקורת, CTLs. הצירים הראשיים והקטנים שימשו לחישוב הנפח הגיאומטרי. הייתה ירידה תלוית ריכוז באזור ובנפח MCTS לאחר טיפול תרופתי.

למרות שנקודה אפס, מיקרוגרם אחד למיליליטר של וינקריסטין ונקודת אפס ארבעה מיקרוגרם למיליליטר דוקסירוביצין וחמישה פלואורואורציל הביאו לעלייה בשטח ה-MCTS, הנפח גדל משמעותית רק לאחר נקודת אפס אפס מיקרוגרם אחד למיליליטר וינקריסטין. היקף MCTS היה שונה באופן משמעותי רק בריכוזים הגבוהים ביותר של פקליטקסל, דוקסירוביצין וחמישה פלורואורציל שהשפיעו לחלוטין על גודל ה-MCTS. טיפול עם פקליטקסל ווינקריסטין בנקודת אפס שניים חמישה מיקרוגרם למיליליטר ונקודת אפס אפס שישה מיקרוגרם למיליליטר ודוקסירוביצין וחמישה פלורורציל ב-100 מיקרוגרם למיליליטר, הביא לירידה משמעותית במוצקות, מה שמצביע על התפוררות מלאה עד חלקית של ה-MCTS.

יחד, נתונים אלה מדגימים את התועלת של שיטה זו בחקירת תרופות אנטי-סרטניות פוטנציאליות. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך שעתיים אם היא מבוצעת כראוי. כאשר מנסים הליך זה, חשוב לציין שלא כל קווי התאים מתאימים לשיטת תרבית תלת מימדית מסוימת וקווי תאים שונים יוצרים ספרואידים המראים הבדלים בצורות הספרואידים, בגודל, בהיסטולוגיה ובקינטיקה של גדילה.

שגרת הגירוי שפיתחנו מאפשרת הערכה יעילה של גודל הספרואיד, במיוחד בספרואיד מפורק חלקית שטופל בתרופות שאין לו גבול מוגדר בבירור למדידת שטח החתך. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב את העובדה שהשינוי הקיים כאן אינו דורש ציוד נוסף או חומרים מתכלים וניתן ליישם אותו באופן שגרתי במעבדת סינון פרוקי הרגליים שלכם.