Name: באמצעות מכשירים microfluidic למדוד פנוטיפים תוחלת החיים סלולר בתאי שמרים ניצני יחיד (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: למד כיצד למדוד תוחלת חיים ופנוטיפים תאיים בתאי שמרים ניצני יחיד באמצעות מכשירים מיקרו-נוזליים. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תאי אם וסמנים מולקולריים בו-זמנית לחקירת תהליכי הזדקנות תאית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי NIH Grant AG043080 והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC), מס' 11434001. אנו מודים ללוקאס וולדבורגר על הגהה של כתב היד.

1. ייצור תבנית סיליקון ופלה הערה: photomask נועד עם תוכנת AutoCAD ומיוצר על ידי חברה מסחרית. עיצוב זה מכיל שלוש שכבות של דפוסים שונים ( <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55412/single_cell_trap.dwg" target="_blank">קובץ משלים 1</a> ). בגבהים של הראשון, השני, השלישי ושכבות עומדים 4 מיקרומטר, 10 מיקרומטר, ו 50 מיקרומטר, בהתאמה. העובש הפרוס סיליקון נוצר מן photomask באמצעות ליתוגרפיה רך 9, 10. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפות פרוסות סיליקון ב 200 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות להתאדות אדי מים. ספין מעיל photoresist שלילית SU-8 על גבי פרוסות סיליקון סיליקון. הערה: מעיל ספין SU-8 3005 ב 5000 סל&quot;ד במשך 30 s כדי ליצור את השכבה הראשונה, SU-8 2010 ב 3000 סל&quot;ד במשך 30 s כדי ליצור את השכבה השנייה, ו SU-8 3025 ב 2000 סל&quot;ד במשך 30 s כדי ליצור את שכבה שלישית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Soft-אופה את הפרוסות המצופות לפני tהוא דפוס העברה. יישר ולחשוף את הפרוסות במצב &quot;קשר ישיר&quot; באמצעות aligner מסכה. הערה: Soft-לאפות את רקיק עבור 2 דקות ב 95 מעלות צלזיוס למשך השכבה הראשונה, 3 דקות ב 95 מעלות צלזיוס למשך השכבה השנייה, ולאחר 15 דקות ב 95 מעלות צלזיוס למשך השכבה השלישית. השתמש במינון החשיפה ב 100 mJ / ס&quot;מ 2 עבור השכבה הראשונה, 130 mJ / ס&quot;מ 2 עבור השכבה השנייה, ו 200 mJ / ס&quot;מ 2 עבור השכבה השלישית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר החשיפה, פוסט-אופים את פרוסות ולפתח אותו באמצעות מפתח SU-8. לייבש את פרוסות באמצעות אקדח N 2 וקשה לאפות את פרוסות סיליקון ב 200 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הערה: תבנית סיליקון מקובעת צלחת 15 סנטימטרי קוטר פטרי מפלסטיק באמצעות נייר דבק, עם צד הדפוס פונה כלפי מעלה. בדרך כלל, אנחנו שמים כמה מבני שבב זהה על אותו שטאנץ, המאפשר שבבי microfluidic מרובה כדי להיות מפוברקים בו זמנית. ניתן להשתמש בהן שוב ושוב כל עובש פעמים רבות לפברק שבבי microfluidic. </li></ol> 2. Microfluidicייצור שבב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח סירה במשקל נקיה על איזון טרה את האיזון. יוצקים 50 גרם של בסיס PDMS לתוך הסירה לשקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 5 גרם של סוכן ריפוי PDMS לסירה שוקל (w / w יחס של 1:10 לבסיס PDMS). הערה: נפח זה מבוסס על צלחת 15 ס&quot;מ קוטר פטרי עם עובש. התאם את הכמות מגיב אם באמצעות צלחת פטרי בגודל שונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את בסיס PDMS ואת הסוכן ריפוי עם טפטפת הפנויה. התחל מקצה הסירה במשקל ולאט לאט להזיז פנימה. מערבבים היטב במשך כמה דקות עד בועות קטנות יוצרים ברחבי תערובת; ערבוב יסודי חיוני פילמור PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את התערובת לאט לתוך צלחת פטרי; את התערובת יש לכסות את התבנית פרוסות סיליקון לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת פטרי בחלל ריק עבור 10 דקות כדי להסיר את כל בועות אוויר מן התערובת PDMS. אם הבועות נשארים על פני השטח של התערובת, להשתמש פיפטה לפוצץ אותן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת סיליקוןעובש פרוס עם PDMS בתנור על 75 מעלות צלזיוס למשך כ 2 h. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקלף בעדינות את השכבה של PDMS פולימר את העובש הפרוס סיליקון, להימנע מכל פגיעת בניית התבנית הפרוסה. לחלופין, לחתוך את PDMS ישירות מהתבנית פרוסות סיליקון עם מרווח של 5 מ&quot;מ מינימום סביב התבנית בעזרת סכין גילוח תעשייתי חד קצה; לקלף את שכבת PDMS בעדינות את התבנית הפרוסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את שכבת PDMS על הספסל עם צד הדפוס פונה כלפי מעלה. לחתוך בזהירות את השבב היחיד עם סכין גילוח תעשייתי חד קצה, שמירת מרווח הולם מהקצה של כל שבב יחיד, כדי למנוע ניזק הבנייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם צד הדפוס פונה כלפי מעלה, השתמש בעט אגרוף (מזהה 0.75 מ&quot;מ) מחורר ישר למטה דרך מעגלי הכניסה ויציאה בכל צד של הערוצים. הערה: אלה חורים ליצור את מסלול הזרימה של המדיום. לכן, חשוב לעבור את עיגולי אגרוף כל הדרך דרך שכבת PDMS. הקפדלהסיר את עמודות PDMS מן החור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק בכל חור מנוקב על ידי החדרת מחט עט אגרוף שוב לתוך החור. ודא את המחט יכולה לצאת מהצד השני, המציין כי אין חסימה. החל קלטת אל פני שטח הדפוס, אז בעדינות לקלף את הקלטת כדי לנקות חלקיקי אבק. חזור על פעולה זו לפחות שלוש פעמים. השאר פיסה נקיה של נייר דבק על PDMS לשמור עיקור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הליך זה בצד השני של PDMS ולהשאיר את החלק האחרון של הסרט על גם כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן כוס כיסוי 24 מ&quot;מ x 30 מ&quot;מ עם עובי של 0.13-0.17 מ&quot;מ. תרסיס אתנול 70% על הזכוכית ויבשה עם מסיר אבק לעקר פני השטח; בנוסף, ניתן לכבס את הכוס במי autoclaved מיובשת עם מסיר אבק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את מכסה זכוכית PDMS לצלחת פלסטיק. הסר את נייר הדבק מן PDMS ומניח את צד הדפוס פונה כלפי מעלה. להימנע מכל מגע עם משטח הדפוס במהלך ההעברה. </li><li&gt; מניח את צלחת הפלסטיק במכונת הפלזמה. החל טיפול פלזמת חמצן PDMS ואת מכסה הזכוכית כדי לעבד את המשטחים הידרופילי עם פרמטרי הפעולה הבאים: חשיפה, 75 s; ייצוב גז, 20 סמ&quot;ק / min; לחץ, 200; וכוח, 100 W. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות למקם את PDMS על מכסה הזכוכית, חיבור שני משטחים הידרופיליים (המשטחים אשר התמודדו במהלך טיפול פלזמה). ודא שאין בועות אוויר בין PDMS ואת מכסה הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת שבב PDMS בתנור על 75 מעלות צלזיוס למשך h 2 לפחות. הערה: מיקרופלואידיקה חסר עלול לגרום לדליפת נוזל על מיקרוסקופ במהלך הניסוי. לכן, חשוב לבדוק את הקשר בין PDMS ואת מכסה זכוכית על ידי הרמת PDMS מעט מן הקצוות עם פינצטה. בהרימו בעדינות את PDMS לא צריך להפריד אותו מכסה הזכוכית, המצביע על קשר מוצלח. </li></ol> 3. הכנות לקראת הניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li&gt; כן Tube. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלול צינורות קלט ופלט בתמיסת 70% אתנול בנפרד 1 יום לפני הכנת שבב PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים מזרק 5 מ&quot;ל עם מים autoclaved לשטוף את הצינורות. לשטוף כל צינור ידי חיבור הצינור על המזרק שטיפה בצינור מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב הכביסה לפחות 3 פעמים כדי לנקות שאריות אתנול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את ערוצי PDMS תחת מיקרוסקופ אופטי עם מטרת 10X לוודא את המבנה עקבי וללא פגע. ייצב את שבב PDMS על פלטפורמת מיקרוסקופ באמצעות נייר דבק. הערה: הפוך שבבים מרובים בבת אחת בשלב 2 על מנת להבטיח כי ישנם שבב גיבוי, במיוחד אם מה שהופך את המכשיר בפעם הראשונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים מזרק 5 מ&quot;ל עם מים autoclaved. Secure את מזרק משאבת מזרק והכנס את צינורות קלט ופלט המקבילים. קבע את מהירות הכביסה כדי 750 μL / h כדי לשטוף את השבב במשך כ 10 דקות. בועות האוויר בערוצי הסניףיש נשטף במהלך תקופה זו; אם יש בועות נותרות, להתאים את המהירות ידנית כדי לחסל את הבועות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת מדגם שמרים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת 1 מ&quot;ל של מדגם שמרים מוכן (OD 600 0.6-0.8) לשני צינורות 1.5-מ&quot;ל microcentrifuge צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 3000 x ז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את רוב supernatant מצינור כל ולשלב את השארית ליצירת מדגם 0.5 מיליליטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השהה את משאבת המזרק ולהסיר את צינורות הזנה משבב PDMS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידנית להפוך את משאבת מזרק כדי למצוץ בועת אוויר קטן (1 עד 2 ס&quot;מ אורך) לתוך צינור אחד קלט. הזז על למצוץ במדגם השמרים; בועת האוויר תציג את גבול המדגם מצביע כמה כבר נמשכה מדגם. הערה: הימנע מוצץ המדגם לתוך המזרק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את צינור ההזנה בחזרה לתוך שבב PDMS ולהפעיל מחדש את המשאבה כדי לטעון את התאים במהירות של 750 μL / h. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את המזרק לשאוב במשך 10 דק &#39;n ולבחון את התקדמות טעינת תא תחת מיקרוסקופ; עם טעינה מוצלחת תהיה תאי מלכודת תחת יותר מ 60% של להשעות עמוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Switch to פתרון תזונה ולהתאים את המהירות ל 400 μL / h עבור culturing תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עמדות תצפית בחר עבור מיקרוסקופ. הערה: עבור מדידות אורך חיים, תמונות צולמו אחת 15 דקות על ידי מיקרוסקופ אופטי עם מטרת 40x. לניתוח כתב הניאון, תמונות צולמו אחת 15 דקות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מטרת שמן 60X. </li></ol>

<ol><li>Mortimer, R. K., Johnston, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+span+of+individual+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Life span of individual yeast cells.</a> Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).</li>
<li>Polymenis, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology%3A+High-tech+yeast+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell biology: High-tech yeast ageing.</a> Nature. 486 (7401), 37-38 (2012).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+phenotyping+of+aging+in+single+yeast+cells+using+a+novel+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device.</a> Aging Cell. 11 (4), 599-606 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+new+generation+of+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device.</a> PLoS One. 7 (11), e48275(2012).</li>
<li>Chen, K. L., Crane, M. M., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+technologies+for+yeast+replicative+lifespan+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Microfluidic technologies for yeast replicative lifespan studies.</a> Mech Ageing Dev. , (2016).</li>
<li>Lee, S. S., Avalos Vizcarra,, Huberts, I., H, D., Lee, L. P., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+lifespan+microscopic+observation+of+budding+yeast+aging+through+a+microfluidic+dissection+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (13), 4916-4920 (2012).</li>
<li>Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+high-resolution+microscopic+observation+of+replicative+aging+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast.</a> J Vis Exp. (78), e50143(2013).</li>
<li>Jo, M. C., Liu, W., Gu, L., Dang, W., Qin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+yeast+replicative+aging+using+a+microfluidic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of yeast replicative aging using a microfluidic system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (30), 9364-9369 (2015).</li>
<li>Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0960-1317/16/2/012/meta">Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).</li>
<li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.annualreviews.org/doi/abs/10.1146/annurev.matsci.28.1.153">Soft lithography.</a> Angewandte Chemie-International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+telomerase+inactivation+accelerates+aging+independently+of+telomere+length%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Early telomerase inactivation accelerates aging independently of telomere length.</a> Cell. 160 (5), 928-939 (2015).</li>
<li>Boy-Marcotte, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heat+shock+response+in+yeast%3A+differential+regulations+and+contributions+of+the+Msn2p%2FMsn4p+and+Hsf1p+regulons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The heat shock response in yeast: differential regulations and contributions of the Msn2p/Msn4p and Hsf1p regulons.</a> Mol Microbiol. 33 (2), 274-283 (1999).</li>
<li>Yang, X., Lau, K. Y., Sevim, V., Tang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+principles+of+the+yeast+G1%2FS+switch%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Design principles of the yeast G1/S switch.</a> PLoS Biol. 11 (10), e1001673(2013).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

מכשיר PDMS צריך להיעשות טרי. אחרת, את בועות האוויר הנגרם על ידי החדרת צינורות לתוך המכשיר תהיינה קשות להסיר. שלב 3.4 חשוב כדי לשפר את יעילות טעינת תא על ידי ריכוז התאים. כדי להגדיל את התפוקה של הניסוי, 4 עד 6 מודולים באותו השבב PDMS מחוברים משאבות הפועלות באופן עצמאי משמשות בדרך כלל כדי לבצע 4 עד 6 ניסויים שונים (זנים שונים או יצירות תקשורת) בו זמנית. בהשוואת assay ההזדקנות הקונבנציונלית שמר בשכפול הדנ&quot;א (המ...

ניצני שמרים הוא אורגניזם מודל עצמת הזדקנות מחקר. עם זאת, assay תוחלת חיים מקובל בשמרים מסתמך על microdissection, וזה לא רק עבודה אינטנסיבית אך גם נמוכה תפוקה 1, 2. בנוסף, הגישה המסורתית microdissection אינה מספקת תצוגה מפורטת של תכונות תאיות ומולקולריות שונות בתאים אם חד ההוריים ככל שהם מזדקנים. הפיתוח של מכשירי microfluidic אפשר הליך אוטומטי למדידת אורך חיי שמרים, כמו גם לעקוב סמנים מולקולריים פנוטיפים הסלולר שונים לאורך חיי תאי אמא 3, 4, 5, 6, 7, 8. אחרי תאי שמרים נטענים לתוך מכשיר microfluidic, הם יכולים להיות במעקב תחת מיקרוסקופ אלקטרוני-הקפות זמן אוטומטיותהדמית דואר. בעזרת הדמית כלים לעיבוד, פנוטיפים תאיים ומולקולריים שונים ניתן לחלץ 3, 6, 8, כולל תוחלת חיים, גודל, כתב ניאון, מורפולוגיה תא, דינמיקת מחזור התא, וכו &#39;, שרבים מהם קשים או בלתי אפשריים להשיג באמצעות שיטת microdissection המסורתית. מכשירים microfluidic שזכו להבלטה מחקר הזדקנות בשמרים מאז הפיתוח המוצלח שלהם 3 לפני כמה שנים, 4, 6, 7. מספר קבוצות מכן פרסמו על וריאציות של העיצובים הקודמים 5, ומעבדות שמרים רבות מועסקות התקני microfluidic המחקר שלהם. בתרבות תא עוברת גידול מעריכי, מספר תאי אמו ישישה זמינים עבור תצפית הוא miniscule. לכן, עיקרון העיצוב הכללי של מכשיר microfluidic למדידות תוחלת חיים הוא לשמר תאי אמא ולהסיר תאים הבת. עיצובים אחד כזה עושה שימוש בעובדה שמרים עובר חלוקת התא אסימטרי. המבנים במלכודת המכשיר תאי אמא גדולים ולאפשר לתאי בת קטנים ייסחפו. שבב microfluidic המתואר במאמר זה משתמש polydimethylsiloxane רך (PDMS) כרית (עמודות pensile אנכיות) לתאי אמא מלכודת (איור 1). התקנים של עיצוב דומה דווחו 3 בעבר, 4, 6, 7. פרוטוקול זה משתמש הליך פשוט לפברק מכשירי microfluidic ו שיטת תא-טעינה פשוטה כי הוא אופטימיזציה עבור ניסויי הדמית הזמן לשגות. אחד הפרמטרים העיקריים במכשיר microfluidic הוא הרוחב של רפידות PDMS המשמשות תאי אמא מלכודת. ד שלנוevice משתמשת רפידות רחבות שיכול לשמור תאי אמא יותר תחת כל כרית, כולל חלק משמעותי של תאי אמא טרייה, שניתן לעקוב אחריהם לאורך כל תוחלת החיים שלהם. בנוסף מדידות אורך חיים, פרוטוקול זה הוא שימושי עבור ניסויי הדמית תא בודד זמן לשגות כאשר התאים צריכים להיות במעקב במשך דורות רבים או כאשר תצפית לאורך טווח החיים היא הכרחית.

<table><tbody><tr><td>3 אינץ' < 111> פרוסת סיליקון</td><td>אדיסון הנדסה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2000 ו-3000 סדרות</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard&reg; 184 ערכת אלסטומר סיליקון</td><td>ellsworth</td><td>2065622</td><td>כולל Sylgard&reg; בסיס אלסטומר סיליקון וחומר ריפוי</td></tr><tr><td>צלחות פטרי</td><td>VWR</td><td>391-1502</td><td></td></tr><tr><td>Harris Uni-core&trade; אגרוף (מזהה 0.75 מ"מ)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td></td><td></td>29002513</tr><tr><td>24 מ"מ x 40 מ"מ SLIP-RITE&reg; כיסוי זכוכית</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>102440</td><td></td></tr><tr><td>3M סקוטש טייפ</td><td>ULINE</td><td>S-10223</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; סכיני גילוח</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>אתנול טהור, Koptec</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Whoosh-Duster ומסחר;</td><td>VWR</td><td>16650-027</td><td></td></tr><tr><td>מזרק BD 5 מ"ל (Luer-Lock&trade; טיפ)</td> <td>בקטון, דיקינסון ושות'</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>צינורות קיר סטנדרטיים PTFE (100 רגל, גודל AWG: 22, מזהה נומינלי: 0.028)</td> <td>חברת אספקת רכיבים</td><td>SWTT-22</td><td></td></tr><tr>חברת <td>אספקת רכיבי</td><td>מבחר מחטים</td><td>NEKIT-1</td><td></td></tr><tr><td>מייבש</td><td>HACH</td><td>2238300</td><td></td></tr><tr><td>תנור מעבדה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13246516GAQ</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ Nikon TE2000 עם אובייקטיביות 40X ו-60X</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axio Observer Z1 עם 40X ו-60X אובייקטיבי</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מזרק משאבת</td><td>Longerpump</td><td>TS-1B</td><td></td></tr></tbody></table>

באמצעות מכשירים microfluidic למדוד פנוטיפים תוחלת החיים סלולר בתאי שמרים ניצני יחיד

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

שמרים ניצנים Saccharomyces cerevisiae הם אורגניזם מודל חשוב בחקר ההזדקנות. מחקרים גנטיים חשפו גנים רבים עם השפעות שמורות על תוחלת החיים בין מינים. עם זאת, הגורמים המולקולריים להזדקנות ומוות נותרו חמקמקים. כדי להשיג הבנה שיטתית של המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הזדקנות השמרים, אנו זקוקים לשיטות בעלות תפוקה גבוהה למדידת תוחלת חיים ולכימות פנוטיפים תאיים ומולקולריים שונים בתאים בודדים. בעבר, פיתחנו מכשירים מיקרופלואידיים למעקב אחר תאי אם שמרים ניצנים לאורך חייהם תוך שטיפת תאי בת שזה עתה נולדו. מאמר זה מציג שיטה להכנת שבבים מיקרופלואידיים ולהקמת ניסויים מיקרופלואידיים. ניתן להשתמש במספר ערוצים כדי לעקוב בו זמנית אחר תאים בתנאים שונים או מזני שמרים שונים. מערך טיפוסי יכול לעקוב אחר מאות תאים בכל ערוץ ולאפשר הדמיית מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה לאורך כל חיי התאים. השיטה שלנו מאפשרת גם אפיון מפורט של תוחלת החיים, סמנים מולקולריים, מורפולוגיה של תאים ודינמיקה של מחזור התא של תאים בודדים. בנוסף, המכשיר המיקרופלואידי שלנו מסוגל ללכוד כמות משמעותית של תאי אם טריים שניתן לזהות על ידי ניתוח תמונה במורד הזרם, מה שמאפשר למדוד את תוחלת החיים בדיוק גבוה יותר.

לאחר הניסויים, תוחלת החיים של תאים ורבי פנוטיפים תאיים ומולקולריים ניתן לחלץ מן הזמן לשגות תמונות המוקלטות. מאחר שיש מספר תכונות שונות כי ניתן לחלץ כל תא, הצעד הראשון של הניתוח הוא לביאור התאים ואירועים, כולל עמדות וגבולות של התאים ואת התזמון של אירועים שונים נמצאים במעקב, כגון כמו האירועים ניצני. הערות אלו יקלו לחזור לאותה קבוצה של תאים ולנתח תכונות שונות בעתיד. באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, כגון ImageJ 11 ואת התוספים הנלווים,...

מאמר זה מציג פרוטוקול מותאם לייצור שבבי microfluidic ואת ההתקנה של ניסויים microfluidic כדי למדוד את אורך החיים פנוטיפים הסלולר של תאי שמרים בודד.

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לייצר התקן מיקרופלואידי ייעודי ולהשתמש בו כדי למדוד את תוחלת החיים והפנוטיפים התאיים של תא שמר בודד. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לכמה מהשאלות המרכזיות בתחום הזדקנות השמרים, כגון מדוע תאי אם מזדקנים ומתים, ומהם האירועים המולקולריים המוקדמים המניעים את אובדן ההומיאוסטזיס התאי ובסופו של דבר את הזדקנות התא ומותו? היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת לעקוב אחר תאי אם, למדוד את תוחלת חייהם ואת הסממנים המולקולריים השונים בו-זמנית, כך שניתן לחפש אירועים מולקולריים המתואמים עם תוחלת החיים.למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הזדקנות שמרים, ניתן להחילה אותה גם על תחומים אחרים, כגון ניטור תגובות משניות להשתתפות הדורשות מעקב אחר תאים לאורך דורות רבים. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה יעבדו עם קשיים, שכן ייצור התקני המיקרופלואידיקה, טעינת התאים והגדרת המיקרוסקופ דורשים תרגול רב כדי להתבצע בהצלחה. הדגמה מוקדמת של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שטעינת התקן המיקרופלואידיקה בשמרים בצורה נכונה היא משימה מאתגרת.כדי להתחיל, ייצרו תבנית פרוסית סיליקון עבור המכשיר באמצעות טכניקות סטנדרטיות כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. הניחו אותה כאשר הצד עם התבליט פונה כלפי מעלה בתוך צלחת פטרית בנפח 15 סנטימטרים. אבטחו את התבנית על צלחת הפטריה באמצעות סרטי הדבקה.לאחר מכן, הניחו כלי שקילה נקי על מאזנה ואפסו אותו. שפכו 50 גרם של בסיס PDMS לתוך כלי השקילה ולאחר מכן הוסיפו חמישה גרם של חומר מעבד PDMS. ערבבו את בסיס ה-PDMS ואת חומר המעבד באמצעות פיפטה חד-פעמית.התחילו מקצה כלי השקילה והתקדמו באיטיות פנימה. ערבבו את התערובת היטב במשך מספר דקות עד להיווצרות בועות קטנות בכל רחבי התערובת. שפכו את התערובת באיטיות אל צלחת הפטרי, כך שתכסה לחלוטין את תבנית פרוסת הסיליקון.לאחר מכן, הכניסו את צלחת הפטרי לוואקום למשך 10 דקות כדי להוציא את כל בועות האוויר מתערובת ה-PDMS. אם נותרו בועות על פני השטח של התערובת לאחר ההוצאה מהוואקום, השתמשו בפיפט כדי לנשוף אותן החוצה. לאחר מכן, אפו את המכשיר בטמפרטורה של 75 °C למשך שעתיים.לאחר הקירור חזרה לטמפרטורת החדר, חתכו בזהירות את ה-PDMS מסביב לתבנית, ולאחר מכן קלפו בעדינות את שכבת ה-PDMS הפולימרי מהתבנית שבסיליקון, תוך הקפדה לא לגרום נזק למבנה התבנית. הניחו את שכבת ה-PDMS על משטח העבודה כאשר הצד עם התבנית פונה כלפי מעלה. גזרו בזהירות כל שבב בנפרד באמצעות להב תער תעשייתי בעל דופן אחת, תוך השארת שוליים מספיקים מקצה כל שבב כדי למנוע נזק למבנה.כאשר צד התבנית פונה כלפי מעלה, השתמשו בעט ניקור כדי לנקור חורים ישרים למטה דרך עיגולי הכניסה והיציאה בכל צד של התעלות. בדקו כל חור על ידי הכנסה חוזרת של מחט עט הניקור לתוך החור. וודאו שהמחט יכולה לצאת מהצד השני, מה שמעיד על כך שאין חסימות.לאחר מכן, השתמשו בסרט הדבקה כדי לנקות חלקיקי אבק ושיירי לכלוך מהמשטח העליון. חזרו על שלב זה לפחות שלוש פעמים, והשאירו חתיכה נקייה של סרט דבק Scotch על ה-PDMS כדי לשמור על משטח נקי מאבק. לאחר מכן, הפכו את המכשיר וחזרו על הליך זה בצד הנגדי של ה-PDMS.השאירו את פיסת הסרט האחרונה גם בצד זה. כעת הכינו משטח זכוכית עבור בסיס המכשיר. בחרו את פיסת זכוכית הכיסוי בגודל 24 מילימטר על 30 מילימטר, בעובי שבין 13 ל-17 מילימטרים.רססו את הזכוכית ב-70% ethanol, ויבשו אותה בעזרת מסיר אבק כדי לעקר את הפני השטח. לאחר מכן, העבירו את זכוכית הכיסוי ואת ה-PDMS לצלחת פלסטיק. הסירו את סרט ההדבקה (Scotch tape) מה-PDMS, והניחו אותו בצלחת כאשר הצד עם התבנית פונה כלפי מעלה, ללא מגע עם הפני השטח העליון.לאחר מכן, העבירו את הפלטה לתא פלסמה. בצעו טיפול בפלסמת חמצן ב-PDMS ובזכוכית כיסוי כדי להפוך את השטחים להידרופיליים. לאחר מכן, הוציאו את הפלטה מתא הפלסמה וחברו בזהירות את השטחים של ה-PDMS והזכוכית כיסוי שעברו טיפול בפלסמה.וודאו שאין בועות אוויר בין ה-PDMS לזכוכית הכיסוי. לבסוף, העבירו את ההתקן לתנור ואפו בטמפרטורה של 75 °C למשך שעתיים לפחות. השקיעו את צינורות הכניסה והיציאה בתמיסת אתנול 70% יום אחד לפני הכנת שבב ה-PDMS.ביום למחרת, מלאו מזרק של 5 mL במים שעברו אוטוקלב, ושטפו כל מבחנה על ידי הצבת המבחנה על המזרק ושטיפתה במים. חזרו על שלב השטיפה לפחות שלוש פעמים כדי להסיר שאריות אתנול. לאחר מכן, בחנו את תעלולי ה-PDMS תחת מיקרוסקופ אופטי.בעזרת עדשה של 10X ודאו שהמבנים עקביים ושלמים. קבעו את שבב ה-PDMS השלם על פלטפורמת המיקרוסקופ באמצעות סרט דביק. חברו מזרק של חמישה מיליליטר הממולא במים סטריליים למשאבת מזרקים, והחדירו את צינורות הכניסה והיציאה המתאימים אל המכשיר.הגדירו את קצב הזרימה ל-750 microliters per hour ושטפו את השבב למשך כ-10 דקות. עקבו אחר התעלים כדי לוודא שכל בועות האוויר נשטפות החוצה. אם נותרו בועות לאחר שטיפה של 10 דקות, כוון באופן ידני את המהירות כדי להסיר את הבועות.העבירו מיליליטר אחד של דגימת שמרים מוכנה לשתי מבחנות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר, וסובבו את הדגימות בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-3,000 ×g. הסירו את רוב הנוזל העליון (supernatant) מכל מבחנה ואחדו את השארית כדי ליצור דגימה של 5 מיליליטר. כעת, כאשר דגימת השמרים מוכנה, הסירו את מבחנות ההזנה משבב ה-PDMS. הפעילו ידנית את משאבת המזרק במצב הפוך כדי לשאוב בועת אוויר קטנה באורך של סנטימטר אחד עד שניים לתוך כל מבחנת הזנה, ולאחר מכן שאבו את תרביות התאים.לאחר מכן, הכניסו חזרה את צינור הכניסה לשבב ה-PDMS והפעילו מחדש את המשאבה כדי להטעין את התאים במהירות של 750 µL לשעה. השאירו את משאבת המזרק פועלת למשך 10 דקות, ולאחר מכן בחנו תחת המיקרוסקופ את התקדמות טעינת התאים. טעינה מוצלחת תגרום ללכידת תאים תחת יותר מ-60% מהעמודים התלויים.כדי לתחזק את תאי השמרים, החליפו את התמיסה במזרק לתמיסת תזונה, והתאימו את המהירות ל-400 microliters לשעה. ניתן לקבל את הפנוטיפ של אורך החיים של השמרים על ידי ספירת מספר הניצנים שנוצרו בכל תא אם לכוד, והערכת מדד Kaplan-Meier. בשימוש בפרוטוקול זה, המכשיר לוכד לעיתים קרובות תאי בתה טריים שניצנו מהתאים שכבר נלכדו.תאים אלו הופכים לאחר מכן לתאי אם טריים, אותם ניתן לזהות באמצעות תוכנה לניתוח תמונות בשלב מאוחר יותר. תאי אם טריים אלו מספקים מדידה מדויקת יותר של תוחלת החיים. בניסוי זה, תוחלת החיים הממוצעת של תאי האם הטריים הייתה ארוכה יותר במעט, בכשני דורות.בנוסף למספר הנבטים, ניתן להוציא מנתוני הדימוג את פרק הזמן שבין שני אירועי נביטה רצופים. הנביטה מואטת באופן דרמטי לקראת סוף תוחלת חייהם, מה שמעיד על מצבם הבלתי בריא של תאים מבוגרים אלו. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בשבב שהוכנה טريה כדי לסייע במניעת בועות, ולהגדיל את ריכוז התאים במידת הצורך כדי לשפר את יעילות טעינת התאים.לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הזקנה בשמרים לחקור את השינויים המולקולריים המוקדמים הגורמים לפנוטיפ ההזדקנות. לאחר צפייה בסרטון זה, תשיגו הבנה טובה לגבי אופן ההכנה של התקן המיקרופלואידי הזה וכיצד להשתמש בו למדידת תוחלת חיים ופנוטיפים תאיים בתאים בודדים.

using-microfluidic-devices-to-measure-lifespan-cellular-phenotypes

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הזדקנות בשמרים כרונולוגית מתייחס לאובדן של כדאיות התא הקשורים זמן בשלב נייח. כאן אנו מתארים את שיטת תפוקה גבוהה עבור כמותית בקביעת תוחלת החיים בשמרים כרונולוגי.

כימות כרונולוגי שמרים תוחלת החיים על ידי תולדה של תאים בני

במאמר זה אנו מציגים את פרוטוקול כללי למדידת חיים replicative טווח של תאים אמא שמרים.

מדידת תוחלת החיים בשמרים replicative הנצה

כאן אנו מתארים קבוצה של מוטציה מבחני DNA כי ניתן בשילוב עם המודל הכרונולוגי שמרים תוחלת החיים כדי לחקור את הגנים / מסלולים המווסתים או לתרום יציבות הדנ"א הגנומי במהלך ההזדקנות.

לימוד גיל תלויי חוסר יציבות הגנום באמצעות ס cerevisiae דגם כרונולוגי תוחלת חיים

אנו מציגים שיטה פשוטה לייצר מכשירים המסוגלים החלת תנאים דינמיים דומים לזנים שונים מרובים microfluidic, ללא צורך בחדר נקי או ליתוגרפיה הרכה.

מכשיר microfluidic ללימוד זני Distinct מרובים

אנו מתארים כאן את הפעולה של מכשיר microfluidic המאפשר הדמיה מיקרוסקופית רציפה ורזולוציה גבוהה של תאי שמרי ניצנים בודדים במהלך replicative המלא ו / או תוחלת החיים כרונולוגית.

תצפית מיקרוסקופית ברזולוציה גבוהה מתמשכת של replicative הזדקנות בשמרי הנצה

אנו מציגים פרוטוקול פשוט להשיג סרטי הקרינה מיקרוסקופיה של תאי שמרים גדלו, וחבילת תוכנה מבוססת GUI כדי לחלץ את נתוני זמן סדרת תא בודד. הניתוח כולל שושלת אוטומטית והקצאת זמן החלוקה משולבת עם בדיקה חזותית ואוצרות ידני של נתונים מסומנים.

רכישת זמן לשגות סרטים הקרינה של שמרים להנץ וניתוח Dynamics תא בודד באמצעות שתלי

בפרוטוקול זה מוצג הייצור, ההתקנה והתפעול הבסיסי של ביו-ריאקטור פיקוליטר מיקרופלואידי (PLBR) לניתוח תאים בודדים של מיקרואורגניזמים פרוקריוטיים. מיקרואורגניזמים רלוונטיים מבחינה תעשייתית נותחו כהוכחה עקרונית המאפשרת תובנות לגבי קצב גדילה, מורפולוגיה והטרוגניות פנוטיפית על פני תקופות זמן מסוימות, בקושי אפשרי בשיטות קונבנציונליות.

ביו-ריאקטור מיקרו-נוזלי פיקוליטר לניתוח מיקרוביאלי של תאים בודדים: ייצור, הגדרת מערכת ותפעול

אנו מציגים שיטה לכימות פנוטיפים הצמיחה של תאים שמרים בודדים כפי שהם גדלים לתוך מושבות על מדיה מוצקה באמצעות זמן לשגות מיקרוסקופ בשם, אחת הכפלה הערכה של מערכים חיים של שמרים (ODELAY). הטרוגניות האוכלוסייה של תאים זהים גנטית גדל לתוך מושבות ניתן לצפות ישירות לכמת.

ODLAY: שיטה בקנה מידה גדול עבור כימות רב פרמטר של גידול שמרים

אנו מציגים שיטה לניתוח microfluidic של שושלות בודדים תא החיידק Bacillus subtilis כדוגמא. השיטה מתגבר על החסרונות של שיטות אנליטיות מסורתי במיקרוביולוגיה בכך שהוא מאפשר התבוננות של מאות דורות תא תחת תנאי הגידול בחוזקה לשליטה ואחידה.

ניתוח Microfluidic תא בודד של Bacillus subtilis

הנה פרוטוקול לזיהוי אינטראקציות גנטיות באמצעות מסך מדכא מספר עותק מוגבר ב Saccharomyces cerevisiae. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לזהות, לשבט ולבדוק מדכאי מוטנטים שמרים קצרי מועד. אנו בודקים את ההשפעה של הגדלת מספר עותק של SIR2 על תוחלת החיים במוטציה null autophagy.

מסך מדכא לאפיון קישורים גנטיים ויסות תוחלת חיים כרונולוגית ב Saccharomyces cerevisiae

למד כיצד למדוד תוחלת חיים ופנוטיפים תאיים בתאי שמרים ניצני יחיד באמצעות מכשירים מיקרו-נוזליים. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר תאי אם וסמנים מולקולריים בו-זמנית לחקירת תהליכי הזדקנות תאית.

באמצעות מכשירים microfluidic למדוד פנוטיפים תוחלת החיים סלולר בתאי שמרים ניצני יחיד

גלה סרטונים נוספים