30 במרץ 2017
מאמר זה מציג פרוטוקול מותאם לייצור שבבי microfluidic ואת ההתקנה של ניסויים microfluidic כדי למדוד את אורך החיים פנוטיפים הסלולר של תאי שמרים בודד.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא ליצור מכשיר מיקרופלואידיקה מיוחד ולהשתמש בו כדי למדוד את תוחלת החיים והפנוטיפים התאיים של תא שמרים בודד. שיטה זו יכולה לעזור לענות על כמה משאלות המפתח בתחום הזדקנות השמרים, כגון מדוע תאי אם מזדקנים ומתים ומהם האירועים המולקולריים המוקדמים יותר המניעים את אובדן ההומאוסטזיס התאי ובסופו של דבר הזדקנות התאים ומוותם? היתרון העיקרי של השיטה הזו הוא שאנו יכולים לעקוב אחר תאי אם, לעקוב אחר תוחלת החיים שלהם והסמנים המולקולריים השונים בו זמנית, כך שנוכל לחפש אירועים מולקולריים שקשורים לתוחלת החיים.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הזדקנות שמרים, ניתן ליישם אותה גם בתחומים אחרים, כגון ניטור תגובות משניות להשתתפות הדורשת בדיקת תאים במשך דורות רבים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שייצור מכשירים מיקרופלואידיים, העמסת תאים, הגדרת מיקרוסקופ דורשים תרגול רב כדי לבצע בהצלחה. הדגמה מוקדמת של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה להעמיס כראוי את המכשיר המיקרופלואידי בשמרים.
כדי להתחיל לייצר תבנית פרוסות סיליקון למכשיר בטכניקות סטנדרטיות כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. מניחים אותו עם הצד כלפי מעלה לתוך צלחת פטרי בגודל 15 סנטימטר. אבטח את התבנית על צלחת הפטרי בעזרת קלטות.
לאחר מכן הניחו סירת שקילה נקייה על משקל וקרעו את האיזון. יוצקים 50 גרם של בסיס PDMS לתוך סירת השקילה ולאחר מכן מוסיפים חמישה גרם של חומר ריפוי PDMS. מערבבים את בסיס ה-PDMS וחומר הריפוי בעזרת פיפטה חד פעמית.
התחל מקצה סירת השקילה ונע לאט פנימה. ערבבו היטב את התערובת במשך מספר דקות, עד שנוצרות בועות קטנות בכל התערובת. יוצקים את התערובת לאט לתוך צלחת הפטרי, כך שהיא מכסה לחלוטין את תבנית פרוסות הסיליקון.
לאחר מכן מניחים את צלחת הפטרי בוואקום למשך 10 דקות כדי להסיר את כל בועות האוויר מתערובת ה-PDMS. אם נשארות בועות על פני התערובת, לאחר הוצאתן מהוואקום, השתמש בפיפטה כדי לפוצץ אותן. לאחר מכן, אופים את המכשיר בחום של 75 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
כאשר מקוררים בחזרה לטמפרטורת החדר, חותכים בזהירות את ה-PDMS סביב התבנית ולאחר מכן מקלפים בעדינות את שכבת ה-PDMS הפולימרי מתבנית פרוסות הסיליקון, תוך הימנעות מכל נזק לבניית תבנית הוופל. הנח את שכבת ה-PDMS על הספסל כשצד התבנית פונה כלפי מעלה. חתוך בזהירות את השבב הבודד עם סכין גילוח תעשייתי בקצה אחד, תוך שמירה על מרווח הולם מהקצה של כל שבב בודד כדי למנוע נזקי בנייה.
כשצד התבנית פונה כלפי מעלה, השתמש בעט ניקוב כדי לנקב חורים ישר כלפי מטה דרך עיגולי הכניסה והיציאה בכל צד של התעלות. בדוק כל חור על ידי הכנסת מחט עט האגרוף שוב לתוך החור. ודא שהמחט יכולה לצאת מהצד השני, מה שמעיד על כך שאין חסימות.
לאחר מכן, השתמש בסרט כדי לנקות חלקיקי אבק ופסולת מהמשטח העליון. חזור על שלב זה לפחות שלוש פעמים, והשאיר חתיכת סקוטש נקייה על ה-PDMS כדי לשמור על משטח נקי מאבק. לאחר מכן הפוך את המכשיר וחזור על הליך זה באתר הנגדי של ה- PDMS.
השאירו את פיסת הסרט האחרונה גם בצד זה. כעת הכינו משטח זכוכית לבסיס המכשיר. בחר את חתיכת זכוכית הכיסוי בגודל 24 מילימטר על 30 מילימטר בעובי שבין 13 ל -17 מילימטרים.
יש לרסס אתנול 70% על הזכוכית, ולייבש אותה עם מסיר אבק כדי לעקר את פני השטח. לאחר מכן העבירו את זכוכית הכיסוי וה-PDMS לצלחת פלסטיק. הסר את הסקוטש מה-PDMS, והנח את צד התבנית כלפי מעלה בצלחת, מבלי לגעת במשטח העליון.
לאחר מכן העבירו את הצלחת לתא פלזמה. החל טיפול בפלזמת חמצן על ה-PDMS ועל זכוכית הכיסוי כדי להפוך את המשטחים להידרופילים. לאחר מכן הסר את הצלחת מתא הפלזמה וחבר בזהירות את המשטחים המטופלים בפלזמה של ה-PDMS בזכוכית כיסוי.
ודא שאין בועות אוויר בין ה-PDMS לזכוכית הכיסוי. לבסוף, מעבירים את המכשיר לתנור ואופים בחום של 75 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות. טבלו את צינורות הקלט והפלט בתמיסת אתנול של 70% יום אחד לפני הכנת שבב PDMS.
למחרת מלאו מזרק של חמישה מיליליטר במים שעברו חיטוי, ושטפו כל צינור על ידי הנחת הצינור על המזרק ושטיפת הצינור במים. חזור על שלב הכביסה לפחות שלוש פעמים כדי להסיר שאריות אתנול. לאחר מכן בחן את ערוצי ה-PDMS תחת מיקרוסקופ אופטי.
באמצעות מטרה של פי 10 ודא שהמבנים עקביים ושלמים. ייצב את שבב ה- PDMS השלם על פלטפורמת המיקרוסקופ באמצעות סקוטש טייפ. אבטח מזרק של חמישה מיליליטר עמוס במים סטריליים למשאבת מזרק והכנס את צינורות הקלט והפלט המתאימים למכשיר.
הגדר את קצב הזרימה ל-750 מיקרוליטר לשעה ושטוף את השבב למשך כ-10 דקות. צפה בערוצים כדי לוודא שכל בועות האוויר נשטפות. אם נותרו בועות כלשהן לאחר שטיפה של 10 דקות, כוונן ידנית את המהירות כדי לחסל את הבועות.
העבירו מיליליטר אחד של דגימת שמרים מוכנה לשני צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר וצנטריפוגה את הדגימות למשך חמש דקות ב-3,000 פעמים G.הסר את רוב הסופרנטנט מכל צינור ושלב את השאר ליצירת דגימה של 5 מיליליטר. כאשר דגימת השמרים מוכנה כעת, הסר את צינורות הקלט משבב ה-PDMS. הפוך ידנית את משאבת המזרק כדי לשאוב בועת אוויר קטנה באורך של סנטימטר עד שני סנטימטרים, כל צינור קלט, ולאחר מכן לשאוב תרביות תאים.
לאחר מכן הכנס את צינור הקלט בחזרה לשבב ה-PDMS והפעל מחדש את המשאבה כדי לטעון את התאים במהירות של 750 מיקרוליטר לשעה. השאר את משאבת המזרק דולקת למשך 10 דקות ולאחר מכן בדוק את התקדמות העמסת התאים במיקרוסקופ. טעינה מוצלחת תלכוד תאים מתחת ליותר מ-60% מעמוד התלייה.
כדי לשמור על תאי השמרים, העבירו את התמיסה במזרק לתמיסת תזונה, והתאימו את המהירות ל -400 מיקרוליטר לשעה. ניתן לקבל את הפנוטיפ של תוחלת החיים של שמרים על ידי ספירת מספר הניצנים המיוצרים על ידי כל תא אם לכוד, והערכת אומדן קפלן-מאייר. באמצעות פרוטוקול זה, המכשיר לוכד לעתים קרובות תאי בת טריים שנבטו מהתאים הלכודים כבר.
תאים אלה הופכים לאחר מכן לתאי אם טריים שניתן לזהות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה במורד הזרם. תאי האם הטריים הללו מספקים מדידת תוחלת חיים מדויקת יותר. בניסוי זה, תוחלת החיים הממוצעת של תאי האם הטריים הייתה מעט ארוכה יותר בכשני דורות.
בנוסף למספר הניצנים, ניתן לחלץ מנתוני ההדמיה את מרווח הזמן בין שני אירועי ניצנים עוקבים. הנביטה מואטת באופן דרמטי לקראת סוף תוחלת החיים שלהם, מה שמעיד על מצבם הלא בריא של תאים מזדקנים אלה. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור גם להשתמש בשבב טרי כדי לסייע במניעת בועות, וגם להגדיל את ריכוז התאים על מנת לשפר את יעילות העמסת התאים בעת הצורך.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הזדקנות השמרים לחקור את השינויים המולקולריים המוקדמים שהם סיבתיים לפנוטיפ ההזדקנות. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר את המכשיר המיקרופלואידי הזה וכיצד להשתמש בו כדי למדוד תוחלת חיים ופנוטיפים תאיים בתאים בודדים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
מאמר זה מציג פרוטוקול ליצירת מכשירים מיקרו-פלואידיים מיוחדים למדידת אורך החיים והפנוטיפים התאיים של תאי שמרים בודדים. שיטה זו נועדה לטפל בשאלות מרכזיות בתחום הזדקנות השמרים, במיוחד לגבי תהליכי ההזדקנות של תאי אם.
This microfluidic approach enables high-resolution, longitudinal tracking of single-cell aging dynamics, providing mechanistic insights into cellular homeostasis loss that can inform target validation in aging-related pathways. By correlating molecular markers with lifespan outcomes in a controlled microenvironment, the method supports predictive confidence in early-stage hypothesis testing for conserved longevity mechanisms. Its scalability across strains and conditions positions it as a reusable discovery platform for de-risking therapeutic targets in age-associated diseases.
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven aging research that informs lead identification through phenotypic anchoring of molecular targets.