באמצעות מכשירים microfluidic למדוד פנוטיפים תוחלת החיים סלולר בתאי שמרים ניצני יחיד
30 במרץ 2017
מאמר זה מציג פרוטוקול מותאם לייצור שבבי microfluidic ואת ההתקנה של ניסויים microfluidic כדי למדוד את אורך החיים פנוטיפים הסלולר של תאי שמרים בודד.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לייצר התקן מיקרופלואידי ייעודי ולהשתמש בו כדי למדוד את תוחלת החיים והפנוטיפים התאיים של תא שמר בודד. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לכמה מהשאלות המרכזיות בתחום הזדקנות השמרים, כגון מדוע תאי אם מזדקנים ומתים, ומהם האירועים המולקולריים המוקדמים המניעים את אובדן ההומיאוסטזיס התאי ובסופו של דבר את הזדקנות התא ומותו? היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא היכולת לעקוב אחר תאי אם, למדוד את תוחלת חייהם ואת הסממנים המולקולריים השונים בו-זמנית, כך שניתן לחפש אירועים מולקולריים המתואמים עם תוחלת החיים.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הזדקנות שמרים, ניתן להחילה אותה גם על תחומים אחרים, כגון ניטור תגובות משניות להשתתפות הדורשות מעקב אחר תאים לאורך דורות רבים. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה יעבדו עם קשיים, שכן ייצור התקני המיקרופלואידיקה, טעינת התאים והגדרת המיקרוסקופ דורשים תרגול רב כדי להתבצע בהצלחה. הדגמה מוקדמת של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שטעינת התקן המיקרופלואידיקה בשמרים בצורה נכונה היא משימה מאתגרת.
כדי להתחיל, ייצרו תבנית פרוסית סיליקון עבור המכשיר באמצעות טכניקות סטנדרטיות כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט המצורף. הניחו אותה כאשר הצד עם התבליט פונה כלפי מעלה בתוך צלחת פטרית בנפח 15 סנטימטרים. אבטחו את התבנית על צלחת הפטריה באמצעות סרטי הדבקה.
לאחר מכן, הניחו כלי שקילה נקי על מאזנה ואפסו אותו. שפכו 50 גרם של בסיס PDMS לתוך כלי השקילה ולאחר מכן הוסיפו חמישה גרם של חומר מעבד PDMS. ערבבו את בסיס ה-PDMS ואת חומר המעבד באמצעות פיפטה חד-פעמית.
התחילו מקצה כלי השקילה והתקדמו באיטיות פנימה. ערבבו את התערובת היטב במשך מספר דקות עד להיווצרות בועות קטנות בכל רחבי התערובת. שפכו את התערובת באיטיות אל צלחת הפטרי, כך שתכסה לחלוטין את תבנית פרוסת הסיליקון.
לאחר מכן, הכניסו את צלחת הפטרי לוואקום למשך 10 דקות כדי להוציא את כל בועות האוויר מתערובת ה-PDMS. אם נותרו בועות על פני השטח של התערובת לאחר ההוצאה מהוואקום, השתמשו בפיפט כדי לנשוף אותן החוצה. לאחר מכן, אפו את המכשיר בטמפרטורה של 75 °C למשך שעתיים.
לאחר הקירור חזרה לטמפרטורת החדר, חתכו בזהירות את ה-PDMS מסביב לתבנית, ולאחר מכן קלפו בעדינות את שכבת ה-PDMS הפולימרי מהתבנית שבסיליקון, תוך הקפדה לא לגרום נזק למבנה התבנית. הניחו את שכבת ה-PDMS על משטח העבודה כאשר הצד עם התבנית פונה כלפי מעלה. גזרו בזהירות כל שבב בנפרד באמצעות להב תער תעשייתי בעל דופן אחת, תוך השארת שוליים מספיקים מקצה כל שבב כדי למנוע נזק למבנה.
כאשר צד התבנית פונה כלפי מעלה, השתמשו בעט ניקור כדי לנקור חורים ישרים למטה דרך עיגולי הכניסה והיציאה בכל צד של התעלות. בדקו כל חור על ידי הכנסה חוזרת של מחט עט הניקור לתוך החור. וודאו שהמחט יכולה לצאת מהצד השני, מה שמעיד על כך שאין חסימות.
לאחר מכן, השתמשו בסרט הדבקה כדי לנקות חלקיקי אבק ושיירי לכלוך מהמשטח העליון. חזרו על שלב זה לפחות שלוש פעמים, והשאירו חתיכה נקייה של סרט דבק Scotch על ה-PDMS כדי לשמור על משטח נקי מאבק. לאחר מכן, הפכו את המכשיר וחזרו על הליך זה בצד הנגדי של ה-PDMS.
השאירו את פיסת הסרט האחרונה גם בצד זה. כעת הכינו משטח זכוכית עבור בסיס המכשיר. בחרו את פיסת זכוכית הכיסוי בגודל 24 מילימטר על 30 מילימטר, בעובי שבין 13 ל-17 מילימטרים.
רססו את הזכוכית ב-70% ethanol, ויבשו אותה בעזרת מסיר אבק כדי לעקר את הפני השטח. לאחר מכן, העבירו את זכוכית הכיסוי ואת ה-PDMS לצלחת פלסטיק. הסירו את סרט ההדבקה (Scotch tape) מה-PDMS, והניחו אותו בצלחת כאשר הצד עם התבנית פונה כלפי מעלה, ללא מגע עם הפני השטח העליון.
לאחר מכן, העבירו את הפלטה לתא פלסמה. בצעו טיפול בפלסמת חמצן ב-PDMS ובזכוכית כיסוי כדי להפוך את השטחים להידרופיליים. לאחר מכן, הוציאו את הפלטה מתא הפלסמה וחברו בזהירות את השטחים של ה-PDMS והזכוכית כיסוי שעברו טיפול בפלסמה.
וודאו שאין בועות אוויר בין ה-PDMS לזכוכית הכיסוי. לבסוף, העבירו את ההתקן לתנור ואפו בטמפרטורה של 75 °C למשך שעתיים לפחות. השקיעו את צינורות הכניסה והיציאה בתמיסת אתנול 70% יום אחד לפני הכנת שבב ה-PDMS.
ביום למחרת, מלאו מזרק של 5 mL במים שעברו אוטוקלב, ושטפו כל מבחנה על ידי הצבת המבחנה על המזרק ושטיפתה במים. חזרו על שלב השטיפה לפחות שלוש פעמים כדי להסיר שאריות אתנול. לאחר מכן, בחנו את תעלולי ה-PDMS תחת מיקרוסקופ אופטי.
בעזרת עדשה של 10X ודאו שהמבנים עקביים ושלמים. קבעו את שבב ה-PDMS השלם על פלטפורמת המיקרוסקופ באמצעות סרט דביק. חברו מזרק של חמישה מיליליטר הממולא במים סטריליים למשאבת מזרקים, והחדירו את צינורות הכניסה והיציאה המתאימים אל המכשיר.
הגדירו את קצב הזרימה ל-750 microliters per hour ושטפו את השבב למשך כ-10 דקות. עקבו אחר התעלים כדי לוודא שכל בועות האוויר נשטפות החוצה. אם נותרו בועות לאחר שטיפה של 10 דקות, כוון באופן ידני את המהירות כדי להסיר את הבועות.
העבירו מיליליטר אחד של דגימת שמרים מוכנה לשתי מבחנות מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר, וסובבו את הדגימות בצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-3,000 ×g. הסירו את רוב הנוזל העליון (supernatant) מכל מבחנה ואחדו את השארית כדי ליצור דגימה של 5 מיליליטר. כעת, כאשר דגימת השמרים מוכנה, הסירו את מבחנות ההזנה משבב ה-PDMS. הפעילו ידנית את משאבת המזרק במצב הפוך כדי לשאוב בועת אוויר קטנה באורך של סנטימטר אחד עד שניים לתוך כל מבחנת הזנה, ולאחר מכן שאבו את תרביות התאים.
לאחר מכן, הכניסו חזרה את צינור הכניסה לשבב ה-PDMS והפעילו מחדש את המשאבה כדי להטעין את התאים במהירות של 750 µL לשעה. השאירו את משאבת המזרק פועלת למשך 10 דקות, ולאחר מכן בחנו תחת המיקרוסקופ את התקדמות טעינת התאים. טעינה מוצלחת תגרום ללכידת תאים תחת יותר מ-60% מהעמודים התלויים.
כדי לתחזק את תאי השמרים, החליפו את התמיסה במזרק לתמיסת תזונה, והתאימו את המהירות ל-400 microliters לשעה. ניתן לקבל את הפנוטיפ של אורך החיים של השמרים על ידי ספירת מספר הניצנים שנוצרו בכל תא אם לכוד, והערכת מדד Kaplan-Meier. בשימוש בפרוטוקול זה, המכשיר לוכד לעיתים קרובות תאי בתה טריים שניצנו מהתאים שכבר נלכדו.
תאים אלו הופכים לאחר מכן לתאי אם טריים, אותם ניתן לזהות באמצעות תוכנה לניתוח תמונות בשלב מאוחר יותר. תאי אם טריים אלו מספקים מדידה מדויקת יותר של תוחלת החיים. בניסוי זה, תוחלת החיים הממוצעת של תאי האם הטריים הייתה ארוכה יותר במעט, בכשני דורות.
בנוסף למספר הנבטים, ניתן להוציא מנתוני הדימוג את פרק הזמן שבין שני אירועי נביטה רצופים. הנביטה מואטת באופן דרמטי לקראת סוף תוחלת חייהם, מה שמעיד על מצבם הבלתי בריא של תאים מבוגרים אלו. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור להשתמש בשבב שהוכנה טريה כדי לסייע במניעת בועות, ולהגדיל את ריכוז התאים במידת הצורך כדי לשפר את יעילות טעינת התאים.
לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הזקנה בשמרים לחקור את השינויים המולקולריים המוקדמים הגורמים לפנוטיפ ההזדקנות. לאחר צפייה בסרטון זה, תשיגו הבנה טובה לגבי אופן ההכנה של התקן המיקרופלואידי הזה וכיצד להשתמש בו למדידת תוחלת חיים ופנוטיפים תאיים בתאים בודדים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול ליצירת התקני מיקרופלואידיקה ייעודיים למדידת תוחלת החיים והפנוטיפים התאיים של תאי שמרים בודדים. שיטה זו נועדה לתת מענה לשאלות מפתח בתחום הזקנה של השמרים, ובמיוחד בנוגע לתהליכי ההזדקנות של תאי האם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מיקרופלואידיקה
- ביולוגיה תאית
- הזדקנות שמרים
רקע
- התקנים מיקרופלואידיים מאפשרים בקרה מדויקת על הסביבה התאית.
- הבנת הזקנה בשמרים עשויה לספק תובנות לגבי תהליכי הזדקנות ביולוגיים רחבים יותר.
- מעקב אחר תאי אם והסמנים המולקולריים שלהם הוא קריטי למחקר זה.
- הטענה נכונה של שמרים לתוך התקנים מיקרופלואידיים היא מאתגרת ודורשת תרגול.
מטרת המחקר
- למדידת תוחלת החיים של תאי שמרים בודדים.
- לחקר האירועים המולקולריים המובילים להזדקנות תאית.
- לבחינת המתאם בין תוחלת החיים למספר סממנים מולקולריים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ייצור של התקנים מיקרופלואידיים.
- הטענת תאי שמרים אל תוך ההתקנים.
- הגדרת המיקרוסקופ לצורך תצפית.
- מעקב אחר פנוטיפים תאיים ואורך חיים.
תוצאות עיקריות
- מעקב מוצלח אחר תאי אם ואורך חייהם.
- זיהוי סמנים מולקולריים הקשורים להזדקנות.
- תובנות לגבי תהליך ההזדקנות של תאי שמרים.
- יישומים פוטנציאליים בתחומים אחרים של מחקר תאי.
מסקנות
- השיטה המיקרופלואידית מספקת תובנות בעלות ערך לגבי הזדקנות של שמרים.
- ניתן להתגבר על אתגרים בייצור המכשיר ובהטענת התאים באמצעות תרגול.
- טכניקה זו עשויה להיות ישימה לתחומי מחקר אחרים הדורשים תצפית תאית לטווח ארוך.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
גישה מיקרופלואידית זו מאפשרת מעקב אורך רב-רזולוציה של דינמיקת הזדקקות של תאים בודדים, ומספקת תובנות מכניסטיות לגבי אובדן ההומיאוסטזיס התאי שיכולות לסייע בתיקוף מטרות במסלולים הקשורים להזדקנות. באמצעות קורלציה בין סמנים מולקולריים לתוצאות תוחלת חיים בסביבה מיקרוסקופית מבוקרת, השיטה תומכת בביטחון חיזוי בבדיקת השערות בשלב מוקדם עבור מנגנוני אריכות חיים שמורים. היכולת להרחבת השיטה על פני זנים ותנאים שונים ממצבת אותה כפלטפורמת גילוי רב-פעמית להפחתת סיכונים במטרות טיפוליות במחלות הקשורות לגיל.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי קישור אירועים מולקולריים לפנוטיפים של הזדקנות תפקודית בתאים בודדים.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות קורלציה בזמן אמת בין סמנים ביולוגיים למסלולי תוחלת חיים.
- ערך מדעי: מגביר את הוודאות לגבי המטרה על ידי זיהוי מניעים מולקולריים שמורים של הזדקנות על פני רקעים גנטיים שונים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנה של מערכות ביולוגיות סטנדרטיות ו可שחזרות לסריקה פנוטיפית כמותית בעبر ערוצים מרובים.
- ערך תפעולי: אספקת דימויים ברזולוציה גבוהה ומדידות של תדירות ניצות המאפשרות הערכה מהימנה של השפעת תרכובות.
- ערך מדעי: מקל על הניתנות להרחבה של הבדיקה (scalability) על ידי לכידת מאות תאים לכל ערוץ לצורך ניתוח אורכי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מספק תובנות על מערכות רלוונטיות למחלה באמצעות אפיון דינמיקת ההזדקנות התאית ברזולוציה של תא בודד.
- ערך תפעולי: מבטיח המשכיות תרגומית משלב הגילוי דרך מדידה סטנדרטית של תוחלת חיים ופנוטיפ.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטים על ידי הבחנה בין אירועים מולקולריים סיבתיים לבין שינויים קורלטיביים בהזדקנות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים על ידי אפשור מחקר על הזדקנות המונחה-השערה, המנחה את זיהוי המולקולות המובילות (leads) באמצעות עיגון פנוטיפי של מטרות מולקולריות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהבהרת מסלולים ביולוגיים על ידי מעקב אחר סממנים מולקולריים בזמן אמת לצד תוחלת החיים השכפולית בתאי אם.
- סריקה: מספקת פלטים פנוטיפיים כמותיים ופתורים בזמן, כגון מרווחי ניבוב ושינויים מורפולוגיים, לצורך סריקת תרכובות.
- אנליזה: מייצרת הערכות הישרדות לפי קפלן-מאייר ונתוני שושלת של תא בודד כדי לאפשר ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מתחברת להמשכיות פרה-קלינית על ידי אספקת פנוטיפי הזדקנות שמורים הניתנים לתרגום למודלים אוקריוטיים גבוהים יותר.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמה מודולרית הניתנת להתאמה למספר זנאי שמרים ותנאים סביבתיים לשימוש חוזר.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת העמימות בקישור בין סממנים מולקולריים לתוצאות הזדקנות.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים לייצור מכשירים ולהטענת תאים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי מתן אפשרות לזיהוי מוקדם של התערבויות לא יעילות במסלולי הזדקנות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים באמצעות זיהוי מטרות בעלות תיקוף פנוטיפי חזק במודלים של הזדקנות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בייצור מכשירים מיקרופלואידיים וטיפול סטרילי במולקולות ביולוגיות.
- תלוי בגישה למערכות טיפול בפלזמה, משאבות מזרק ומערכי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית להכנה עקבית של השבבים ולטיפול בזני שמרים.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבה למערכות מודל שאינן שמרים, בשל הבדלים בגודל התא ובקישור (adhesion).
- מוגבל על ידי הצורך בהסרה קפדנית של בועות ובניקוי פני השטח כדי להבטיח לכידת תאים ודימות אמינים.
