Name: יצירת רקמת הלב מציגה שילוב מכני של Spheroids באמצעות 3D Bioprinting (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 40 s
Description: למדו הדפסה תלת-ממדית של רקמת לב ללא חומרים ביולוגיים תוך שימוש בספרואידים תאיים בלבד. השיטה מדגימה אינטגרציה מכנית ומציעה פוטנציאל לרפואה רגנרטיבית ולמחקר מחלות לב.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מאשרים את מקורות המימון הבאים: Magic That Matters Fund for Cardiovascular Research ו- Maryland Stem Cell Research Research (2016-MSCRFI-2735).

1. הכנת Cardiomyocytes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת ותרבות האדם המושרה בתאי גזע pluripotent (hiPSCs) על 6-גם צלחות מצופה מטריצה ​​במרתף במרתף כמתואר 10 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבדל hiPSCs לתוך cardiomyocytes hiPSC נגזר (hiPSC-CMs) באמצעות שיטות המתוארות לעיל 11 , 12 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 19 לאחר הבחנה, לבודד את cardiomyocytes באמצעות 2 מ&quot;ל של טריפסין / EDTA 0.05% בכל טוב במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג cardiomyocytes תחת מיקרוסקופ אופטי כדי לצפות דיסוציאציה התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל טריפסין באמצעות 2 מ&quot;ל של מעכב טריפסין 0.0125%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכת cardiomyocytes מבודדים ולהעביר אותם לתוך צינור 50 מ&quot;ל חרוטי אחד באמצעות מילוי פיפטה ממונע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה התא עבור 5 דקות ב 250 xg בטמפרטורת החדר להשיג גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 5 מ&quot;ל של רוזוול פארקמדיה ממוריאל (RPMI) התקשורת התא בתוספת B-27 (RPMI / B-27 התקשורת התא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 20 μL של תאים בתקשורת התא כתם עם כמות שווה של פתרון 0.4% Trypan כחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מונה תא אוטומטי או hemocytometer ידנית לספור ולקבל את הריכוז ואת הכדאיות התא ההשעיה התא. </li></ol> 2. הכנת פיברובלסטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום fibroblast הלב של הלב (HCF) (סוג החדר הבוגר) קו התא 13 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המעבר לבודד אותם בהתאם HCF פרוטוקולים culturing 13 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 20 μL של תאים בתקשורת התא כתם עם כמות שווה של פתרון טריפאן כחול 0.4%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מונה תא אוטומטי או hemocytometer ידנית לספור ולקבל את הריכוז ואת הכדאיות התא ההשעיה תא חדש. </li></ol> 3. הכנת תאים אנדותל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום את המטלית האנושיתוריאלי של תא תא אנדותלי (HUVEC) כמתואר 14 . המעבר לבודד אותם בהתאם HUVEC פרוטוקולים culturing כמתואר 14 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 20 μL של תאים בתקשורת התא כתם עם כמות שווה של פתרון 0.4% Trypan כחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מונה תא אוטומטי או hemocytometer ידנית לספור ולקבל את הריכוז ואת הכדאיות התא ההשעיה התא. </li></ol> 4. שיתוף תרבות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את שלושת סוגי התאים (hiPSC-CM, HCFs ו- HUVECs) בתקשורת RPMI / B-27 כדי ליצור מלאי של תמיסת תאים מעורבים בצינור חרוטי 50 מ&quot;ל, ב- hiPSC-CM: HCF: יחס תא HUVEC של 70:15:15 וריכוז של 165,000 תאים לכל מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפיץ את הפתרון התא המעורב לתוך מצורף נמוך במיוחד 96-טוב צלחות U- התחתונה ב 200 μL לכל טוב, או 33,000 תאים לכל טוב, באמצעות פיפטה רב ערוצי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות 96-היטב במשך 3 ימים (37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצניאידיאל, לחות 95%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדיקת נוכחות של ספיראידים תאיים רב תאיים מעורבים במרכז ובתחתית בארות בודדים, תחת מיקרוסקופ אור. הערה: בהקרנה מיקרוסקופית דו מימדי, אלה spheroids יופיע עגול בצורת ( איור 1 ). Spheroids צריך טופס בתוך 24 שעות, לאחר זריעת תאים לתוך נמוך מאוד מצורף 96-טוב צלחות. Spheroids צריך להתחיל להכות בתוך 48 שעות, לאחר זריעת תאים לתוך צלחות 96-היטב. Spheroids שאינם מכות לא צריך לשמש 3D bioprinting כדי להבטיח כי הסופי bioprinted 3D תיקון הלב הוא פונקציונלי. Immunofluorescence של spheroids עבור connexin 43 (Cx43) וטרופונין ניתן להשתמש כדי להעריך הרכב הסלולר spheroid ואיכות 15 . </li></ol> 5. 3D ביופרינטינג של רקמות ללא קרם רקמות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את הצלחות המכילות את spheroids לתוך מגזינים של bioprinter ללא פיגום 3D מבוסס פיגום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את bioprinter 3D ולבצע את התוכנה bioprinting 3D. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;עזר&quot;, &quot;מבצע הכנה&quot;, &quot;בדיקת מצב&quot;, ולאחר מכן &quot;דף הבית לחזור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הסמל הירוק תחת &quot;התחל&quot; כדי להתחיל בדיקה spheroid. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפה בקטעי spheroid להופיע מתחת לעמודה &quot;(2) Dia (מיקרומטר)&quot; על המסך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך את קוטר spheroid הממוצע של 100 מיקרומטר הקרוב, לחץ על &quot;הגדרות ראשוניות&quot; והזן את קוטר spheroid הממוצע לתוך המגרש Z ערמה (מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;סה&quot;כ&quot;, המספר תחת &quot;שכבות&quot; צריך להתאים באופן אוטומטי. לחץ על &quot;החל&quot; כדי לאשר את ההגדרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;מפת מערך מחט&quot;, עבור &quot;שכבה לא&quot;, בחר את השכבה הרצויה עבור bioprinting 3D, ולצייר את העיצוב bioprintinting 3D הרצוי על המפה בצד שמאל של המסך על ידי בחירת עמדות ספרואיד בודדים. קלישK &quot;החל&quot; כדי לאשר את העיצוב bioprinting 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;מחט מערך בדוק&quot; כדי להתחיל בדיקת מערך המחט. אם מערך המחט הוא מתוך המוקד, ערכי קלט לתוך &quot;OffsetZ (מיקרומטר)&quot;, החל מ 0 עד 500 מיקרומטר כדי להתאים את המיקוד המצלמה, החל עם 500 מיקרומטר ירידה של 100 מיקרומטר עד 0 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;פרמטרים ביקורת&quot;, &quot;סוג 1&quot;, ולהגדיר &quot;קוטר (מיקרומטר)&quot; אל טווח קוטר הרצוי. הגדר &quot;סיבוב (%)&quot; ו &quot;חלקות (%)&quot; לאחוזים הרצוי. לחץ על &quot;החל&quot; כדי לאשר את ההגדרות. הערה: כאן בקוטר spheroid נקבעו מ 450 מיקרומטר עד 550 מיקרומטר. &quot;סיבוב (%)&quot; ו &quot;חלקות (%)&quot; הם מחשב מחושב הערכה של כל הספרואיד הפרט. כאן, ההגדרות המשמשות &quot;עגול (%)&quot; הוא 60% ו &quot;חלקות (%)&quot; הוא 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;נוכחות&quot; ועדכן את &quot;קוטר (מיקרומטר)&quot; לאותה הגדרהS בשלב הקודם. לחץ על &quot;החל&quot; כדי לאשר את ההגדרות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;מצב מחסנית&quot;, ולאחר מכן את הסמל הירוק תחת &quot;התחל&quot; כדי להתחיל spheroid להרים באמצעות הזרבובית של bioprinter 3D על ידי שאיבת ואקום, ואת המיקום של spheroids במקומות ספציפיים במערך מחט. הערה: עבור תיקון לב המורכב 81 spheroids (9 spheroids x 9 spheroids), 3D bioprinting צריך לקחת על 20 עד 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר bioprinting, באמצעות מלקחיים סטרילית, להרים את מחט מערך המכיל את התיקון bioprinted 3D ולהעביר אותו לתוך כוס מ&quot;ל סטרילי 250 מ&quot;ל המכיל 150 מ&quot;ל של RPMI / B-27 התקשורת התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תיקון 3D bioprinted עם מערך מחט במשך 3 ימים (37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, לחות 95%). </li></ol> 6. הסרת תיקון 3D Bioprinted ממערך מחט תיקון התבגרות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 3 ימים של הדגירה, עם יד אחת בבסיס מערך המחט והשני על כיסוי פלסטיק תחת tהוא תיקון, בעדינות להחליק את כיסוי הפלסטיק כלפי מעלה כדי להסיר את תיקון 3D bioprinted ממערך המחט. הערה: סיכה עם מלוחים שנאגרו מלוחים (PBS) ניתן להחיל על המחטים רק לפני שלב זה, לפי הצורך, להסרה חלקה וקלה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות זוג מלקחיים סטרילית, להרים את כיסוי פלסטיק עם תיקון bioprinted 3D על גבי זה ולהעביר את התיקון ואת כיסוי פלסטיק לתוך צלחת 35 מ&quot;מ המכיל RPMI / B-27 התקשורת התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נער בעדינות את כיסוי הפלסטיק עם המדבקה בתקשורת ה - RPMI / B-27, עם המלקחיים המחזיקים עדיין בכיסוי הפלסטיק, כדי לשחרר את התיקון לתקשורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את התיקון bioprinted 3D תחת מיקרוסקופ אור לדמיין אם זה מכות על מנת להבטיח כי תיקון bioprinted 3D הוא פונקציונלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תיקון 3D bioprinted בצלחת 35 מ&quot;מ במשך 3 ימים או יותר (37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני, לחות 95%). הערה: לאחר 3 ימים, spheroids להתמזג יחד את החורים באת הטלאי, שבו היו המחטים, כבר לא יהיה גלוי. </li></ol>

<ol><li>Murphy, S. V., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+of+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotech%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting of tissues and organs.</a> Nat Biotech. 32, 773-785 (2014).</li>
<li>Bajaj, P., Schweller, R. M., Khademhosseini, A., West, J. L., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+biofabrication+strategies+for+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">3D biofabrication strategies for tissue engineering and regenerative medicine.</a> Ann Rev Biomed Eng. 16, 247-276 (2014).</li>
<li>Patra, S., Young, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+3D+Printing+Techniques+and+the+Future+in+Biofabrication+of+Bioprinted+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem+Biophy%22%5BJournal%5D)">A Review of 3D Printing Techniques and the Future in Biofabrication of Bioprinted Tissue.</a> Cell Biochem Biophy. 74, 93-98 (2016).</li>
<li>Moldovan, N. I., Hibino, N., Nakayama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+the+Kenzan+Method+for+Robotic+Cell+Spheroid-Based+Three-Dimensional+Bioprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+B+Rev%22%5BJournal%5D)">Principles of the Kenzan Method for Robotic Cell Spheroid-Based Three-Dimensional Bioprinting.</a> Tissue Eng Part B Rev. , (2017).</li>
<li>Cui, X., Boland, T., D'Lima, D. D., Lotz, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+inkjet+printing+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Recent+Pat+Drug+Deliv+Formul%22%5BJournal%5D)">Thermal inkjet printing in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Recent Pat Drug Deliv Formul. 6, 149-155 (2012).</li>
<li>Murphy, C. M., Haugh, M. G., O'Brien, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+mean+pore+size+on+cell+attachment%2C+proliferation+and+migration+in+collagen-glycosaminoglycan+scaffolds+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater%22%5BJournal%5D)">The effect of mean pore size on cell attachment, proliferation and migration in collagen-glycosaminoglycan scaffolds for bone tissue engineering.</a> Biomater. 31, 461-466 (2010).</li>
<li>Noguchi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+three-dimensional+pre-vascularized+scaffold-free+contractile+cardiac+patch+for+treating+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Heart+Lung+Transpl%22%5BJournal%5D)">Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease.</a> J Heart Lung Transpl. 35, 137-145 (2016).</li>
<li>Mironov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+printing%3A+tissue+spheroids+as+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater%22%5BJournal%5D)">Organ printing: tissue spheroids as building blocks.</a> Biomater. 30, 2164-2174 (2009).</li>
<li>Itoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold-Free+Tubular+Tissues+Created+by+a+Bio-3D+Printer+Undergo+Remodeling+and+Endothelialization+when+Implanted+in+Rat+Aortae%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Scaffold-Free Tubular Tissues Created by a Bio-3D Printer Undergo Remodeling and Endothelialization when Implanted in Rat Aortae.</a> PloS One. 10, e0136681(2015).</li>
<li>Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+with+CytoTune%2C+a+non-integrating+Sendai+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus.</a> Methods Mol Biol. 997, 45-56 (2013).</li>
<li>Li, S., Cheng, H., Tomaselli, G. F., Li, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+basis+of+excitation-contraction+coupling+in+human+pluripotent+stem+cell-derived+ventricular+cardiomyocytes+revealed+by+Ca2%2B+spark+characteristics%3A+direct+evidence+of+functional+Ca2%2B-induced+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Mechanistic basis of excitation-contraction coupling in human pluripotent stem cell-derived ventricular cardiomyocytes revealed by Ca2+ spark characteristics: direct evidence of functional Ca2+-induced Ca2+ release.</a> Heart Rhythm. 11, 133-140 (2014).</li>
<li>Boheler, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Surface+N-Glycoproteome+Resource+Reveals+Markers%2C+Extracellular+Epitopes%2C+and+Drug+Targets%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A Human Pluripotent Stem Cell Surface N-Glycoproteome Resource Reveals Markers, Extracellular Epitopes, and Drug Targets.</a> Stem Cell Rep. 3, 185-203 (2014).</li>
<li>ScienCell Research Laboratories. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Human+Cardiac+Fibroblasts+%28adult+ventricular%29+Product+Sheet%22">Human Cardiac Fibroblasts (adult ventricular) Product Sheet</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://www.sciencellonline.com/PS/6310.pdf ">https://www.sciencellonline.com/PS/6310.pdf </a> (2017).</li>
<li>Lonza Walkersville, Inc. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Endothelial+Cell+Systems+-+Technical+Information+%26+Instructions.%2C%22">Endothelial Cell Systems - Technical Information & Instructions.,</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_ManualsProductInstructions_Instructions__Technical_Info_-_Endothelial_Cell_Systems.pdf ">http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_ManualsProductInstructions_Instructions__Technical_Info_-_Endothelial_Cell_Systems.pdf </a> (2015).</li>
<li>Thermo Fisher Scientific, Inc. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Immunofluorescence+Method+for+IHC+Detection%22">Immunofluorescence Method for IHC Detection</a>. , 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/immunofluorescence-method-ihc-detection.html ">https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/immunofluorescence-method-ihc-detection.html </a> (2017).</li>
<li>Murata, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+preliminary+study+of+osteochondral+regeneration+using+a+scaffold-free+three-dimensional+construct+of+porcine+adipose+tissue-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">A preliminary study of osteochondral regeneration using a scaffold-free three-dimensional construct of porcine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells.</a> J Orthop Surg Res. 10, (2015).</li>
<li>Mosadegh, B., Xiong, G., Dunham, S., Min, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+progress+in+3D+printing+for+cardiovascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Mater%22%5BJournal%5D)">Current progress in 3D printing for cardiovascular tissue engineering.</a> Biomed Mater. 10, 034002(2015).</li>
<li>Chang, C. C., Boland, E. D., Williams, S. K., Hoying, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct-write+Bioprinting+Three-Dimensional+Biohybrid+Systems+for+Future+Regenerative+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res.+Part+B%2C+Appl+Biomater%22%5BJournal%5D)">Direct-write Bioprinting Three-Dimensional Biohybrid Systems for Future Regenerative Therapies.</a> J Biomed Mater Res. Part B, Appl Biomater. 98, 160-170 (2011).</li>
<li>Lee, J. M., Sing, S. L., Tan, E. Y. S., Yeong, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioprinting+in+cardiovascular+tissue+engineering%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22International+J+Bioprinting%22%5BJournal%5D)">Bioprinting in cardiovascular tissue engineering: a review.</a> International J Bioprinting. 2 (2016), (2016).</li>
</ol>

למחברים אין מה לגלות.

חשוב להשתמש בספרואידים פועמים ופונקציונליים להדפסה ביולוגית תלת מימדית. אם ספרואידים אינם פועמים, המשך השימוש בהם יגרום תמיד למדבקה תלת-ממדית מודפסת ביולוגית לא מתפקדת.
יתרון אחד של גישה זו הוא היכולת לתפעל את תכולת התאים של המדבקה על ידי שינוי מספר התאים הכולל ואחוז הקרדיומיוציטים, תאי האנדותל והפיברובלסטים בספרואידים. זה מאפשר להדפיס סוגים רבים ושונים של מדבקות לב, עם תכונות היסטולוגיות ומכניות שונות.
גישה זו מאפשרת גם להשתמש בסוגים שונים של ספרואידים לייצור מדבקה...

ישנן שיטות רבות ושונות של 3D bioprinting 1 , 2 , 3 . 3D bioprinting מסווגת לעתים קרובות על ידי טכנולוגיית הדפסה 1 , עם דוגמאות כגון bioprinting דיו, biocrinting microextrusion, לייזר בסיוע bioprinting, שילוב של שיטות, או גישות חדשות יותר. 3D bioprinting יכול גם להיות מסווגים לתוך ללא פיגומים או שיטות פיגום תלוי 4 . רוב השיטות של bioprinting 3D הם תלויים פיגום, שם יש צורך biomaterials, למשל ביוינקים 5 או פיגומים 6 . עם זאת, תלוי 3D פיגום bioprinting פנים בעיות רבות ומגבלות 4 , 7 , כגון immunogenicity של חומר פיגום, עלות bioinks קניינית, מהירות איטית ורעילות של השפלה מוצרים. סקאףהנדסת רקמת לב ללא קפל באמצעות spheroids כבר ניסה 8 , עם פוטנציאל להתגבר על החסרונות האלה של הנדסת רקמות תלוי פיגום. עם זאת, כפי שהוכיחו על ידי המחברים באותו נייר, זה היה קשה לטפל בחוזקה מיקום spheroids במקומות קבועים, בתהליך של biofabrication. השימוש המלווה של bioprinting 3D ו הנדסת רקמות מבוסס spheroid יש פוטנציאל להתגבר על קשיים אלה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים bioprinting 3D של רקמת לב ללא biomaterials אחרים, תוך שימוש רק בתאים בצורת spheroids. פיגומים מבוססי spheroid מבוססי spheroid 3D יש את היכולת להרים spheroids בודדים באמצעות שאיבה ואקום ולמקם אותם על מערך מחט. הרעיון של מיקום spheroids על מערך מחט ב bioprinting 3D, הוא בהשראת השימוש של מערכי מחט (המכונה &quot; קנזאן &quot;) של Japa העתיקהNese, אומנות, סידור פרחים, ikebana. מערכת זו מאפשרת spheroids להיות ממוקם במדויק בכל תצורה ותוצאות הספירואידים הפרט fusion יחד לאורך תקופה קצרה כדי ליצור רקמות bioprinted 3D. שיטה זו מאפשרת spheroids להיות מניפולציה בקלות, עם השלכות פוטנציאליות לעתיד של ביו-אפורציה אורגנית ללא פיגום.

<table><tbody><tr><td>Geltrex</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td></td><td></td>A1413202</tr><tr><td>טריפסין/EDTA 0.05%</td> <td>תרמו פישר</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>מעכב טריפסין מוגדר 0.0125%</td> <td>תרמו פישר</td><td>R007100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI מדיה סלולרית</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td>RPMI בתוספת B27 מהווה מדיה תרבית HIPSC-CM</td></tr><tr><td>תוסף B-27</td> תרמו <td>פישר</td><td>17504044</td><td>RPMI בתוספת B27 מהווה HIPSC-CM מדיה תרבית</td></tr><tr><td>Countess Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr><tr><td>פיברובלסטים לבביים אנושיים (סוג חדר למבוגרים)</td> <td>Sciencell</td><td>6310</td><td></td></tr><tr><td>תאי אנדותל וריד טבורי אנושי</td><td>Lonza</td><td>CC-2935</td><td></td></tr><tr><td>PrimeSurface חיבור נמוך במיוחד 96 בארות צלחות U תחתונות&nbsp;</td><td>אקיטה סומיטומו בקליט ושות'</td><td>MS-9096UZ</td><td></td></tr><tr><td>מדפסת תלת מימד Regenova Bio</td><td>Cyfuse Biomedical K.K.</td><td>N/A</td><td>www.cyfusebio.com/en/</td></tr> <tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td> <td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Troponin T נוגדן</td><td>Thermo Fisher</td><td>701620</td><td></td></tr><tr><td>Connexin 43 (Cx43) נוגדן</td><td>Chemicon</td><td>MAB3068</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant עם DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36935</td><td></td></tr></tbody></table>

יצירת רקמת הלב מציגה שילוב מכני של spheroids באמצעות 3d bioprinting

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

פרוטוקול זה מתאר bioprinting 3D של רקמת לב ללא שימוש biomaterials, באמצעות תאים בלבד. Cardiomyocytes, תאים אנדותל fibroblasts מבודדים הראשון, נספר ומעורב ביחסים התא הרצוי. הם שיתוף תרבותי בארות בודדים נמוך מאוד מצורף 96-טוב צלחות. תוך 3 ימים, להכות בצורת spheroids. אלה spheroids אז הרימו ידי זרבובית באמצעות יניקה ואקום התאספו על מערך מחט באמצעות bioprinter 3D. את spheroids מותר אז כדי fuse על מחט מערך. שלושה ימים לאחר bioprinting 3D, spheroids מוסרים כתיקון שלם, אשר כבר ספונטני מכות. תלת מימד bioprinted תיקוני הלב מציגה שילוב מכני של spheroids רכיב והם מאוד מבטיח התחדשות רקמת הלב כמו מודלים 3D של מחלת לב.

בסוף שלב 4.4 (שיתוף תרבות), התאים בכל טוב צריך צבירה בתחתית של מצורף נמוך במיוחד 96-טוב U-bottom צלחות כדי ליצור spheroids על ידי כוח הכבידה. אלה spheroids להכיל hiPSC-CM, HCFs, ו HUVECs, והוא יכול להיות בחן ויזואלית תחת מיקרוסקופ אור, שם הם צריכים להופיע מעגלית על ידי היטל דו מימדי ( איור 1 ). בסוף שלב 6.3, תיקון לב bioprinted 3D צריך להכיל חללים ברקמה, בשל חורים מחט שנוצרו על ידי מערך המחט ( איור...

פרוטוקול זה מתאר bioprinting 3D של רקמת לב ללא שימוש biomaterials. תלת מימד bioprinted תיקוני הלב מציגה שילוב מכני של spheroids רכיב והם מאוד מבטיח התחדשות רקמת הלב כמו מודלים 3D של מחלת לב.

יצירת רקמת הלב מציגה שילוב מכני של Spheroids באמצעות 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

מטרת סרטון זה היא להדגים הדפסה ביו-תלת-ממדית (3D bioprinting) של רקמת לב ללא שימוש בחומרי ביולוגיים, תוך שימוש בתאים בלבד. ראשית, מבודלים קרדיומיוציטים, תאי אנדותל ופיברובלסטים, סופרים אותם ומערבבים אותם ביחסי התאים הרצויים. לאחר מכן, הם מחולקים באמצעות פיפט רב-ערוצי לבארים בודדות בלוחות 96 בארות בעלות הידבקות נמוכה במיוחד (ultra low attachment).התאים בפלטות בעלות 96 בארות מדוגרים למשך שלושה ימים; לאחר שלושה ימים, הם יוצרים ספרואידים הפועים באופן ספונטני. מיקרוסקופיה קונפוקלית חושפת ביטוי של connectins ב-43, המסומן פלואורסצנטית בירוק בקרדיומיוציטים חיוביים ל-Troponin T, המסומנים פלואורסצנטית באדום רחוק בתוך הספרואידים. פלטות ה-96 בארות המכילות את הספרואידים נטענות לאחר מכן אל המדפסת הביולוגית התלת-ממדית.המדפסת הביולוגית התלת-ממדית מתחילה בהעברת פלטת 96 הבארים למיקום סמוך למערך המחטים באמצעות פלטפורמה נעה. לאחר מכן, המדפסת הביולוגית התלת-ממדית סורקת את כל הספרואידים בפלטת 96 הבארים כדי להשיג נתונים רלוונטיים עבור כל ספרואיד, כגון קוטרו וצורתו. זוהי תצוגה מקרוב של תהליך ההדפסה הביולוגית התלת-ממדית.הספרואיד נשאב מלוח 96 בארות משמאלה באמצעות נחיר (nozzle) השואב בוואקום וממוקם במיקום ספציפי במערך מחטים מימינה. תהליך זה חוזר על עצמו עד לסיומו של תהליך הביו-הדפסה התלת-ממדית. לאחר שכל הספרואידים בלוח 96 הבארות הודפסו, מדפסת הביו התלת-ממדית תשמור את לוח 96 הבארות הקיים ותטען לוח חדש, באמצעות הפלטפורמה הנעה.זהו סרטון timelapse המציג מבט מלמעלה של הדפסה ביו-ממדית (3D bioprinting) של טלאי בגודל תשעה על תשעה במהירות של פי 100; המחטים במערך המחטים מסודרות במבנה קבוצתי, וספרואידים נטענים על כל מחט מלמעלה. לאחר שלושה ימים בתנאים סטריליים, טלאי הלב שהודפס בביו-מדפסת תלת-ממדית מוסר בזהירות רבה ממערך המחטים על ידי החלקתו עדינה של פיסת הפלסטיק הקשיחה שבמערך המחטים מתחת לטלאי כלפי מעלה. ניתן להשתמש בסיכוך עם phosphate buffered saline או PBS, שיוחל על המחטים במהלך שלב זה לפי הצורך, כדי להקל על ההסרה ולהפוך אותה לחלקה יותר.הטלאה לבבית שהודפסה בביו-הדפסה בתלת-ממד היא שבירה מאוד מיד לאחר הסרתה ממערך המחטים, ולכן יש לנהוג בזהירות כדי לא לפגוע בה. לאחר מכן, הועברה הטלאה הלבבית שהודפסה בביו-הדפסה בתלת-ממד לכלי תרבית רקמות של 35 מילימטר המכיל מצע גידול תאים מתאים. מיד לאחר ההסרה ממערך המחטים, ניתן להבחין כי הטלאה כבר פועמת, כאשר חורי המחטים משנים את גודלם עם כל פעימה.המדבקה הלבבית המודפסת בתלת-ממד עוברת תהליך הבשלה, שבמהלכו החללים ברקמה שנוצרו על ידי מערך המחטים מתמלאים על ידי רקמה סביבה. המדבקה הלבבית המודפסת בתלת-ממד ממשיכה לפעום באופן ספונטני. לסיכום, הדפסת רקמה לבבית בתלת-ממד היא ישימה ללא שימוש בביומטריאליים.טלאים לבביים שהודפסו בביו-הדפסה תלת-ממדית מראים אינטגרציה מכנית של ספרואידים המרכיבים אותם. ביו-הדפסה תלת-ממדית של רקמה לבבית בעלת יישומים קליניים מבטיחים עבור רגנרציה של רקמה לבבית, ומאפשרת יצירת מודלים תלת-ממדיים של רקמת לב, שכפול לצורך פרמקולוגיה וטוקסיקולוגיה חזויות, ופיתוח של טיפולים מודרכים לתאים ולגנום.

creation-cardiac-tissue-exhibiting-mechanical-integration-spheroids

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

הדור של רקמת שריר לב מיושר הוא דרישת מפתח להתאמת ההתקדמות בביולוגיה של תאי גזע למטרות שימושיות מבחינה קלינית. להלן נתאר גישת הדפסת microcontact לשליטה המדויקת של צורת תא ותפקודו. שימוש באוכלוסיות מטוהרות מאוד של תאי גזע עובריים מופקים אבות לב, אז אנחנו מייצרים רקמת שריר לב מתפקד איזוטרופי.

דור של רקמות שריר לב פונקציונליות מזדהות באמצעות הדפסת microcontact

אנו מספקים פרוטוקול מוכללת המבוסס על אסטרטגיה bioprinting microfluidic הנדסה מיטה microfibrous בכלי הדם, שבו סוג התא משני יכול להיות עוד יותר נזרע לתוך מרחב ביניים של מבנה זה microfibrous ליצירת רקמות vascularized ו- organoids.

Vascularized Microfluidic Bioprinting עבור הנדסת רקמות, Organoids

פרוטוקול זה מתאר שיטה מבוססת-עובש נטו ליצירת רקמות לגרדום ללא לב תלת מימדי עם המבנית משביע רצון והתנהגות מכות סינכרוני.

שיטה המבוססת על עובש נטו הבריאה ברקמת הלב לגרדום ללא תלת מימדי

פרוטוקול זה נועד להשתיל תיקון ביו-מודפס בתלת-ממד על האפיקארדיום של עכברים אוטמים המדגמים אי ספיקת לב. הוא כולל פרטים לגבי הרדמה, פתיחת החזה הכירורגית, קשירה קבועה של העורק הקדמי השמאלי (LAD) העורק הכלילי ויישום של תיקון bioprinted על האזור האוטם של הלב.

השתלה של תיקון ביו-מודפס בתלת מיתד במודל מורין של אוטם שריר הלב

כאן, אנו מתארים מתודולוגיה קלה לשימוש כדי ליצור מערכי מיקרוטיסו לבביים תלת-ממדיים בהרכבה עצמית המורכבים מקרדיומיוציטים פלואוריפוטנטיים מובחנים מראש המושרים על ידי בני אדם, קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע, פיברובלסטים לבביים ותאי אנדותל. תא זה ידידותי למשתמש ונמוך הדורש טכניקה כדי ליצור microtissues לב ניתן ליישם עבור מידול מחלות ושלבים מוקדמים של פיתוח תרופות.

ייצור מערכי מיקרוטיסו לב תלת-ממדיים באמצעות קרדיומיוציטים אנושיים שמקורם ב-IPSC, פיברובלסטים לבביים ותאי אנדותל

פרוטוקול זה נועד להמציא כדורי לב תלת-מיוד (CSs) על-ידי שיתוף תאים בטיפות תלויות. CSs משובץ קולגן מטופלים עם דוקסוקובין (DOX, סוכן קרדיוקסי) בריכוזים פיזיולוגיים כדי מודל אי ספיקת לב. במבחנה בדיקות באמצעות CSS שטופלו DOX עשוי לשמש כדי לזהות טיפולים חדשניים עבור חולי אי ספיקת לב.

ספרואידים לב כמו במבחנה ביו מהונדסת רקמות לב לחקור פתופיזיולוגיה לב אנושי

מטרת פרוטוקול זה היא להסביר ולהדגים את התפתחותו של מודל מיקרופלואידי תלת מימדי (3D) של רקמת לב אנושית מיושרת מאוד, המורכבת מקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע במשותף עם פיברובלסטים לבביים (CFs) בתוך הידרוג'ל ביומימטי, מבוסס קולגן, ליישומים בהנדסת רקמת לב, הקרנת תרופות ומידול מחלות.

פיתוח רקמת לב אנושית מאורגנת תלת מימדית בתוך פלטפורמה מיקרופלואידית

כאן, אנו מתארים את הייצור בקנה מידה גדול של כדוריות סטרומליות/תאי גזע שמקורן בשומן (ASC) באמצעות מערכת פיפטינג אוטומטית כדי לזרוע את תרחיף התא, ובכך להבטיח הומוגניות של גודל וצורת ספרואידים. כדורי ASC אלה יכולים לשמש כאבני בניין לגישות הדפסה ביולוגית תלת-ממדית.

ייצור אוטומטי בקנה מידה גדול של כדורי תאי גזע שמקורם בשומן להדפסה ביולוגית תלת-ממדית

מוצגת כאן סדרה של פרוטוקולים ליצירה ושימור בהקפאה של ספרואידים לבביים (CSs) מקרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם שמקורם בתאי גזע בתרבית בפורמט רב-ממדי בעל תפוקה גבוהה. מודל תלת מימדי זה מתפקד כפלטפורמה חזקה למידול מחלות, הקרנות בתפוקה גבוהה, ושומר על הפונקציונליות שלו לאחר שימור בהקפאה.

ייצור, סינון בתפוקה גבוהה וביו-בנקאות של ספרואידים לבביים פלוריפוטנטיים שמקורם בתאי גזע המושרים על ידי בני אדם

רקמות לב תלת-ממדיות שהונדסו ביולוגית באמצעות קרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע התגלו כמודלים מבטיחים לחקר שריר הלב האנושי הבריא והחולה במבחנה תוך שחזור היבטים מרכזיים של נישת הלב הטבעית. כתב יד זה מתאר פרוטוקול לייצור וניתוח רקמות לב מהונדסות בעלות תוכן גבוה שנוצרו מקרדיומיוציטים פלוריפוטנטיים המושרים על ידי תאי גזע המושרים על ידי בני אדם.

תכנון ביוריאקטור לשיפור איסוף הנתונים והפקת מודלים של רקמות לב מהונדסות

מוצגת שיטה הניתנת לשחזור ליצירת רקמות שריר הלב תלת מימדיות המשלבות כתיבה אלקטרו-ספינינג נמס (MEW), פיגומי פוליקפרולקטון (PCL) והידרוג'לים פיברין עם קרדיומיוציטים ופיברובלסטים שמקורם ב-hiPSC. טכניקה זו מציעה שליטה מדויקת על ארכיטקטורת הפיגומים וניתן ליישם אותה בבדיקות תרופות פרה-קליניות ובמודלים של מחלות לב.

יצירת רקמת שריר הלב האנושית בתלת מימד באמצעות כתיבה אלקטרו-ספינינג נמס של פיגומי פוליקפרולקטון ותאי לב שמקורם ב-hiPSC

למדו הדפסה תלת-ממדית של רקמת לב ללא חומרים ביולוגיים תוך שימוש בספרואידים תאיים בלבד. השיטה מדגימה אינטגרציה מכנית ומציעה פוטנציאל לרפואה רגנרטיבית ולמחקר מחלות לב.

יצירת רקמת הלב מציגה שילוב מכני של Spheroids באמצעות 3D Bioprinting

גלה סרטונים נוספים