בידוד, אפיון, טיהור של מקרופאגים רקמות מושפעות על ידי דלקת הקשורות להשמנת יתר

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד ולאפיין ביעילות מקרופאגים מרקמות המושפעות בדרך כלל מדלקת הנגרמת על ידי דיאטה כמו הכבד. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחומי האימונולוגיה והדלקת לגבי האופן שבו פנוטיפ מקרופאגים תושב רקמה יכול להכתיב את התקדמותן של מחלות דלקתיות כרוניות. היתרון העיקרי בכך הוא שההליך מייעל את שלבי הבידוד הדרושים להשגת תרחיפים חד-תאיים שמקורם ברקמות המושפעות מדלקת כרונית בדרגה נמוכה בתיווך השמנת יתר.

תדגים את ההליך ג'וסלין אלן, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי לבודד את הכבד, הניחו תחילה עכבר ספוג אתנול במצב שכיבה על לוח חיתוך קצף פוליסטירן ואבטחו את הכפות הקדמיות והאחוריות. לאחר מכן, השתמש במלקחיים עם קצה בינוני כדי לתפוס את עור הבטן ליד פתח השופכה והשתמש במספריים חדים כדי ליצור חתך קטן בעור המורם.

הכנס את הלהב התחתון של המספריים לתוך החתך שבין העור לצפק ובצע חתך רוחבי מהמפשעה ועד הסנטר. משוך בעדינות את העור לאחור כדי לחשוף את חלל הצפק ודופן בית החזה השלמים ולבצע חתך רוחבי דרך הצפק. הרם את עצם החזה וחתך בזהירות את הסרעפת.

לאחר מכן הזיזו את איברי מערכת העיכול הצידה ואתרו את הווריד הנבוב התחתון התת-כבדי או IVC. בעזרת מלקחיים המוסטטיים, מהדקים את ה-IVC העל-הפטי כדי לשמור על זלוף מקומי ומחברים מזרק מלא במאגר זלוף שחומם מראש לערכת איסוף ועירוי דם בגודל 23. לחץ בעדינות על הבוכנה עד שהצינור והמחט מתמלאים במאגר זלוף והכנס את המחט במקביל ל- IVC התת-כבדי.

קנולציה נכונה של ה- IVC מבטיחה כי מאגר הדיסוציאציה מפוזר באופן מקומי בכל הכבד והרקמות ההיקפיות ומייעל את עיכול הרקמות. השתמש ב-clamp המוסטטי של ארבעה סנטימטרים כדי להדק את המחט במקומה ולחץ בעדינות על הבוכנה כדי להתחיל את הזילוף. אם המחט ממוקמת כראוי, הצבע ישטוף במהירות מהכבד והאונות יוגדלו.

חתוך מיד את וריד הפורטל כדי לאפשר למאגר הזלוף לזרום בחופשיות דרך הכבד, ומדי פעם לעסות בעדינות את האונות בין האגודל לאצבע המורה כדי להקל על הסרת הדם. כאשר נותרו רק חמישה מיליליטר של מאגר זלוף, החלף את מזרק מאגר הזלוף במזרק מלא במאגר דיסוציאציה שחומם מראש, והמשיך לעסות בעדינות את האונות ולחלחל את הכבד עד שהוא מתעכל במלואו. אשר עיכול מוצלח על ידי לחיצה עדינה על הקצה הקהה של זוג מלקחיים לתוך האונה הצדדית השמאלית.

על פני השטח אמורה להופיע שקע שמתמלא לאט לאט לאחר הסרת המלקחיים. לאחר מכן הסר את המחט והשתמש בלהב ישר קצר מזוג מספריים מנתחים כדי לחתוך בזהירות את הרצועות המחברות כדי לכרות את כל הכבד וכיס המרה. העבירו את הכבד לצלחת של 10 ס"מ המכילה 10 מיליליטר DMEM קר כקרח והשתמשו במלקחיים עם שיניים כדי לאחוז ב-IVC העל-הפטי הקטוע.

בעזרת מלקחיים נקודתיים בינוניים, הפעל תנועת ליטוף מהירה על כל אונה כדי לשחרר את התאים מהקפסולה של גליסון ולהעביר את ה-DMEM הרווי דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר בצינור חרוטי של 50 מיליליטר על קרח. ניתן להשיג תפוקות גבוהות של תאים ברי קיימא רק על ידי ניתוק נכון של תאי הכבד מהקפסולת של גליסון. כאשר כל התאים נאספו, הפוך את הצינור כדי לערבב בעדינות את תרחיף התאים ולגלול את התאים על ידי צנטריפוגה.

העבירו את הסופרנטנט לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר לשלוש צנטריפוגות נוספות בעלות ספין נמוך. לאחר הצנטריפוגה האחרונה, העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 50 מיליליטר וצנטריפוגה את התאים פעם נוספת במהירות גבוהה יותר. לאחר מכן השעו מחדש את גלולת התאים הלא פרנכימלית במאגר FACS לספירה ודיללו את תאי הכבד לריכוז המתאים בהתאם ליישום שלהם במורד הזרם בצינורות פוליסטירן תחתונים עגולים של חמישה מיליליטר

עכברים הניזונים מתזונה עתירת שומן או דיאטה עתירת שומן ועתירת כולסטרול מציגים חדירה מוגברת של מקרופאגים M1 המופעלים באופן קלאסי ברקמות הפגועות כגון אבי העורקים. קולטן RON המבטא מקרופאגים חיוביים ל-CD45 חיוביים באבי העורקים F4/80 המדגימים פנוטיפ אנטי דלקתי מופחתים בעכברים שניזונו מתזונה עתירת שומן ואילו מקרופאגים חיוביים ל-CD45 חיוביים ל-CD45 חיוביים ל-CD45 חיוביים ל-CD11c נמצאים במספרים מוגברים באבי העורקים שבודדו מבעלי חיים אלה. יתר על כן, קולטן RON ממוין המבטא מקרופאגים שמקורם באבי העורקים המעוכלים מציגים ביטוי מוגבר של גן Arginase 1, סמן מקרופאגים M2 מבוסס היטב.

ואכן, האפיון של מקרופאגים השוכנים בכבד חושף את הפנוטיפ הרווח של קולטני RON המבטאים תת-אוכלוסיות עם אוכלוסיות מקרופאגים פרו-דלקתיות חיוביות CD11c המדגימות ביטוי מופחת של גנים הקשורים מאוד לפנוטיפ M2 אנטי דלקתי. מגמות דומות נצפות באוכלוסיות המקרופאגים המבודדות מרקמת שומן לבנה מעוכלת עם אוכלוסיות מקרופאגים פנוטיפיות פרו-דלקתיות המציגות ירידה בביטוי פני השטח של קולטן RON. לאחר שליטה, ניתן להשלים טכניקה זו תוך 20 עד 30 דקות לכל בעל חיים אם היא מבוצעת כראוי.

לאחר הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון ציטומטריית זרימה, מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנט ו/או PCR כמותי כדי לאפיין עוד יותר את הפנוטיפ של המקרופאגים המבודדים השוכנים ברקמות שמקורן בכבד. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להבין היטב כיצד לבודד כראוי מקרופאגים השוכנים ברקמות מכבדים חולים. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.