בידוד, אפיון, טיהור של מקרופאגים רקמות מושפעות על ידי דלקת הקשורות להשמנת יתר
3 באפריל 2017
פרוטוקול זה מאפשר חוקר לבודד ולאפיין רקמות תושב מקרופאגים שונות הולמרק רקמות מודלק שחולצו מן הדיאטה-induced מודלים של הפרעות מטבוליות.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לבודד ולאפיין ביעילות מקרופאגים מרקמות המושפעות בדרך כלל מדלקת המושרית על ידי תזונה, כגון הכבד. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחומי האימונולוגיה והדלקת בנוגע לאופן שבו הפנוטיפ של מקרופאגים תלויי-רקמה יכול להכתיב את התקדמותן של מחלות דלקתיות כרוניות. היתרון המרכזי בכך הוא שהפרוצדורה מייעלת את שלבי הבידוד הדרושים להשגת תרחיפי תאים בודדים המופקים מרקמות המושפעות מדלקת כרונית נמוכה המתווכת על ידי השמנה.
את הפרוצדורה תדגים ג'וסלין אלן, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי לבודד את הכבד, ראשית הניחו עכבר שהורדם באתנול במנח גב (supine) על לוח ניתוח מקצף פוליסטירן וקבעו את הכפות הקדמיות והאחוריות. לאחר מכן, השתמשו בפינצטה בעלת חוד בינוני כדי לתפוס את עור הבטן ליד פתח הש尿etra (שופכה) והשתמשו במספרי ניתוח חדים כדי לבצע חתך קטן בעור המורם.
החדירו את הלהב התחתון של המספריים לתוך החתך שבין העור לבין הפריטונאום ובצעו חתך רוחבי מהמפשעה ועד לסנטר. משכו בעדינות את העור לאחור כדי לחשוף את חלל הפריטונאום השלם ואת דופן בית החזה, ובצעו חתך רוחבי דרך הפריטונאום. הרימו את העצם הסטרנום וחתכו בזהירות את הסרעפת.
לאחר מכן, הזיזו את איברי מערכת העיכול הצידה ואתרו את הווריד הרחב התחתון התת-כבדי (subhepatic inferior vena cava או IVC). בעזרת פינצטות המוסטטיות, סגרו את ה-IVC העל-כבדי (suprahepatic IVC) כדי לשמור על פרפוזיה מקומית, וחברו מזרק מלא במסיינא פרפוזיה שחומם מראש למערכת איסוף והזרקת דם בעלת מחט בכילוי 23.
קניולציה נכונה של ה-IVC מבטיחה שסבב הדיסוציאציה יופץ באופן מקומי בכל הכבד והרקמות ההיקפיות, ובכך יאופטימי את עיכול הרקמה. השתמשו בתסמיך המוסטטי באורך ארבעה סנטימטרים כדי לקבע את המחט במקומה, ולחצו בעדינות על הבוכנה כדי להתחיל את הפרפוזיה. אם המחט ממוקמת כראוי, הצבע יישטף במהירות מהכבד והאונויות יתרחבו.
חתכו מיד את וריד השער (portal vein) כדי לאפשר לתמיסת הפרופוזיה לזרום בחופשיות דרך הכבד, תוך עיסוי עדין מדי פעם של האונות בין האגודל והאצבע כדי להקל על הוצאת הדם. כאשר נותרו חמישה מיליליטרים בלבד של תמיסת הפרופוזיה, החליפו את מזרק תמיסת הפרופוזיה במזרק מלא בתמיסת דיסוציאציה שחוממה מראש, והמשיכו לעסות בעדינות את האונות ולבצע פרופוזיה לכבד עד לעיכולו המלא. ודאו כי העיכול הצליח על ידי לחיצה עדינה של הקצה הקהה של פינצטה אל תוך האונה השמאלית הלטראלית.
על פני השטח צריכה להופיע שקע שיתמלא לאט לאחר הסרת הפינצטה. לאחר מכן, הוצא את המחט והשתמש בלהב קצר וישר של מספרי דיסקציה כדי לחתוך בזהירות את הרצועות המחברות, לצורך כריתה של הכבד כולו ושל כיס המרה. העבר את הכבד לצלחון של 10 centimeter המכיל 10 milliliters של DMEM קר מאוד, והשתמש בפינצטה משננת כדי לתפוס את ה-IVC הסופרה-הפאטי החתוך.
באמצעות פינצטה בינונית, בצעו תנועות גריפה מהירות בכל אונה כדי לשחרר את התאים מקפסולת גליסון (Glisson's Capsule), והעבירו את ה-DMEM הרווי דרך מסנן תאים של 70 מיקרומטר אל תוך מבחנה קונית של 50 מיליליטר על קרח. ניתן להשיג תתי-יבולים גבוהים של תאים חיוניים רק על ידי דיסוציאציה נכונה של תאי הכבד מקפסולת גליסון. לאחר איסוף כל התאים, הפכו את המבחנה כדי לערבב בעדינות את סספנסיית התאים והשקיעו את התאים באמצעות סנטריפוגציה.
העבירו את העילוי למבחנה קונית חדשה של 50 מיליליטר עבור שלוש סבבים נוספים של סבב צנטריפוגה במהירות נמוכה. לאחר הסבב האחרון, העבירו את העילוי למבחנה חדשה של 50 מיליליטר וסבבו את התאים פעם אחת נוספת במהירות גבוהה יותר. לאחר מכן, השעיקו מחדש את משקע התאים הלא-פארנכימליים בבופר FACS לצורך ספירה, ודללו את תאי הכבד לריכוז המתאים בהתאם ליישום ההמשכי שלהם במבחנות פוליסטירן בעלות תחתית עגולה של חמישה מיליליטרים מסומנות.
עכברים שהוזנו בתזונה עשירה בשומן או בתזונה עשירה בשומן ובכולסטרון מראים חדירה מוגברת של מקרופאגים M1 מופעלים קלאסיים ברקמות שנפגעו, כגון באורטה. מקרופאגים ב-אורטה החיוביים ל-CD45 ו-F4/80 המבטאים את הקולטן RON, המדגימים פנוטיפ אנטי-דלקתי, מופיעים בכמות מופחתת בעכברים שהוזנו בתזונה עשירה בשומן ובכולסטרון, בעוד שמקרופאגים פרו-דלקתיים החיוביים ל-CD45, F4/80 ו-CD11c נמצאים במספרים מוגברים באורטות שבודדו מבעלי חיים אלו. יתרה מכך, מקרופאגים המבטאים את הקולטן RON שמומנו מאורטות שעברו עיכול, מראים ביטוי מוגבר של הגן Arginase 1, המהווה סמן מוכר של מקרופאגי M2.
ואכן, אפיון של מקרופאגים השוכנים בכבד חושף פנוטיפ דומיננטי של תתי-אוכלוסיות המבטאות את הקולטן RON, עם אוכלוסיות מקרופאגים פרו-דלקתיים חיוביים ל-CD11c המראות ביטוי מופחת של גנים הקשורים באופן חזק לפנוטיפ M2 אנטי-דלקתי. מגמות דומות נצפו באוכלוסיות מקרופאגים שבודדו מרקמת שומן לבנה שעברה עיכול, כאשר אוכלוסיות מקרופאגים בעלות פנוטיפ פרו-דלקתי הראו ביטוי משטחי מופחת של הקולטן RON. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו ב-20 עד 30 דקות לבעל חיים, במידה והיא מבוצעת כהלכה.
בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות כגון ציטומטריה זרימה (flow cytometry), מיון תאים מופעל פלואורסצנציה (fluorescent-activated cell sorting), ו/או qPCR כמותי כדי לאפיין באופן מעמיק יותר את הפנוטיפ של המקרופאגים התושבים ברקמה שהופקו מהכבד. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן הנכון לבידוד מקרופאגים תושבי רקמה מכבדים חולים. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לבודד ולאפיין מקפגים תומכי רקמה (tissue-resident macrophages) מרקמות דלקתיות המושפעות מהפרעות מטבוליות המושרות על ידי תזונה. השיטה מתמקדת באופטימיזציה של שלבי הבידוד כדי להשיג תרחיפי תאים בודדים מרקמות המושפעות מדלקת המתווכת על ידי השמנה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- אימונולוגיה
- דלקת
- הפרעות מטבוליות
רקע
- מאקרופגים תלויי-רקמה ממלאים תפקיד מכריע במחלות דלקתיות כרוניות.
- דלקת המושרה על ידי תזונה משפיעה על רקמות שונות, ובמיוחד על הכבד.
- הבנת הפנוטיפים של המאקרופגים יכולה לסייע בגיבוש אסטרטגיות טיפול.
- פרוטוקול זה משפר את היעילות של בידוד מאקרופגים לצורכי מחקר.
מטרת המחקר
- לבידוד ואפיון של מקרופאגים מרקמות דלקתיות.
- לחקירת תפקידם של מקרופאגים בדלקת כרונית.
- לספק שיטה מהימנה להשגת תרחיפי תאים בודדים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד רקמת כבד ממודלים המושרים על ידי תזונה.
- שימוש בעכברים שספגו אתנול להפקת רקמה.
- טכניקות ניתוח להשגת דגימות רקמה.
- אפיון של פנוטיפים של מקרופגים לאחר הבידוד.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של מקרופאגים מרקמות כבד.
- אפיון של פנוטיפים של מקרופאגים הקשורים לדלקת.
- פרוטוקול מותאם לשיפור יעילות בידוד התאים.
- תובנות לגבי תפקידם של מקרופאגים בהפרעות מטבוליות.
מסקנות
- הפרוטוקול יעיל לחקר מקרופאגים השוכנים ברקמה.
- הממצאים תורמים להבנת מחלות דלקתיות כרוניות.
- מחקרים עתידיים יכולים להתבסס על מתודולוגיה זו להשגת תובנות נוספות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הטרוגניות של מקרופאגים בדלקת המונעת מהשמנה היא גורם קריטי הקובע את התקדמות המחלה ואת היעדים הטיפוליים בהפרעות מטבוליות ומסביב לכלי הדם. פרוטוקול זה מאפשר בידוד חסון ואפיון פנוטיפי של מקרופאגים תלויי-רקמה מכבד, אאורטה ורקמת שומן מדלקתים, ובכך תומך בביטחון חיזוי בשלבי הגילוי המוקדמים ובתיקוף מטרות. גישה מהימנה לאוכלוסיות תאי חיסון מאופיינות היטב משפרת את ההמשכיות התרגומית ומפחיתה סיכונים בהשערות מכניסטיות לאורך צינור הגילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה של מסלולים דלקתיים המונחים על ידי מקרופאגים ברקמות הרלוונטיות למחלה.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי הבחנה בין פנוטיפים של מקרופאגים פרו-דלקתיים לאנטי-דלקתיים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים באמצעות ניתוח פנוטיפי כמותי של תתי-אוכלוסיות של תאי חיסון.
- משפר את הביטחון הניבוי עבור מיון תיקי פיתוח באינדיקציות מטבוליות ומטריות-לבביות.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מספק תרחיפי תאים בודדים סטנדרטיים עבור תהליכי עבודה של זרימה ציטומטרית ו-FACS בהמשך.
- מבטיח הדירות ופלט כמותי עבור בדיקות פרופיל של תאי מערכת החיסון.
- מאפשר הכנה ניתנת להרחבה של מערכות ביולוגיות שעברו תיקוף עבור סריקת תרכובות.
- תומך בהערכה אמינה של חומרים אימונומודולטוריים בהקשרים רלוונטיים למחלה.
מחקר תרגומי ופקליני
- מתאימה את פנוטיפ הגויה של מקפגים עם אסטרטגיות של ביומרקרים תרגומיים במודלים של מחלות מטבוליות.
- שומרת על רצף משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני של מטרות חיסוניות.
- מספקת מידע לקבלת החלטות על קידום מותאמות-סיכון על ידי קישור פנוטיפים תאיים להתקדמות המחלה.
- מפחיתה סיכונים במודלים פרה-קליניים על ידי מתן אפשרות לאפיון מדויק של תאי מערכת החיסון.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
פרוטוקול זה משתלב בממשק שבין הגילוי המוקדם למחקר הפרה-קליני, ומאפשר מעבר רציף מבדיקת היפותזות לזיהוי מובילים (lead identification) ותיקוף תרגומי.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בניתוח מונחה-השערות של תפקוד מקרופאגים ברקמות דלקתיות.
- סריקה: מספק מדדים כמותיים הניתנים לשחזור של תאי מערכת החיסון לצורך פיתוח מערכי בדיקה.
- אנליטיקה: מספק נתוני ציטומטריית זרימה וביטוי גנים לצורך ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין פנוטיפים של תאי מערכת החיסון לאסטרטגיות של סמנים ביולוגיים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס זרימת עבודה הניתנת לשימוש חוזר לבידוד תאי מערכת החיסון במודלים של מחלות מטבוליות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות חיסוניות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה וייעול של בידוד תאי מערכת החיסון עבור תהליכי עבודה של מו"פ הניתנים להרחבה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של go/no-go וניהול פורטפוליו יעיל מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים של מועמדים לטיפולים מויהרים של מערכת החיסון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדיסקציה של רקמות, עיכול אנזימטי ואנליזה של ציטומטריה זרימה.
- מחייב גישה למכשור FACS ויכולות PCR כמותי לאפיון המשכי.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי בידוד וצביעה לצורך הדירות (reproducibility).
- ניתן להתאמה לסוגים מרובים של רקמות דלקתיות, כולל כבד, אאורטה ורקמת שומן.
- תלוי בביצוע פתרון בעיות (troubleshooting) קפדני כדי למקסם את תנובת התאים והחיוניות שלהם מרקמות דחוסות או פיברוטיות.
