מבט כולל על ביטוי גנים
ביטוי גנים הוא התהליך שבו מידע הכלול בדנ"א של תא משמש לייצור מוצרים פונקציונליים. הליך זה מתוזמר בקפידה מוסדר במספר שלבים, ו misregulation יכול לעתים קרובות לגרום למחלות כגון סרטן.
סרטון וידאו זה מספק סקירה כללית של ההיסטוריה של מחקר ביטוי גנים, שאלות מפתח, שיטות בתחום וכיצד טכניקות אלה מיושמות.
נתחיל בבדיקת כמה תגליות עיקריות על ביטוי גנים.
המודל המשכנע הראשון לאופן שבו דנ"א עשוי לשאת מידע גנטי הוקם בשנת 1953, כאשר פרנסיס קריק וג'יימס ווטסון, בסיוע הנתונים של רוזלינד פרנקלין, פתרו את מבנה הדנ"א – סליל כפול העשוי משתי שרשראות ליניאריות של בסיסי נוקלאוטיד המסודרים ברצף מוגדר, אך משתנה לאין שיעור.
חמש שנים לאחר מכן, קריק הציע שני רעיונות חשובים שיהוו את עמוד השדרה של הבנתנו את ביטוי הגנים שלנו. "השערת הרצף" שלו הציעה כי רצף הנוקלאוטידים של הדנ"א משמש, באמצעות ביניים RNA לא יציב, כקוד לרצפי חומצות אמינו של חלבונים. יחד עם זאת, "הדוגמה המרכזית" שלו שיערה את זרימות המידע הגנטי השונות שיכולות להתרחש, ובמיוחד, קבעה כי לא ניתן להעביר מידע מחלבון בחזרה לחומצות גרעין.
בשנת 1960 הציעו פרנסואה יעקב וז'אק מונוד – באמצעות עבודתם על גנים מטבוליזם ללקטוז בחיידקים – מודל להסדרת ביטוי הגנים. הם הציעו כי הביטוי של "גנים מבניים", המבצעים פונקציות מבניות או אנזימטיות, נשלט על ידי תוצרים של "גנים רגולטוריים" הנקשרים לאתרי רגולציה סמוכים. כיום אנו יודעים כי מצבים דומים באופן משמעותי של ויסות גנים, בתיווך חלבונים הנקראים גורמי שעתוק, מתרחשים בכל האורגניזמים.
שנה לאחר מכן, בשנת 1961, ג'ייקוב – יחד עם סידני ברנר – גילה את השליח או ה-m-RNA כמתווך הלא יציב בין ה- DNA לחלבונים שהוצעו על ידי קריק. באותה שנה, ברנר וקריק החלו לפצח את "הקוד הגנטי", המכתיב כיצד מידע בדנ"א מקודד חלבונים. הם קבעו כי כל שלישייה של נוקלאוטידים סמוכים, או "קודון", מציינת את אחת מ-20 חומצות האמינו המרכיבות חלבונים.
במהלך השנים הבאות, חוקרים בראשות מרשל נירנברג, הר גובינד חוראנה, וסברו אוצ'ואה השתמשו בגישות מרובות כדי להגדיר את חומצות האמינו המקודדות על ידי כל 64 הקודונים האפשריים. עם פיצוח הקוד הגנטי, מדענים המשיכו לחקור כיצד ביטוי גנים מוסדר.
תגלית גדולה הגיעה בשנת 1974, כאשר רוג'ר קורנברג ועמיתיו הראו כי DNA בתאים אאוקריוטים, כגון אלה של בעלי חיים וצמחים, "עטוף" סביב מתחמים של חלבוני היסטון, מבנים מניבים הנקראים כיום "נוקלאוזומים". כיום אנו יודעים ששינויים במבנה הכרומטין ממלאים תפקידים חשובים בוויסות הגנים.
טוויסט נוסף הגיע בשנת 1977, כאשר פיל שארפ וריץ ' רוברטס גילו כי רצפי mRNA לא היו משלימים לחלוטין לתבניות הדנ"א המתאימות שלהם. "אזורים חסרים" מסוימים, הנקראים כיום אינטרונים, מוסרים בין האקסונים קידוד חלבונים בתעתיק RNA בוגר בתהליך המכונה "splicing". חמש שנים לאחר מכן, קבוצת המחקר של רונלד אוונס הדגימה כי חבור "אלטרנטיבי" של אותו תעתיק יכול לייצר וריאנטים, או "איזופורמים", של אותו חלבון עם פונקציות שונות.
מאז שנות התשעים, הבנתנו את המורכבות של רשתות רגולטוריות גנטיות התרחבה באופן דרמטי עם גילוי של השתקת גנים בתיווך RNA. כיום אנו יודעים כי מספר משפחות שונות של RNAs קטנים, עם חברים כי הם 20−30 נוקלאוטידים בגודל, לווסת ביטוי גנים במגוון דרכים.
לאחר סקירת ההיסטוריה של מחקר ביטוי גנים, בואו נסתכל על כמה שאלות מרכזיות בתחום.
נושא אחד הנחקר הוא האופן שבו גורמי שעתוק מווסתים גנים. מדענים אינם מעוניינים רק בזיהוי הרצפים הגנומיים הכרוכים בגורמי שעתוק, אלא גם בוחנים כיצד חלבונים רגולטוריים מתקשרים זה עם זה כדי לשלב אותות ולווסת את ביטוי הגנים.
חוקרים אחרים חוקרים תפירה חלופית, וכיצד תהליך זה מוסדר בהקשרים ביולוגיים שונים. בנוסף, חלקם מנסים לקבוע אם איזופורמים חלבון תמיד יש פונקציות שונות, ברורות.
לבסוף, חוקרים רבים חוקרים את מנגנון הפעולה של RNAs קטנים, ומנסים לזהות את המטרות הרגולטוריות שלהם. יש גם עניין גובר בשאלה אם RNAs קטנים יכולים לשמש "סמנים ביולוגיים" לאבחון מחלות.
עכשיו, בואו נסתכל על הכלים שחוקרים משתמשים בהם כדי להעריך ביטוי גנים.
שיטה פופולרית היא תמלול הפוך, או "RT"-PCR, הממיר RNA ל- RNA משלים או "c"-DNA לפני שהוא חשוף אותו להגברה. על ידי הכללת מולקולות פלואורסצנטיות המשולבות ב- DNA במהלך PCR, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי למדוד באופן כמותי ביטוי גנים ולבחון את התוצאות "בזמן אמת".
כדי להעריך בו זמנית את הביטוי של אלפי גנים, ניתן להשתמש במיקרו-עראיות. כאן, רצפי DNA "מודפסים" על שקופיות, אשר לאחר מכן היברידית לבדיקות פלואורסצנטיות שנוצרו מרנ"א מדגם. דפוס הפלואורסצנטיות המתקבל יכול לשמש לזיהוי גנים מבוטאים.
טכניקה נוספת לפרופיל ביטוי גנים היא רצף התמלול, או כל RNAs המבוטא בתא. כאן, cDNA שנוצר מדגימות RNA נתון לרצף תפוקה גבוהה. שלא כמו מיקרו-אריות, ריצוף תמלול אינו דורש מידע גנומי קיימים, וניתן להשתמש בו לזיהוי תעתיקים לא ידועים או איזופורמים גנטיים חדשניים.
חוקרים יכולים גם להעריך חזותית היכן גן בא לידי ביטוי באמצעות הכלאה במקום. בטכניקה זו, RNA הוא היברידית ראשונה עם בדיקות משלימות, אשר לאחר מכן ניתן לזהות על ידי נוגדנים מצומדים אנזים המייצרים צבע חזותי או אות פלואורסצנטיות.
בדיקת הכתבים היא טכניקה נוספת שיכולה לספק תובנה על ויסות גנים. מוצר הגן הכתב יוצר אות כגון צבע או פלואורסצנטיות. הכתב אולי התמזג ישירות לגן של עניין, או להיות ממוקם תחת שליטה של רצף רגולטורי, כגון המקדם שמניע את שעתוק הגן, או אלמנט משפר רחוק יותר. אות הכתב יכול לשמש כקריאה לפעילות האלמנט הרגולטורי, או לדפוס הביטוי של גן העניין.
לבסוף, אימונופרציפיטציה כרומטין או "ChIP" יכול לשמש כדי לזהות את האתרים הגנומיים כי גורמי שעתוק להיקשר בעת ויסות ביטוי גנים. כאן, קומפלקסים של חלבונים והדנ"א שהם קושרים מבודדים על ידי נוגדנים, והדנ"א המשמש כמטרה מזוהה על ידי PCR או רצף.
לאחר סקירת השיטות לחקר ביטוי גנים, בואו נסתכל על חלק מהיישומים שלהם.
תאים בתוך אוכלוסייה עשויים להפגין הבדלים עדינים בביטוי גנים שיכולים להיות להם השלכות ביולוגיות. במחקר זה, החוקרים הציבו תאי גזע עובריים אנושיים בודדים מאותה תרבית לבארות נפרדות על צלחת. באמצעות RT-PCR כמותי, מדענים קבעו כי הביטוי של Nanog -תא גזע "סמן" - שונה בתוך מדגם.
חלק מהחוקרים חוקרים אם איזופורמים שונים של חלבונים רגולטוריים מתפקדים אחרת. כאן, ChIP הוחל על תאי מערכת החיסון האנושיים כדי לזהות את המטרות הכרוכות של איזופורמים "ארוכים" ו"קצרים " של חלבון. תוצאות הרצף הראו כי כמה מטרות גנים זוהו רק על ידי isoform קצר, מצביע על הבדלים פונקציונליים פוטנציאליים.
לבסוף, בדיקות עיתונאים יכולות לשמש להערכת רגולציה גנטית בתיווך RNAs קטנים, כגון microRNAs. כמו microRNAs יכול לעכב ביטוי גנים על ידי קשירה לאזורים 3 ¢ של mRNAs, מדענים חיברו אזור זה גנים שונים לכתב לוציפראז, והכניס כל אחד מהם לתאים יחד עם microRNA. מטרות גנים של המיקרו-רנ"א זוהו אז על ידי חיפוש תאים עם אות אור מופחת.
הרגע צפית בהקדמה של ג'וב לביטוי גנים. סקרנו ממצאים עיקריים במחקר ביטוי גנים, שאלות ושיטות בולטות בתחום, וכמה יישומים נוכחיים. כמו תמיד, תודה שצפית!
ביטוי גנים הוא התהליך המורכב שבו תא משתמש במידע הגנטי שלו כדי ליצור מוצרים פונקציונליים. תהליך זה מוסדר בשלבים מרובים, וכל אי התאמה עלולה להוביל למחלו…
ביטוי גנים הוא התהליך שבו מידע הכלול בדנ"א של תא משמש לייצור מוצרים פונקציונליים. הליך זה מתוזמר בקפידה מוסדר במספר שלבים, ו misregulation יכול לעתים קרובות לגרום למחלות כגון סרטן.
סרטון וידאו זה מספק סקירה כללית של ההיסטוריה של מחקר ביטוי גנים, שאלות מפתח, שיטות בתחום וכיצד טכניקות אלה מיושמות.
נתחיל בבדיקת כמה תגליות עיקריות על ביטוי גנים.
המודל המשכנע הראשון לאופן שבו דנ"א עשוי לשאת מידע גנטי הוקם בשנת 1953, כאשר פרנסיס קריק וג'יימס ווטסון, בסיוע הנתונים של רוזלינד פרנקלין, פתרו את מבנה הדנ"א – סליל כפול העשוי משתי שרשראות ליניאריות של בסיסי נוקלאוטיד המסודרים ברצף מוגדר, אך משתנה לאין שיעור.
חמש שנים לאחר מכן, קריק הציע שני רעיונות חשובים שיהוו את עמוד השדרה של הבנתנו את ביטוי הגנים שלנו. "השערת הרצף" שלו הציעה כי רצף הנוקלאוטידים של הדנ"א משמש, באמצעות ביניים RNA לא יציב, כקוד לרצפי חומצות אמינו של חלבונים. יחד עם זאת, "הדוגמה המרכזית" שלו שיערה את זרימות המידע הגנטי השונות שיכולות להתרחש, ובמיוחד, קבעה כי לא ניתן להעביר מידע מחלבון בחזרה לחומצות גרעין.
בשנת 1960 הציעו פרנסואה יעקב וז'אק מונוד – באמצעות עבודתם על גנים מטבוליזם ללקטוז בחיידקים – מודל להסדרת ביטוי הגנים. הם הציעו כי הביטוי של "גנים מבניים", המבצעים פונקציות מבניות או אנזימטיות, נשלט על ידי תוצרים של "גנים רגולטוריים" הנקשרים לאתרי רגולציה סמוכים. כיום אנו יודעים כי מצבים דומים באופן משמעותי של ויסות גנים, בתיווך חלבונים הנקראים גורמי שעתוק, מתרחשים בכל האורגניזמים.
שנה לאחר מכן, בשנת 1961, ג'ייקוב – יחד עם סידני ברנר – גילה את השליח או ה-m-RNA כמתווך הלא יציב בין ה- DNA לחלבונים שהוצעו על ידי קריק. באותה שנה, ברנר וקריק החלו לפצח את "הקוד הגנטי", המכתיב כיצד מידע בדנ"א מקודד חלבונים. הם קבעו כי כל שלישייה של נוקלאוטידים סמוכים, או "קודון", מציינת את אחת מ-20 חומצות האמינו המרכיבות חלבונים.
במהלך השנים הבאות, חוקרים בראשות מרשל נירנברג, הר גובינד חוראנה, וסברו אוצ'ואה השתמשו בגישות מרובות כדי להגדיר את חומצות האמינו המקודדות על ידי כל 64 הקודונים האפשריים. עם פיצוח הקוד הגנטי, מדענים המשיכו לחקור כיצד ביטוי גנים מוסדר.
תגלית גדולה הגיעה בשנת 1974, כאשר רוג'ר קורנברג ועמיתיו הראו כי DNA בתאים אאוקריוטים, כגון אלה של בעלי חיים וצמחים, "עטוף" סביב מתחמים של חלבוני היסטון, מבנים מניבים הנקראים כיום "נוקלאוזומים". כיום אנו יודעים ששינויים במבנה הכרומטין ממלאים תפקידים חשובים בוויסות הגנים.
טוויסט נוסף הגיע בשנת 1977, כאשר פיל שארפ וריץ ' רוברטס גילו כי רצפי mRNA לא היו משלימים לחלוטין לתבניות הדנ"א המתאימות שלהם. "אזורים חסרים" מסוימים, הנקראים כיום אינטרונים, מוסרים בין האקסונים קידוד חלבונים בתעתיק RNA בוגר בתהליך המכונה "splicing". חמש שנים לאחר מכן, קבוצת המחקר של רונלד אוונס הדגימה כי חבור "אלטרנטיבי" של אותו תעתיק יכול לייצר וריאנטים, או "איזופורמים", של אותו חלבון עם פונקציות שונות.
מאז שנות התשעים, הבנתנו את המורכבות של רשתות רגולטוריות גנטיות התרחבה באופן דרמטי עם גילוי של השתקת גנים בתיווך RNA. כיום אנו יודעים כי מספר משפחות שונות של RNAs קטנים, עם חברים כי הם 20−30 נוקלאוטידים בגודל, לווסת ביטוי גנים במגוון דרכים.
לאחר סקירת ההיסטוריה של מחקר ביטוי גנים, בואו נסתכל על כמה שאלות מרכזיות בתחום.
נושא אחד הנחקר הוא האופן שבו גורמי שעתוק מווסתים גנים. מדענים אינם מעוניינים רק בזיהוי הרצפים הגנומיים הכרוכים בגורמי שעתוק, אלא גם בוחנים כיצד חלבונים רגולטוריים מתקשרים זה עם זה כדי לשלב אותות ולווסת את ביטוי הגנים.
חוקרים אחרים חוקרים תפירה חלופית, וכיצד תהליך זה מוסדר בהקשרים ביולוגיים שונים. בנוסף, חלקם מנסים לקבוע אם איזופורמים חלבון תמיד יש פונקציות שונות, ברורות.
לבסוף, חוקרים רבים חוקרים את מנגנון הפעולה של RNAs קטנים, ומנסים לזהות את המטרות הרגולטוריות שלהם. יש גם עניין גובר בשאלה אם RNAs קטנים יכולים לשמש "סמנים ביולוגיים" לאבחון מחלות.
עכשיו, בואו נסתכל על הכלים שחוקרים משתמשים בהם כדי להעריך ביטוי גנים.
שיטה פופולרית היא תמלול הפוך, או "RT"-PCR, הממיר RNA ל- RNA משלים או "c"-DNA לפני שהוא חשוף אותו להגברה. על ידי הכללת מולקולות פלואורסצנטיות המשולבות ב- DNA במהלך PCR, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי למדוד באופן כמותי ביטוי גנים ולבחון את התוצאות "בזמן אמת".
כדי להעריך בו זמנית את הביטוי של אלפי גנים, ניתן להשתמש במיקרו-עראיות. כאן, רצפי DNA "מודפסים" על שקופיות, אשר לאחר מכן היברידית לבדיקות פלואורסצנטיות שנוצרו מרנ"א מדגם. דפוס הפלואורסצנטיות המתקבל יכול לשמש לזיהוי גנים מבוטאים.
טכניקה נוספת לפרופיל ביטוי גנים היא רצף התמלול, או כל RNAs המבוטא בתא. כאן, cDNA שנוצר מדגימות RNA נתון לרצף תפוקה גבוהה. שלא כמו מיקרו-אריות, ריצוף תמלול אינו דורש מידע גנומי קיימים, וניתן להשתמש בו לזיהוי תעתיקים לא ידועים או איזופורמים גנטיים חדשניים.
חוקרים יכולים גם להעריך חזותית היכן גן בא לידי ביטוי באמצעות הכלאה במקום. בטכניקה זו, RNA הוא היברידית ראשונה עם בדיקות משלימות, אשר לאחר מכן ניתן לזהות על ידי נוגדנים מצומדים אנזים המייצרים צבע חזותי או אות פלואורסצנטיות.
בדיקת הכתבים היא טכניקה נוספת שיכולה לספק תובנה על ויסות גנים. מוצר הגן הכתב יוצר אות כגון צבע או פלואורסצנטיות. הכתב אולי התמזג ישירות לגן של עניין, או להיות ממוקם תחת שליטה של רצף רגולטורי, כגון המקדם שמניע את שעתוק הגן, או אלמנט משפר רחוק יותר. אות הכתב יכול לשמש כקריאה לפעילות האלמנט הרגולטורי, או לדפוס הביטוי של גן העניין.
לבסוף, אימונופרציפיטציה כרומטין או "ChIP" יכול לשמש כדי לזהות את האתרים הגנומיים כי גורמי שעתוק להיקשר בעת ויסות ביטוי גנים. כאן, קומפלקסים של חלבונים והדנ"א שהם קושרים מבודדים על ידי נוגדנים, והדנ"א המשמש כמטרה מזוהה על ידי PCR או רצף.
לאחר סקירת השיטות לחקר ביטוי גנים, בואו נסתכל על חלק מהיישומים שלהם.
תאים בתוך אוכלוסייה עשויים להפגין הבדלים עדינים בביטוי גנים שיכולים להיות להם השלכות ביולוגיות. במחקר זה, החוקרים הציבו תאי גזע עובריים אנושיים בודדים מאותה תרבית לבארות נפרדות על צלחת. באמצעות RT-PCR כמותי, מדענים קבעו כי הביטוי של Nanog -תא גזע "סמן" - שונה בתוך מדגם.
חלק מהחוקרים חוקרים אם איזופורמים שונים של חלבונים רגולטוריים מתפקדים אחרת. כאן, ChIP הוחל על תאי מערכת החיסון האנושיים כדי לזהות את המטרות הכרוכות של איזופורמים "ארוכים" ו"קצרים " של חלבון. תוצאות הרצף הראו כי כמה מטרות גנים זוהו רק על ידי isoform קצר, מצביע על הבדלים פונקציונליים פוטנציאליים.
לבסוף, בדיקות עיתונאים יכולות לשמש להערכת רגולציה גנטית בתיווך RNAs קטנים, כגון microRNAs. כמו microRNAs יכול לעכב ביטוי גנים על ידי קשירה לאזורים 3 ¢ של mRNAs, מדענים חיברו אזור זה גנים שונים לכתב לוציפראז, והכניס כל אחד מהם לתאים יחד עם microRNA. מטרות גנים של המיקרו-רנ"א זוהו אז על ידי חיפוש תאים עם אות אור מופחת.
הרגע צפית בהקדמה של ג'וב לביטוי גנים. סקרנו ממצאים עיקריים במחקר ביטוי גנים, שאלות ושיטות בולטות בתחום, וכמה יישומים נוכחיים. כמו תמיד, תודה שצפית!
ביטוי גנים הוא התהליך שבו מידע הכלול בדנ"א של תא משמש לייצור מוצרים פונקציונליים. הליך זה מתוזמר בקפידה מוסדר במספר שלבים, ו misregulation יכול לעתים קרובות לגרום למחלות כגון סרטן.
סרטון וידאו זה מספק סקירה כללית של ההיסטוריה של מחקר ביטוי גנים, שאלות מפתח, שיטות בתחום וכיצד טכניקות אלה מיושמות.
נתחיל בבדיקת כמה תגליות עיקריות על ביטוי גנים.
המודל המשכנע הראשון לאופן שבו דנ"א עשוי לשאת מידע גנטי הוקם בשנת 1953, כאשר פרנסיס קריק וג'יימס ווטסון, בסיוע הנתונים של רוזלינד פרנקלין, פתרו את מבנה הדנ"א – סליל כפול העשוי משתי שרשראות ליניאריות של בסיסי נוקלאוטיד המסודרים ברצף מוגדר, אך משתנה לאין שיעור.
חמש שנים לאחר מכן, קריק הציע שני רעיונות חשובים שיהוו את עמוד השדרה של הבנתנו את ביטוי הגנים שלנו. "השערת הרצף" שלו הציעה כי רצף הנוקלאוטידים של הדנ"א משמש, באמצעות ביניים RNA לא יציב, כקוד לרצפי חומצות אמינו של חלבונים. יחד עם זאת, "הדוגמה המרכזית" שלו שיערה את זרימות המידע הגנטי השונות שיכולות להתרחש, ובמיוחד, קבעה כי לא ניתן להעביר מידע מחלבון בחזרה לחומצות גרעין.
בשנת 1960 הציעו פרנסואה יעקב וז'אק מונוד – באמצעות עבודתם על גנים מטבוליזם ללקטוז בחיידקים – מודל להסדרת ביטוי הגנים. הם הציעו כי הביטוי של "גנים מבניים", המבצעים פונקציות מבניות או אנזימטיות, נשלט על ידי תוצרים של "גנים רגולטוריים" הנקשרים לאתרי רגולציה סמוכים. כיום אנו יודעים כי מצבים דומים באופן משמעותי של ויסות גנים, בתיווך חלבונים הנקראים גורמי שעתוק, מתרחשים בכל האורגניזמים.
שנה לאחר מכן, בשנת 1961, ג'ייקוב – יחד עם סידני ברנר – גילה את השליח או ה-m-RNA כמתווך הלא יציב בין ה- DNA לחלבונים שהוצעו על ידי קריק. באותה שנה, ברנר וקריק החלו לפצח את "הקוד הגנטי", המכתיב כיצד מידע בדנ"א מקודד חלבונים. הם קבעו כי כל שלישייה של נוקלאוטידים סמוכים, או "קודון", מציינת את אחת מ-20 חומצות האמינו המרכיבות חלבונים.
במהלך השנים הבאות, חוקרים בראשות מרשל נירנברג, הר גובינד חוראנה, וסברו אוצ'ואה השתמשו בגישות מרובות כדי להגדיר את חומצות האמינו המקודדות על ידי כל 64 הקודונים האפשריים. עם פיצוח הקוד הגנטי, מדענים המשיכו לחקור כיצד ביטוי גנים מוסדר.
תגלית גדולה הגיעה בשנת 1974, כאשר רוג'ר קורנברג ועמיתיו הראו כי DNA בתאים אאוקריוטים, כגון אלה של בעלי חיים וצמחים, "עטוף" סביב מתחמים של חלבוני היסטון, מבנים מניבים הנקראים כיום "נוקלאוזומים". כיום אנו יודעים ששינויים במבנה הכרומטין ממלאים תפקידים חשובים בוויסות הגנים.
טוויסט נוסף הגיע בשנת 1977, כאשר פיל שארפ וריץ ' רוברטס גילו כי רצפי mRNA לא היו משלימים לחלוטין לתבניות הדנ"א המתאימות שלהם. "אזורים חסרים" מסוימים, הנקראים כיום אינטרונים, מוסרים בין האקסונים קידוד חלבונים בתעתיק RNA בוגר בתהליך המכונה "splicing". חמש שנים לאחר מכן, קבוצת המחקר של רונלד אוונס הדגימה כי חבור "אלטרנטיבי" של אותו תעתיק יכול לייצר וריאנטים, או "איזופורמים", של אותו חלבון עם פונקציות שונות.
מאז שנות התשעים, הבנתנו את המורכבות של רשתות רגולטוריות גנטיות התרחבה באופן דרמטי עם גילוי של השתקת גנים בתיווך RNA. כיום אנו יודעים כי מספר משפחות שונות של RNAs קטנים, עם חברים כי הם 20−30 נוקלאוטידים בגודל, לווסת ביטוי גנים במגוון דרכים.
לאחר סקירת ההיסטוריה של מחקר ביטוי גנים, בואו נסתכל על כמה שאלות מרכזיות בתחום.
נושא אחד הנחקר הוא האופן שבו גורמי שעתוק מווסתים גנים. מדענים אינם מעוניינים רק בזיהוי הרצפים הגנומיים הכרוכים בגורמי שעתוק, אלא גם בוחנים כיצד חלבונים רגולטוריים מתקשרים זה עם זה כדי לשלב אותות ולווסת את ביטוי הגנים.
חוקרים אחרים חוקרים תפירה חלופית, וכיצד תהליך זה מוסדר בהקשרים ביולוגיים שונים. בנוסף, חלקם מנסים לקבוע אם איזופורמים חלבון תמיד יש פונקציות שונות, ברורות.
לבסוף, חוקרים רבים חוקרים את מנגנון הפעולה של RNAs קטנים, ומנסים לזהות את המטרות הרגולטוריות שלהם. יש גם עניין גובר בשאלה אם RNAs קטנים יכולים לשמש "סמנים ביולוגיים" לאבחון מחלות.
עכשיו, בואו נסתכל על הכלים שחוקרים משתמשים בהם כדי להעריך ביטוי גנים.
שיטה פופולרית היא תמלול הפוך, או "RT"-PCR, הממיר RNA ל- RNA משלים או "c"-DNA לפני שהוא חשוף אותו להגברה. על ידי הכללת מולקולות פלואורסצנטיות המשולבות ב- DNA במהלך PCR, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי למדוד באופן כמותי ביטוי גנים ולבחון את התוצאות "בזמן אמת".
כדי להעריך בו זמנית את הביטוי של אלפי גנים, ניתן להשתמש במיקרו-עראיות. כאן, רצפי DNA "מודפסים" על שקופיות, אשר לאחר מכן היברידית לבדיקות פלואורסצנטיות שנוצרו מרנ"א מדגם. דפוס הפלואורסצנטיות המתקבל יכול לשמש לזיהוי גנים מבוטאים.
טכניקה נוספת לפרופיל ביטוי גנים היא רצף התמלול, או כל RNAs המבוטא בתא. כאן, cDNA שנוצר מדגימות RNA נתון לרצף תפוקה גבוהה. שלא כמו מיקרו-אריות, ריצוף תמלול אינו דורש מידע גנומי קיימים, וניתן להשתמש בו לזיהוי תעתיקים לא ידועים או איזופורמים גנטיים חדשניים.
חוקרים יכולים גם להעריך חזותית היכן גן בא לידי ביטוי באמצעות הכלאה במקום. בטכניקה זו, RNA הוא היברידית ראשונה עם בדיקות משלימות, אשר לאחר מכן ניתן לזהות על ידי נוגדנים מצומדים אנזים המייצרים צבע חזותי או אות פלואורסצנטיות.
בדיקת הכתבים היא טכניקה נוספת שיכולה לספק תובנה על ויסות גנים. מוצר הגן הכתב יוצר אות כגון צבע או פלואורסצנטיות. הכתב אולי התמזג ישירות לגן של עניין, או להיות ממוקם תחת שליטה של רצף רגולטורי, כגון המקדם שמניע את שעתוק הגן, או אלמנט משפר רחוק יותר. אות הכתב יכול לשמש כקריאה לפעילות האלמנט הרגולטורי, או לדפוס הביטוי של גן העניין.
לבסוף, אימונופרציפיטציה כרומטין או "ChIP" יכול לשמש כדי לזהות את האתרים הגנומיים כי גורמי שעתוק להיקשר בעת ויסות ביטוי גנים. כאן, קומפלקסים של חלבונים והדנ"א שהם קושרים מבודדים על ידי נוגדנים, והדנ"א המשמש כמטרה מזוהה על ידי PCR או רצף.
לאחר סקירת השיטות לחקר ביטוי גנים, בואו נסתכל על חלק מהיישומים שלהם.
תאים בתוך אוכלוסייה עשויים להפגין הבדלים עדינים בביטוי גנים שיכולים להיות להם השלכות ביולוגיות. במחקר זה, החוקרים הציבו תאי גזע עובריים אנושיים בודדים מאותה תרבית לבארות נפרדות על צלחת. באמצעות RT-PCR כמותי, מדענים קבעו כי הביטוי של Nanog -תא גזע "סמן" - שונה בתוך מדגם.
חלק מהחוקרים חוקרים אם איזופורמים שונים של חלבונים רגולטוריים מתפקדים אחרת. כאן, ChIP הוחל על תאי מערכת החיסון האנושיים כדי לזהות את המטרות הכרוכות של איזופורמים "ארוכים" ו"קצרים " של חלבון. תוצאות הרצף הראו כי כמה מטרות גנים זוהו רק על ידי isoform קצר, מצביע על הבדלים פונקציונליים פוטנציאליים.
לבסוף, בדיקות עיתונאים יכולות לשמש להערכת רגולציה גנטית בתיווך RNAs קטנים, כגון microRNAs. כמו microRNAs יכול לעכב ביטוי גנים על ידי קשירה לאזורים 3 ¢ של mRNAs, מדענים חיברו אזור זה גנים שונים לכתב לוציפראז, והכניס כל אחד מהם לתאים יחד עם microRNA. מטרות גנים של המיקרו-רנ"א זוהו אז על ידי חיפוש תאים עם אות אור מופחת.
הרגע צפית בהקדמה של ג'וב לביטוי גנים. סקרנו ממצאים עיקריים במחקר ביטוי גנים, שאלות ושיטות בולטות בתחום, וכמה יישומים נוכחיים. כמו תמיד, תודה שצפית!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the central dogma of gene expression?
Francis Crick's central dogma hypothesizes the different flows of genetic information that can occur in cells. It holds that information cannot be transferred from protein back to nucleic acids. This principle, established in 1958, forms a backbone of understanding how genetic information flows from DNA through RNA to proteins, establishing the directional nature of genetic information transfer.
Q2: How do transcription factors regulate gene expression?
Transcription factors are regulatory proteins that bind to adjacent regulatory sites to control the expression of structural genes. Scientists investigate how these regulatory proteins interact with one another to integrate signals and regulate gene expression. Understanding transcription factor binding sites and protein interactions helps reveal mechanisms of gene regulation across all organisms.
Q3: What role do introns and exons play in gene expression?
Introns are non-coding sequences removed from RNA transcripts during splicing, while exons are protein-coding regions that remain in mature RNA. Alternative splicing of the same transcript can produce variants called isoforms with different functions. This process, discovered in 1977, adds complexity to how a single gene can generate multiple protein products.
Q4: How does reverse transcription PCR measure gene expression?
Reverse transcription PCR, or RT-PCR, converts RNA into complementary DNA before amplification. By including fluorescent molecules during PCR, researchers can quantitatively measure gene expression and observe results in real-time using detection and quantification of nucleic acids by real time pcr techniques. This method allows scientists to assess expression levels of specific genes in samples.
Q5: What advantages does transcriptome sequencing offer over microarrays?
Transcriptome sequencing sequences all expressed RNAs in a cell by subjecting cDNA to high-throughput sequencing. Unlike microarrays, this technique does not require preexisting genomic information and can identify unknown transcripts or novel gene isoforms. This flexibility makes transcriptome sequencing valuable for discovering new genes and variants.
Q6: How can chromatin immunoprecipitation identify gene regulation sites?
Chromatin immunoprecipitation, or ChIP, isolates protein-DNA complexes using antibodies and identifies target DNA by PCR or sequencing. This technique reveals genomic sites where transcription factors bind when regulating gene expression. ChIP has been applied to study functional differences between protein isoforms and their distinct gene targets.
Q7: How do small RNAs regulate gene expression?
Small RNAs, including families with members 20-30 nucleotides in size, regulate gene expression through multiple mechanisms. MicroRNAs can inhibit gene expression by binding to the 3' untranslated regions of mRNAs. Researchers investigate small RNA mechanisms and identify their regulatory targets to understand gene silencing and explore their potential as biomarkers for disease diagnosis.
Chapters in this video
0:00
Overview
0:39
Historical Highlights
5:02
Key Questions
6:09
Prominent Methods
8:57
Applications
10:38
Summary