Name: המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: חקור דינמיקת מבנה חלבון באמצעות ספקטרומטריית מסה electrospray עם החלפת מימן-דאוטריום בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר שינויים מבניים מהירים בחלבונים מסודרים ובלתי מסודרים לחקירת מחלות נוירודגנרטיביות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה לד"ר מרקוס צווקשטטר על שסיפק את קובץ הקואורדינטות של pdb עבור אנסמבל הטאו ה'ילידי' שנחזה מעבודת התמ"ג שלו, עם כלי ניתוח שנתרמו על ידי ד"ר עדנאן סליוקה. המימון לעבודה זו ניתן על ידי תוכנית המענקים ENGAGE של מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC).

הערה: אנא להתייעץ כל גיליונות נתוני בטיחות חומרים רלוונטיים (MSDS) לפני השימוש. האדים שנוצרים על ידי אבלציה לייזר של פולי (methacrylate מתיל) (PMMA) יכול להיות רעיל. הקפד כי חרט ליזר מחוברת מערכת אוורור תקין. השתמש בכל נהלי הבטיחות המתאימים בעת בניית מכשיר microfluidic כולל השימוש שולט הנדסה (במנדף, במכל חד) וציוד מגן אישי (משקפי בטיחות, מסיכת פנים, כפפות, חלוק מעבדה, מכנסיים באורך מלאים, נעליים סגורות). זה הוא בעל חשיבות עליונה לשימוש כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC) ריאגנטים כיתה במידת האפשר, עם כל היותו של כיתה ACS ומעלה כדי להקטין מזהמים להתערב במהלך הניתוח. 1. הכנת המכשיר microfluidic <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניית פלטפורמת Microfluidic PMMA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג בלוק PMMA סטנדרטי (8.9 x 3.8 x 0.6 ס&quot;מ) לייזר לקטוע ערוץ קלט עבור החדרת חומרים כימיים, A proteoתמס קאמרית, ואת ערוץ הפלט באמצעות חרט לייזר 17, 18. הערה: Etch חדר proteolysis ב צורה סגלגלה מוארכת (30 x 5 x 0.05 מ&quot;מ). ערוץ הקלט והפלט חייב להאריך עד סוף הבלוק PMMA ו להיות יותר מ 75 מיקרומטר בשני רוחב ועומק על מנת להתאים נימי 30 ga. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים נימי מתכת נירוסטה 30 ga לשתי חתיכות של כ 10 ס&quot;מ כל אחת באמצעות כלי סיבובית עם דיסק 1/64&quot; עבה חתוכים. השתמשו בנייר זכוכית כדי להחליק את הקצוות של הנימים (זו ניתן להקל על ידי הצגת תחת מיקרוסקופ אור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את הנימים לתוך פולי חרוט (methacrylate מתיל) לחסום באמצעות מלחם. ערוץ הקלט יחובר משאבות מזרק אוטומטיות, ואת ערוץ הפלט ישמש צימוד לתוך MS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בנייה של זרימה רציפה זמן שנפתרה מיקסר קינטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג התמזגונימי זכוכית סיליקה (ID: 75 מיקרומטר, OD: 150 מיקרומטר) של כ 40 ס&quot;מ, ולהכניס אותו לתוך נימי מתכת נירוסטה 28 ga של כ 15 ס&quot;מ. תלוי בזמן התגובה הנדרשת, להשתמש נימי מתכת חיצוניות כבר או אחד עם מזהה גדול. הערה: קביעת הקוטר הפנימי &quot;האמיתי&quot; של נימי המתכת היא קריטית להשגת זמני תגובה מדויקות. ניתן לעשות זאת על ידי הצמדת נימי המתכת אל HPLC, זורמת ממס למרות הנימים, והקלטת הלחץ בחזרה. Backpressure לחישוב קוטר פנימי יכול להתבצע, ואת הקוטר הפנימי האמיתי של נימי המתכת נקבע. זה יכול להיות מחושב באמצעות תוכנת מחשבון משקל מולקולרי (עבור Windows גרסה 6.49). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפק חריץ 2 מ&quot;מ באמצעות הגדרות חרט חשמל נמוכות ליזר על קצה אחד של נימי זכוכית הפנימיות לאטום בסוף זה של נימי זכוכית הפנימיות (איור 2). לחלופין, לעשות את החריץ באמצעות קַפִּילָאר זכוכית קרמיתכלי חיתוך y או במטחנה סיבובית עם להב חיתוך עדין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קו-עד נימי הזכוכית הפנימיות עם תום נימי המתכת (זה יכול להיות בהנחייתם הצפייה במיקרוסקופ אור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף מערבל הקינטית הזאת לקצה אחד של טי ערבוב (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף נימי זכוכית סיליקה התמזגו (ID: 75 מיקרומטר, OD: 150 מיקרומטר) של כ 40 ס&quot;מ עד הסוף השני של מערבל הקינטית על טי ערבוב. זה משמש כדי לספק חומצה (חומצה אצטית 5%, pH 2.4) כדי להרוות את התגובה. הערה: שמגיבים שסופקו המכשיר עם מזרקים-הדוק גז דרך צינור polytetrafluoroethylene (PTFE) באמצעות משאבות אינפוזיה אוטומטיות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלת פפסין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תשקלי 20 מ&quot;ג של פפסין מן רירית הקיבה החזיריות להשעות אותו 1 מ&quot;ל של חיץ צימוד (0.1 M פוספט נתרן, 0.15 M NaCl, pH 6.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תשקול 50 מ&quot;ג של -hydroxysuccinimide N (NHS) חרוזי agarose -activated, להוסיף מחדש שלפרוטאז uspended ולסובב בעדינות לילה בשעה 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה XG ב 1000 עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את שרף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב פרוטאז המאוגד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה agarose ב 1 מ&quot;ל של חיץ חסימת (1 M Tris-HCl, pH 6.0) ולסובב בעדינות בטמפרטורת החדר למשך 1 שעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה XG ב 1000 עבור 2 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את שרף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את חיץ החסימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה agarose-פפסין עם חומצה אצטית 1 מ&quot;ל של 5%, pH 2.4 עבור 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין למטה XG ב 1000 עבור 2 דקות כדי לאסוף את השרף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 1.3.8 - 1.3.10 עבור סכום כולל של שלושה שוטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את החרוזים 1 חומצה אצטית מ&quot;ל ב 4 ° C לשימוש לטווח ארוך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצרת Device <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים את החדר proteolysis עם תרחיף של חרוזים פפסין-agarose מופעל 5% חומצה אצטית בעזרת מרית סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את platfor microfluidic PMMAמ &#39;בין שני רחובות PMMA ריק ככיסוי לאטום את המכשיר, מרופדת גומי סיליקון כדי ליצור חותם חזק נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בצלחות הידוק מתכתית ללחץ-החותם את המכשיר. הערה: מהדק נעשה מנהג כדי להתאים את הפלטפורמה microfluidic והוא מורכב משני לוחות מדידת 10.1 ס&quot;מ x 7.4 ס&quot;מ x 1.2 ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרימת 5% חומצה אצטית, pH 2.4 בשיעור של 10 μL / דקה. זרימה חיץ אמוניום אצטט 50 מ&quot;מ (pH 6.9) על פי קו חלבון בשיעור של 1 μL / דקה. הערה: חשוב מאוד כי חומצה אצטית זורם ברציפות באמצעות המכשיר ברחבי מכלול הניסוי. ודא שאין דליפות וכי הנוזל הוא יציאה רק מערוץ הפלט, אשר ישמש כמקור ESI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זוג המכשיר עד הסוף מול quadrupole שונה פעם של הטיסה (Q-TOF) ספקטרומטר מסה באמצעות במה מבודדת מתכווננת כדי להשיג תנאים מיטביים electrospray. הערה: מעקף מתגהוא הציג על מנת לדמות את נוכחותו של מקור ESI מסחרי. 17 </li></ol></li></ol> Exchange electrospray יינון מימן-דאוטריום 2. זמן נפתרה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת פפסין וחלבון רק ספקטרה הערה: רכישה ESI-MS מתבצעת במצב יון חיובי עם מתח של 4500 כדי 5000, 60-V פוטנציאל declustering, ו 250-V התמקדות פוטנציאל. ספקטרה נרכש על פני טווח של 350-1,500 מ &#39;/ z עם קצב סריקה של 1 s -1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכש את הספקטרום רק פפסין. כל פסגות המופיעים בספקטרום זה מופחתים פעם החלבון מתווסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הציגו 50-100 מיקרומטר טאו / phospho-טאו חלבון (לטהר ולהכין כפי שתואר לעיל 13, 19) בשיעור של 1 μL / דקה שבה חיץ אמוניום אצטט 50 מ&quot;מ זרמה בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת חלבון ספקטרום בלבד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> o רכישהנקודות ו זמן <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד 100 מיקרומטר טאו / phospho-טאו חלבון זורם על 1 μL / דקה, להציג D 2 O בשיעור של 3 μL / min באמצעות מחבר טי ולאפשר להגיב במיקסר הקינטית. אפשר שהמערכת לאזן במשך לפחות 10 דקות לפני הרכישה של הספקטרום. הערה: לאחר חילופי, התגובה תיוג הוא הרווה ידי זרימת חומצה אצטית pH 2.4 ב 10 μL / min ועיכול של חלבון הנקרא מתרחשת בתא פרוטאוליטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להגדיל את זמן התיוג, ידני למשוך בחזרה את המיקום של נימי זכוכית הפנימיות כדי להשיג ערבוב זמנים של 42 מילים-שניות כדי 8 ים. אפשר שהמערכת לאזן במשך דקות 10 לפחות בין כל גב משיכה. </li></ol></li></ol> 3. נתונים וניתוח סטטיסטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי פפטידים חישוב אחוז דאוטריום Exchange <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעו MS ספקטרום מנתח באמצעות תוכנת mMass, גרסה 5.5.0 20 </sup&gt;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהוי פפטידים באמצעות שרת proteomic ExPASy FindPept ולאשר ידי (CID) דיסוציאציה המושרה-התנגשות כאשר נדרש 21. הערה: הנה, התאגדות ספיגה דאוטריום נמדדה באמצעות תוכנת FORTRAN פתחה בתוך הבית לניתוח חלוקת איזוטופי 22, 23. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את השיעורים התיאורטי מהותיים המבוססים על הרצף הראשוני באמצעות כלי האינטרנט SPHERE 22, 24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הנתונים באמצעות רגרסיה לא לינארית יחיד מעריכים לנרמל באמצעות גרפים ותוכנות סטטיסטיות (למשל, SigmaPlot). הערה: היחס של k int / k OBS מניב את מקדם ההגנה (PF), מדד חצי כמותית של המידה כי באזור מסוים הוא מובנית בתוך אנסמבל קונפורמציה. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Sapienza, P. J., Lee, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+NMR+to+study+fast+dynamics+in+proteins%3A+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Using NMR to study fast dynamics in proteins: methods and applications.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 10, 723-730 (2010).</li>
<li>Neira, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+as+a+tool+to+identify+and+characterize+protein+folding+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">NMR as a tool to identify and characterize protein folding intermediates.</a> Arch. Biochem. Biophys. 531, 90-99 (2013).</li>
<li>Xu, A., Li, F., Robinson, H., Yeung, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+protein+conformers+be+fractionated+by+crystallization%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Can protein conformers be fractionated by crystallization?</a> Anal. Chem. 85, 6372-6377 (2013).</li>
<li>Keedy, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+conformational+landscape+of+a+dynamic+enzyme+by+multitemperature+and+XFEL+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography.</a> eLife. 4, e07574(2015).</li>
<li>Englander, S. W., Sosnick, T. R., Englander, J. J., Mayne, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+uses+of+hydrogen+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and uses of hydrogen exchange.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 6, 18-23 (1996).</li>
<li>Engen, J. R., Smith, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+protein+structure+and+dynamics+by+hydrogen+exchange+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Investigating protein structure and dynamics by hydrogen exchange MS.</a> Anal. Chem. 73, 256A-265A (2001).</li>
<li>Hoofnagle, A. N., Resing, K. A., Ahn, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+analysis+by+hydrogen+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biomol.+Struct%22%5BJournal%5D)">Protein analysis by hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 (2003).</li>
<li>Wilson, D. J., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Capillary+Mixer+with+Adjustable+Reaction+Chamber+Volume+for+Millisecond+Time-Resolved+Studies+by+Electrospray+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">A Capillary Mixer with Adjustable Reaction Chamber Volume for Millisecond Time-Resolved Studies by Electrospray Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 75, 6408-6414 (2003).</li>
<li>Wales, T. E., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+exchange+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom.+Rev%22%5BJournal%5D)">Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics.</a> Mass Spectrom. Rev. 25, 158-170 (2006).</li>
<li>Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+exchange+mass+spectrometry+for+studying+protein+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics.</a> Chem. Soc. Rev. 40, 1224-1234 (2011).</li>
<li>Morgan, C. R., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+solution-phase+protein+structure+and+dynamics+by+hydrogen+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Investigating solution-phase protein structure and dynamics by hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 17, Unit 17.6.1-Unit 17.6.17 (2009).</li>
<li>Katta, V., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+changes+in+proteins+probed+by+hydrogen-exchange+electrospray-ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom.+RCM%22%5BJournal%5D)">Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. RCM. 5, 214-217 (1991).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperphosphorylation+of+intrinsically+disordered+tau+protein+induces+an+amyloidogenic+shift+in+its+conformational+ensemble%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Hyperphosphorylation of intrinsically disordered tau protein induces an amyloidogenic shift in its conformational ensemble.</a> PloS One. 10, e0120416(2015).</li>
<li>Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HDX-MS+and+deletion+analysis+of+the+type+4+secretion+system+protein+TraF+from+the+Escherichia+coli+F+plasmid%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid.</a> FEBS Lett. 590, 376-386 (2016).</li>
<li>Hilser, V. J., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+calculation+of+the+equilibrium+folding+pathway+of+proteins.+Correlation+with+hydrogen+exchange+protection+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structure-based calculation of the equilibrium folding pathway of proteins. Correlation with hydrogen exchange protection factors.</a> J. Mol. Biol. 262, 756-772 (1996).</li>
<li>Liu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Assessment+of+Protein+Structural+Models+by+Comparison+of+H%2FD+Exchange+MS+Data+with+Exchange+Behavior+Accurately+Predicted+by+DXCOREX%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Quantitative Assessment of Protein Structural Models by Comparison of H/D Exchange MS Data with Exchange Behavior Accurately Predicted by DXCOREX.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23, 43-56 (2012).</li>
<li>Rob, T., Wilson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+microfluidic+chip+for+millisecond+time-scale+kinetic+studies+by+electrospray+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">A versatile microfluidic chip for millisecond time-scale kinetic studies by electrospray mass spectrometry.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 124-130 (2009).</li>
<li>Liuni, P., Rob, T., Wilson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+reactor+for+rapid%2C+low-pressure+proteolysis+with+on-chip+electrospray+ionization%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">A microfluidic reactor for rapid, low-pressure proteolysis with on-chip electrospray ionization.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 315-320 (2010).</li>
<li>Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+tau+protein+and+preparation+of+Alzheimer-paired+helical+filaments+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol.+Clifton+NJ%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro.</a> Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 299, 35-51 (2005).</li>
<li>Strohalm, M., Kavan, D., Novák, P., Volný, M., Havlícek, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mMass+3%3A+a+cross-platform+software+environment+for+precise+analysis+of+mass+spectrometric+data%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">mMass 3: a cross-platform software environment for precise analysis of mass spectrometric data.</a> Anal. Chem. 82, 4648-4651 (2010).</li>
<li>Gattiker, A., Bienvenut, W. V., Bairoch, A., Gasteiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FindPept%2C+a+tool+to+identify+unmatched+masses+in+peptide+mass+fingerprinting+protein+identification%5BTitle%5D)+AND+%22PROTEOMICS%22%5BJournal%5D)">FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification.</a> PROTEOMICS. 2, 1435-1444 (2002).</li>
<li>Rob, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Dynamics+in+Weakly+Structured+Regions+of+Proteins+Using+Microfluidics-Enabled+Subsecond+H%2FD+Exchange+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Measuring Dynamics in Weakly Structured Regions of Proteins Using Microfluidics-Enabled Subsecond H/D Exchange Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 84, 3771-3779 (2012).</li>
<li>Ferguson, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen%2FDeuterium+Scrambling+during+Quadrupole+Time-of-Flight+MS%2FMS+Analysis+of+a+Zinc-Binding+Protein+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Hydrogen/Deuterium Scrambling during Quadrupole Time-of-Flight MS/MS Analysis of a Zinc-Binding Protein Domain.</a> Anal. Chem. 79, 153-160 (2007).</li>
<li>Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+structure+effects+on+peptide+group+hydrogen+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange.</a> Proteins. 17, 75-86 (1993).</li>
<li>Buée, L., Bussière, T., Buée-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+protein+isoforms%2C+phosphorylation+and+role+in+neurodegenerative+disorders1%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders1.</a> Brain Res. Rev. 33, 95-130 (2000).</li>
<li>Zhang, H. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19551977">Enhanced Digestion Efficiency, Peptide Ionization Efficiency, and Sequence Resolution for Protein Hydrogen/Deuterium Exchange Monitored by FT-ICR Mass Spectrometry.</a> Anal. Chem. 80 (23), 9034-9041 (2008).</li>
<li>Deng, B., Lento, C., Wilson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+deuterium+exchange+mass+spectrometry+in+biopharmaceutical+discovery+and+development+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Hydrogen deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical discovery and development - A review.</a> Anal. Chim. Acta. , (2016).</li>
<li>Pan, L. Y., Salas-Solano, O., Valliere-Douglass, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+and+dynamics+of+interchain+cysteine-linked+antibody-drug+conjugates+as+revealed+by+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Conformation and dynamics of interchain cysteine-linked antibody-drug conjugates as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 86, 2657-2664 (2014).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+mapping+of+a+95+kDa+antigen+in+complex+with+antibody+by+solution-phase+amide+backbone+hydrogen%2Fdeuterium+exchange+monitored+by+Fourier+transform+ion+cyclotron+resonance+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Epitope mapping of a 95 kDa antigen in complex with antibody by solution-phase amide backbone hydrogen/deuterium exchange monitored by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry.</a> Anal. Chem. 83, 7129-7136 (2011).</li>
<li>Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+protein+complexes+with+hydrogen+exchange+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Analysis of protein complexes with hydrogen exchange and mass spectrometry.</a> The Analyst. 128, 623-628 (2003).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1beta+epitope+mapping+using+site-directed+mutagenesis+and+hydrogen-deuterium+exchange+mass+spectrometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+%28Mosc%29%22%5BJournal%5D)">IL-1beta epitope mapping using site-directed mutagenesis and hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry analysis.</a> Biochemistry (Mosc). 44, 11106-11114 (2005).</li>
<li>Konermann, L., Rodriguez, A. D., Sowole, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+1+and+Type+2+scenarios+in+hydrogen+exchange+mass+spectrometry+studies+on+protein-ligand+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Type 1 and Type 2 scenarios in hydrogen exchange mass spectrometry studies on protein-ligand complexes.</a> The Analyst. 139, 6078-6087 (2014).</li>
</ol>

אין לנו מה לחשוף.

בעוד שיטות ביולוגיה מבניות כגון קריסטלוגרפיה באמצעות קרן רנטגן ו- NMR הן יתרון משום שהם מספקים מבנים מפורטים מאוד של חלבונים, התמונות האלה הן בדרך כלל סטטי. האפיון של מינים חולפים תחומים מובנים בחולשה ממשיך להיות חמקמק כאשר למדו על ידי השיטות הקונבנציונליות הללו. לכן, על מנת לקבל תובנות דינמיים על סוגים אלה של מערכות חשוב לעבוד בסקלות זמן מהירות. יש לנו ליישם בהצלחה TRESI-HDX-MS להשיג תובנות מפורטות על שינויים מרחביים המתרחשים בתוך IDP למד היטב ברמה peptidic מקומי. אחת מגבלות מפתח...

במהלך העשורים האחרונים, התקדמות משמעותית נעשתה בפיתוח שיטות אנליטיות שנועדו למדוד את מבנה חלבון ואת דינמיקת 1, 2, 3, 4. בעוד קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן נותר כלי העיקרון לקביעת מבנה החלבון, ריכוז גבוה של חלבון נחוצים ואופטימיזציה נרחב נדרש לייצר גבישים באיכות עקיפה. חלבונים שקשה לגבש, כגון חלבונים בממברנה הקשורים בו אי סדר מיסודם נחקרו קלאסי ידי חילופי מימן-דאוטריום (HDX) התמ&quot;ג 5. עם זאת, בעשורים האחרונים, צימוד של ספקטרומטריית מסת electrospray יינון (ESI-MS) כדי HDX צבר במהירות פופולרית 6, 7. ספקטרומטריית מסה מציעה פתרוןלרבים המגבלות שמציב קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן ו- NMR. בפרט, MS הוא מאוד רגיש (ננומטר לריכוזים מיקרומטר חובה), ואין כמעט שום מגבלה על גודל החלבון. בנוסף, מחזור העבודה הגבוה של ניתוח MS מאפשר לאפשרות של לימוד חלבונים כפי שהם עוברים מחזור אנזימטי, misfolding, complexation ותהליכים ביולוגיים-רלוונטיים אחרים. תהליכים אלה מתרחשים לעתים קרובות על האלפית השני בקנה המידה שנייה זמן ודורשים ערבוב מהיר של ריאגנטים לפני הניתוח. התפתחות electrospray יינון זמן לפתור (TRESI) על ידי וילסון Konermann ב 2003 תגובות מותרות להיות במעקב בזמן פסאודו-אמת על ידי ESI-MS. ההתקנה שלהם שולבה מיקסר נימים עם נפח תא תגובת מתכוונן ברציפות 8. המכשיר מורכב משתי נימים קונצנטריים, עם הנימים הפנימיות אטום חריץ וחותכי הצד שלה, כדי לאפשר ערבוב בתוך הבין-קַפִּילָאר הצרמרחב y מן החריץ עד הסוף של הנימים הפנימיות (בדרך כלל 2 מ&quot;מ). כאשר חלים ניסויי HDX, הנימים הפנימיות נושאות את החלבון של עניין, הנימים החיצוניות נושאות את התיוג D 2 O פתרון, אשר ולאחר מכן עובר ערבוב עם החלבון לפני הכניסה לתא תגובת מתכוונן המאפשר תיוג HDX לפני העברה ישירה לתוך ESI מָקוֹר. בקצרה, HDX מסתמך על מימנים אמידים עמוד שדרה עוברים חילופי עם אטומי דאוטריום בתמיסה 9, 10. חילופי בסיס-המזורז ב- pH הפיזיולוגי, עם-קטליזה חומצה הופכת נפוצה ב- pH מתחת כ 2.6. שער חליפין מבוסס על ארבעה גורמים עיקריים: pH, טמפרטורה, נגישות ממס מליטת מימן intramolecular. כמו שני הגורמים לשעבר נשמרים קבועים לאורך הניסוי, שער הדולר, במיוחד בתפקידים אמיד עמוד השדרה פפטיד, הוא בעיקר dependent על מבנה חלבון 11. בחוזקה אזורים מקופל עם נרחב, רשתות מליטת מימן יציבת סלילים-α ו β-sheets ייקח עד דאוטריום בשיעורים איטיים באופן משמעותי בהשוואת לולאות ואזורים מופרעים (ולפעמים בכלל לא) 12. זה מאפשר ניתוח חלבון הגלובלי, שבו הפרעות במבנה (למשל., על צבירה או מצע מחייב) להוביל שונים ספיג דאוטריום (איור 1). מיקסר נימי הקינטית ניתן לשלב פלטפורמת microfluidic המכילה תא פרוטאוליטים עבור לוקליזציה של ספיגת דאוטריום. תא פרוטאוליטים זה מתקיים ב- pH הנמוך כדי להרוות את תגובת החליפין אפקטיבי, ומחייב פרוטאז חומצה משותק על מנת לעכל את החלבון לתוך פפטידים מקומיים (איור 2). ניטור חילופי עמוד השדרה בבית אלפית השנייה כדי קשקשים בפעם השנייה הוא חשוב במיוחד עבוראפיון של שינויים מרחביים בתוך קשה לאפיין אזורי לולאה, כדוריות מותכת, וחלבונים מופרעים מיסודם (עקורים) 13, 14. לחלופין, TRESI-HDX יכול לשמש גם כדי לאפיין חלבונים כי כרגע אין מבנה האטום לפתור באמצעות שיטות של קריסטלוגרפיה באמצעות קרני רנטגן ו- NMR, באמצעות חילופי דאוטריום מצמידים את האלגוריתם קורקס (DX-קורקס) הגישה 15, 16. פרוטוקול מפורט זה יחול TRESI-HDX ללמוד טאו, גידול IDP, הן זה בצורה מקורית כמו גם זה מצב hyperphosphorylated פתוגניים. בעוד טאו ילידים הוא אחד העקור הנחקר ביותר היטב, מעט מאוד ידוע על עמיתו amyloidogenic שלה 13.

<table><tbody><tr><td>פולי (מתיל מתאקרילט) או PMMA</td><td>פלסטיק מקצועי</td><td>SACR.250CCP</td><td>8.9 ס"מ x 3.8 ס"מ x 0.6 ס"מ</td></tr><tr><td>זכוכית סיליקה התמזגה נימי</td><td>פולימיקרו טכנולוגיות</td><td>106815-0018</td><td>מזהה: 75 ומיקרו; מ', OD: 150 ומיקרו; m</td></tr><tr><td>נימי מתכת</td><td>McMaster-Carr</td><td>28 ga &ndash; 89875K97 30 ga&nbsp; - 89875K99</td><td></td></tr><tr><td>צינורות אתילן פרופילן פלואור (FEP)</td><td>IDEX</td><td>1477 1548</td><td>ID: 0.007 אינץ', OD: 1/16 אינץ' מזהה : 0.020 אינץ', OD: 1/16 אינץ'</td></tr><tr><td>חותך צינורות פולימרי סטנדרטי</td><td>IDEX</td><td>A-327</td><td>עבור 1/16 אינץ' ו-1/8 אינץ' OD צינורות</td></tr><tr><td>מיקרו סטטי ערבוב טי</td><td>IDEX</td><td>M-540</td><td>עבור 1/16 אינץ' צינורות OD</td></tr><tr><td>או</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>טי נירוסטה, 0.25&nbsp; מ"מ קדח</td><td>Valco Instruments Co., Inc. (VICI)</td> <td>ZT1C</td><td>עבור 1/16 אינץ' טי הצצה לצינורות OD</td></tr><tr><td>ל-1/16 אינץ' OD Tubing</td><td>IDEX</td><td>P-727</td><td></td></tr><tr><td>10-32 נקבה לנקבה</td><td>Luer IDEX</td><td>P-659</td><td></td></tr><tr><td>10-32 PEEK אגוז כפול כנפיים</td><td>IDEX</td><td>F-300</td><td></td></tr><tr><td>טבעת עבור 1/16 אינץ' OD צינורות</td><td>IDEX</td><td>F-142</td><td></td></tr><tr><td>100 סדרת כלי סיבובי</td><td>Dremel</td><td>F013010001</td><td></td></tr><tr><td>דיסקים חתוכים</td><td>חבר</td><td></td> עבודה <td>בעובי 1/64 אינץ'</td></tr><tr><td>Stereomaster מיקרוסקופ זום דיגיטלי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-563-411</td><td></td></tr><tr><td>ברזל הלחמה</td><td>Mastercraft</td><td>58-6301-2</td><td></td></tr><tr><td>לייזר אוניברסלי</td> <td>VersaLaser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מזרקים</td><td>המילטון</td><td>81220</td><td>500&nbsp; ומיקרו; L קיבולת</td></tr><tr><td>משאבות מזרק</td><td>הרווארד מנגנון</td><td>70-4501</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק><</td><td>חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>מופעל על ידי NHS אגרוז</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>26196</td><td></td></tr><tr><td>פפסין מרירית קיבה חזירית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P6887-250MG</td><td></td></tr><tr><td>תחמוצת דאוטריום</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>151882-10X0.6 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>695092-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>HPLC כיתה</td><td>מים דייג מדעי</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום אצטט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A7330-500G</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט</td><td>פישר מדעי</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר מדעי</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>הערות</חזק></td></tr><tr><td><חזק>תוכנה/כלים מקוונים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CorelDraw X3</td><td>Corel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מחשבון</td><td></td> משקל מולקולרי <td>גרסה 6.49</td><td>קוד פתוח MS Tool</td></tr><tr><td>mMass</td><td></td><td>גרסה 5.5.0</td><td>קוד פתוח MS Tool</td></tr><tr><td>ExPASy FindPept</td><td>המכון השוויצרי לביואינפורמטיקה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SigmaPlot</td><td>Systat גרסת תוכנה</td><td>11.0</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>Schr&ouml; dinger</td><td>גירסה 1.5.0.4</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QStar Elite Hybrid Q-TOF ספקטרומטר מסה</td><td>AB SCIEX</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון dynamics

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

מיסודם חלבונים מופרעים (עקור) כבר זמן רב אתגר לביולוגים מבניים עקב חוסר אלמנטי מבנה משני יציבה. מימן-דאוטריום Exchange (HDX) למדידה בסקאלות זמן מהירות מתאים באופן ייחודי כדי לזהות מבנים ורשתות מליטת המימן כי מאוכלסות בקצרה, המאפשר האפיון של conformers חולף בהרכבים מקומיים. עגינת HDX כדי ספקטרומטריית מסה מציעה יתרונות מרכזיים, כולל רגישות גבוהה, צריכת מדגם נמוכה ואין הגבלה על גודל חלבון. טכניקה זו התקדמה מאוד בעשורים האחרונים, כולל היכולת לפקח פעמים תיוג HDX על ציר הזמן אלפית השנייה. בנוסף, על ידי שילוב זרימת עבודת HDX גבי פלטפורמת microfluidic אירוח הפקת microreactor פרוטאז חומצי, אנחנו מסוגלים למקם תכונות דינמיות ברמת פפטיד. במחקר זה, זמן-נפתרה electrospray יינון ספקטרומטריית מסה (TRESI-MS) מצמידים HDX ווההים משמש כדי לספק תמונה מפורטת של מבנה שיורית חלבון טאו, כמו גם את משמרות קונפורמציה המושרות על hyperphosphorylation.

פרופילי עיכול של ילידי phospho-טאו היו דומים, מניב כיסוי רצף של 77.1 ו 71.7% בהתאמה. ערכים ספיגים דאוטריום של כל פפטיד נקבעו על ידי התאמת הפצות איזוטופי ציינו עם ההפצות התיאורטיות שנוצרו באמצעות תוכנת FORTRAN פתחה בתוך הבית. התפלגויות ההתאמה האופטימליות מוצגות (איור 3 א) יחד עם הערכים הספיגים דאוטריום קשור. פרופילים הקינטית ספיגים אז נוצרים, ותוארו היטב על ידי הבעות מעריכי יחיד. פרופילים קינטי לכל פפטידים ציינו בזמני תיוג 3 או יותר...

גמישות קונפורמציה משחקת תפקיד קריטי בתפקוד חלבון. בזאת, אנו מתארים את השימוש של ספקטרומטריית מסת electrospray יינון הזמן לפתור מצמידה את חילופי המימן-דאוטריום חיטוט השינויים המבניים המהירים שמניעים פונקצית חלבוני הורה אי סדר.

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

גמישות קונפורמציונית ממלאת תפקיד קריטי בתפקוד חלבונים, והמטרה הכללית של ספקטרומטריית מסות של חילוף מימן-דאוטריום באמצעות יינון בתגסית עם דחיקה חשמלית ברזולוציית זמן (Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry) היא לבחון שינויים מבניים מהירים המניעים את התפקוד בחלבונים מסודרים ובחלבונים לא-מסודרים. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הביולוגיה המבנית, כגון אפיון קונפורמציות חלבוניות חולפות, שאינן נגישות לטכניקות קלאסיות בעלות רזולוציה גבוהה כמו קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ו-NMR. היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שניתן לנטר תגובות בסולם זמן של מילי-שניות, דבר החשוב לאפיון לולאות, גלובולות מותזות וחלבונים שאינם מסודרים מטבעם.ההשלכות של טכניקה זו חולשות לעבר טיפול בהסתדרות של מחלות ניווניות של מערכת העצבים, כיוון שהן כרוכות לעיתים קרובות בקיפול שגוי או באגרגציה של אזורים חסרי מבנה מולד בחלבונים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי חלבונים בעלי מבנה חלש, ניתן להחיל אותה גם על מערכות אחרות, כגון אנזימים העוברים מחזור קטליטי, או לאפיון של אינטראקציות חלבון-חלבון וחלבון-ליגנד.כדי להתחיל בהליך זה, השתמשו בחריטה בלייזר כדי ליצור על גבי בלוק PMM8 סטנדרטי פלטה הכוללת תעלת כניסה להחדרת הריאגנטים, תא דיאליזה מקצועי ותעלת יציאה. לאחר מכן, חתכו קפילרית מתכת מפלדת אל חלון במידה 30 לשתי פיסות באורך 10 סנטימטרים כל אחת, באמצעות כלי רוטטורי עם דיסק חיתוך בעובי 1/64 אינץ'. השתמשו בנייר זכוכית כדי להחליק את קצוות הקפילריות, פעולה שניתן להקל עליה באמצעות צפייה תחת מיקרוסקופ אור.כעת, המיסו את הנימים לתוך בלוק ה-PMM8 החרוט באמצעות מלחם. כדי להקים מערבל קינטי בעל זרימה רציפה ורזולוציית זמן, הכניסו נימה מזכוכית סיליקה מותכת באורך 40 סנטימטר לתוך נימה ממתכת פלדה במידה 28 (gauge) באורך של כ-15 סנטימטרים. לאחר מכן, צרו חריץ של שני מילימטרים, באמצעות הגדרות של חריטה בלייזר בעוצמה נמוכה, בקצה אחד של נימת הזכוכית הפנימית ואטמו קצה זה של נימת הזכוכית הפנימית.זהו שלב קריטי המבטיח ערבוב אורתוגונלי ויעיל של החלבון, שיוצא דרך החריץ שבו נמצא דטרג'נט משותף. המרווח הבין-נימי של שני מילימטרים בין החריץ לקצה הנימה משמש כנפח הערבוב. חברו מחברים ושרוולי צינוריות בגודל המתאים ושלבו מחבר T, שישמש להגשת דטרג'נט.בשלב הבא, יישרו את קפילרית הזכוכית הפנימית עם קצה הקפילרית המתכתית, פעולה שניתן להקל עליה באמצעות צפייה תחת מיקרוסקופ אור. סמנו נקודה זו כמיקום אפס מילימטרים. חברו מערבל קינטי זה לקצה אחד של ה-T של הערבוב. לאחר מכן, חברו קפילרית זכוכית מסוג fused silica באורך 40 סנטימטר לקצה המנוגד של המערבל הקינטי ב-T של הערבוב. להפעלת pepsin, השעו 20 מיליגרם של pepsin מ-Porsena gassic mucosa בתוך מיליליטר אחד של בופר צימוד.הוסיפו 50 milligrams של חרוזי agro שופעלי NHS לפרוטאינים לאחר השביעה מחדש (resuspended) וסובבו בעדינות למשך הלילה, בטמפרטורה של 4 °C. למחרת, סובבו את התערובת בcenterY (spin down) ב-1,000 ×g למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את הסורבנט (resin). לאחר מכן, שאבו את הפרוטאינים שלא נקשרו.לאחר מכן, דגרו את ה-agros במיליליטר אחד של תמיסת חסימה (blocking buffer) וסובבו בעדינות בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. לאחר איסוף השרף ושאיבת תמיסת החסימה, דגרו את ה-pepsin agguros עם מיליליטר אחד של חומצה אצטית בריכוז 5% למשך חמש דקות. סובבו את התערובת ב-1,000 ×g למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את השרף, ולאחר מכן שאבו את הנוזל העליון (supernatant).לאחר חזרה על השלבים הקודמים, לסך הכל שלושה שטיפות, יש לאחסן את החרוזים במיליליטר אחד של acedic acid בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס לשימוש ממושך. להרכבת המכשיר, מלאו תא protialysis בתרחיף של חרוזי pepsin agguros מופעלים ב-5% acedic acid באמצעות שפכטל סטרילי. מקמו את פלטפורמת ה-PMMA micro falitic בין שני בלוקי PMMA ריקים ככיסוי לאטימה של המכשיר, כאשר הם מרופדים בגומי סיליקון ליצירת אטימה נגד דליפת נוזלים.השתמשו בלוחות קיבוע מתכתיים כדי לאטום את המכשיר בלחץ. לאחר מכן, חברו את מחבר ה-T לערבוב לכניסה של המכשיר באמצעות מחברים מתאימים. כעת, הזרימו חומצה אצטית בריכוז 5% דרך קו החומצה בקצב של 10 µL לדקה.לאחר מכן, העבירו 50 mM של בופר חומצה אמונית דרך קו החלבון בקצב של 1 µL לדקה. חברו את המכשיר לקצה הקדמי של ספקטרומטר מסות מסוג quadrapole time of flight (Qtof) משופר, תוך שימוש בבמה מבודדת ו可כוון כדי להשיג תנאי electro spray אופטימליים. לאחר קביעת תנאי ה-ESI-MS, רכשו ספקטרום של פפסין בלבד.בשלב הבא, הזריקו 50 עד 100 µM של חלבון tau או phospho-tau בקצב של 1 µL לדקה, לתוך זרימת בופר amonium acetate 50 mM שהייתה קיימת קודם לכן. לאחר מתן זמן של לפחות 10 דקות להגעה לשיווי משקל של המערכת, ולפני תחילת הרכישה, רכשו ספקטרום של החלבון בלבד. בזמן שחלבון ה-tau או ה-phospho-tau זורם, הזריקו deuterium oxide בקצב של 3 µL לדקה דרך מחבר ה-T, ואפשרו לו להגיב במיקסר הקינטי.כדי להאריך את זמן הסימון, משוך ידנית את מיקום קפילרית הזכוכית הפנימית כדי להגיע לזמני ערבוב של 42 מילישניות עד שמונה שניות, תוך מתן זמן למערכת להתייצב למשך לפחות 10 שניות בין כל משיכה. אנימציה זו מתארת את זרימת העבודה עבור ניסוי טיפוסי. חלבון יוצא דרך המגרעת ומעורבב עם הדאוטריום הנכנס.מימני ה-Backbone M8 מוחלפים במהלך זמן התגובה שהוקצב, אותו ניתן לשנות על ידי הזזת קפילרי החלבון לאחור. לאחר מכן, התגובה מופסקת ואז מועברת לעיכול על גבי פלטפורמה מיקרו-פלואידית הכוללת מחט ESI ביציאה. הספקטרום המתקבל מכיל חלבון שעובל עיכול.אחוז ספיגת הדאוטריום מחושב עבור פפטידים בודדים ולאחר מכן ממופה על מבנה החלבון התלת-ממדי. פרופילי העיכול של tau טבעי ושל phospho-tau היו דומים, והניבו כיסוי רצף של 77.1 ו-71.7 אחוזים, בהתאמה; כאן מוצגים התפלגויות האיזוטופים בעלות ההתאמה הטובה ביותר וערכי ספיגת הדאוטריום הנלווים עבור ארבעה פפטידים פשוטים. גרפים קינטיים נצפים של אחוז ספיגת הדאוטריום כפונקציה של הזמן עבור כל פפטיד משמשים להוצאת הקצב הניסיוני שנצפה.פרופילי ה-quale האקראיים שחושבו מוצגים להשוואה ומשמשים לחילוץ הדרגה הפנימית התאורטית. כצפוי, לא נצפו גורמי הגנה בטווח המקושר בדרך כלל לאלמנטים של מבנה משני, מה שמאשר כי tau טבעי מראה קישוריות מימנית פנימית חלשה. הגנה משמעותית נצפית בקצות ה-N וה-C, בדומיין המרכזי ובאזורים הנוטים לאגרגציה.ב-tau קשור להיפר-פוספורילציה, נצפתה עלייה כללית בספיגת דאוטריום לאורך החלבון. קיימות עליות משמעותיות בקצות ה-N וה-C ובאזור ההקספפטיד שני. גורמי מידת ההגנה צבועים בסכמת צבעי קשת, כפי שמוצג כאן.לאחר השליטה בטכניקה, ניתן לבצע אותה בתוך מספר שעות, אם היא מבוצעת כראוי. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להשתמש באזורים בדרגת HPC או גבוהה יותר, כדי למזער זיהומים שעלולים להפריע לאניליזה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון סימון קוולנטי, קישור כימי צולב, מידול חישובי ומחקרי מסמכים, כדי להתאים מבני חלבון תלת-ממדיים, או לאשר אזורים של אינטראקציה בין חלבון לחלבון ובין חלבון לליגנד.לאחר פיתוחה, סללה טכניקה זו את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה המבנית לחקור חלבונים ודומיינים בעלי חוסר סדר מובנה (intrinsically disordered), הנפוצים ביותר במחלות ניווניות של מערכת העצבים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד להשתמש במיון בייונון בריסוס אלקטרוסטטי בעת רגעית (time resolved electro spray ionization), החלפת מימן-דאוטריום (hydrogen deuterium exchange), וספקטרומטריית מסות, לצורך חקר המבנה והדינמיקה של חלבונים.

time-resolved-electrospray-ionization-hydrogen-deuterium-exchange

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

קונפורמציה בחלבון ודינמיקה הן מפתח להבנת הקשר בין מבנה חלבון ותפקודו. חילופי מימן יחד עם ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה הוא שיטה תכליתית כדי ללמוד את הדינמיקה קונפורמציה של חלבונים כמו גם באפיון אינטראקציות החלבון ליגנד וחלבונים, כוללים ממשקי מגע ואפקטי allosteric.

ניתוח דינמיקת חלבון באמצעות מימן Exchange ספקטרומטריית מסה

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים לספקטרומטריית מסה של חילופי מימן/דאוטריום במצב מוצק (ssHDX-MS) וספקטרומטריית מסה של תיוג פוטוליטי במצב מוצק (ssPL-MS) עבור חלבונים באבקות מוצקות. השיטות מספקות מידע ברזולוציה גבוהה על קונפורמציה של חלבונים ואינטראקציות במצב מוצק אמורפי, שעשוי להיות שימושי בתכנון ניסוח.

Mass spectrometric גישות לחקר מבנה חלבון ואינטראקציות באבקות Lyophilized

הארכיטקטורה של מתחמי חלבון חיוני לתפקוד שלהם. שילוב של טכניקות שונות המוני spectrometric הוכיח עוצמה ללמוד ההרכבה שלהם. אנחנו מספקים פרוטוקולים cross-linking כימי, יליד ספקטרומטר מסה ולהראות כמה שיטות משלימות אלה לעזור להבהיר את הארכיטקטורה של יחידת משנה רב חלבון הרכבות.

שילוב cross-linking כימי ספקטרומטר מסה של מתחמי חלבון שלם ללמוד את הארכיטקטורה של יחידת משנה רב חלבון להרכבות

ספקטרומטר מסה (MS) התפתחה כלי חשוב החקירה של מבנה, הדינמיקה של הרכבות macromolecular. כאן, אנחנו משלבים גישות MS לחקור היווצרות מורכבות חלבון ואיגוד ליגנד.

ניתוח ארכיטקטורות חלבון חלבון-ליגנד מתחמי באמצעות ספקטרומטר מסה מבניים אינטגרטיבית

סינתזות Lanthipeptide לזרז תגובות מרובות צעדים במהלך הביוסינתזה של מוצרים טבעיים פפטיד. כאן, אנו מתארים רציף, מלמטה למעלה, מימן-deuterium חילופי ספקטרומטריית מסה (HDX-MS) זרימת עבודה שניתן להפעיל כדי ללמוד את הדינמיקה הקונפורמטיבית של סינתטאז lanthipeptide, כמו גם אנזימים דומים אחרים המעורבים ביוסינתזה של מוצר טבעי פפטיד.

פלטפורמת ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן-דיטריום (HDX-MS) לבדיקת אנזימים ביוסינתטיים פפטיד

מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור אלקטרופורזה מבוססת אלקטרופורזה נימית מימן / דיוטריום חילופי (HDX) גישה בשילוב עם ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה. גישה זו מאפיינת את ההבדל במבנים מסדר גבוה יותר בין מיני חלבונים שונים, כולל חלבונים במצבים שונים ופרוטאופורמים שונים, על ידי ביצוע HDX דיפרנציאלי בו זמנית והפרדה אלקטרופורטית.

חילופי מימן/דיטריום מבוססי נימי אלקטרופורזה לאפיון קונפורמציה של חלבונים עם ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה

ספקטרוסקופיית פיזור אחורי של נייטרונים מציעה גישה לא הרסנית ונטולת תוויות לדינמיקה של ps-ns של חלבונים ומי ההידרציה שלהם. תהליך העבודה מוצג עם שני מחקרים על חלבוני עמילואיד: על הדינמיקה שנפתרה בזמן של ליזוזים במהלך צבירה ועל דינמיקת מי ההידרציה של טאו על היווצרות סיבים.

ספקטרוסקופיית נייטרונים ברזולוציה גבוהה לחקר דינמיקה של פיקו-שנייה-ננו-שנייה של חלבונים ומי לחות

ההרכב המבני של אלפא-סינוקלאין מונומרי משפיע על תפקודו הפיזיולוגי ועל תכונותיו הפיזיקוכימיות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד לבצע ספקטרומטריית מסות חילופי מימן/דאוטריום של אלפיות השנייה וניתוחי נתונים מאוחרים יותר כדי לקבוע מידע קונפורמי על המונומר של חלבון זה בעל הפרעה פנימית בתנאים פיזיולוגיים.

ספקטרומטריית מסות חילופי מימן/דאוטריום של אלפיות השנייה לחקר הדינמיקה המבנית של אלפא-סינוקלאין בתנאים פיזיולוגיים

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לטיהור זיקה של קומפלקסי חלבונים והפרדה שלהם לפי דף ילידי כחול, ואחריו פרופיל מתאם חלבון באמצעות ספקטרומטריית מסה כמותית בחינם תווית. שיטה זו שימושית כדי לפתור interactomes לתוך מתחמי חלבון ברורים.

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

טיפות ליפידים הם אברונים חשובים עבור שכפול של מספר פתוגנים, כולל וירוס הפטיטיס C (HCV). אנו מתארים שיטה לבודד טיפות השומנים עבור ספקטרומטריית מסה כמותית של חלבונים הקשורים; ניתן להשתמש בו תחת מגוון של תנאים, כגון זיהום וירוס, לחץ סביבתי, או טיפול תרופתי.

בידוד אגל ליפידים על ניתוח כמותי ספקטרומטריית מסה

חקור דינמיקת מבנה חלבון באמצעות ספקטרומטריית מסה electrospray עם החלפת מימן-דאוטריום בזמן אמת. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר שינויים מבניים מהירים בחלבונים מסודרים ובלתי מסודרים לחקירת מחלות נוירודגנרטיביות.

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

גלה סרטונים נוספים