המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

גמישות קונפורמציה ממלאת תפקיד קריטי בתפקוד החלבון והמטרה הכוללת של ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן-דאוטריום היא לחקור שינויים מבניים מהירים המניעים תפקוד בחלבונים מסודרים ולא מסודרים. שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הביולוגיה המבנית, כגון מכתש של אישורי חלבון חולף, זה לא מינימלי לטכניקות קלאסיות ברזולוציה גבוהה כמו אלקטרוציסטוגרפיה ו-NMR. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לנטר תגובות בסולם הזמן של אלפית השנייה, החשוב לאפיון רכסי לולאה, Moltinglobyals וחלבונים לא מסודרים באופן מהותי.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על טיפול בהפרעות ניווניות. מכיוון שלעתים קרובות הם כרוכים בקיפול שגוי, או צבירה של אזורי חלבון לא מסודרים באופן מהותי. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי חלבונים מובנים שבועיים, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות, כגון אנזימים העוברים תחלופה קטליטית, או אפיון אינטראקציות חלבון, חלבון וחלבון, ליגאן.

כדי להתחיל בהליך זה, לייזר צלחת דרך תעלת קלט להכנסת הריאגנטים, תא פרו דיאליזה ותעלת פלט, על בלוק PMM8 סטנדרטי, באמצעות חרט לייזר. לאחר מכן, חתוך נימי מתכת נירוסטה בגודל 30 לשני חלקים של 10 סנטימטר באמצעות כלי סיבובי לדיסק החתוך בעובי 164 אינץ'. השתמש בנייר חול כדי להחליק את קצה הנימים, דבר שניתן להקל על ידי צפייה במיקרוסקופ אור.

כעת, ממיסים את הנימים לתוך בלוק ה-PMM8 החרוט באמצעות מגהץ. כדי לבנות זרימה רציפה, מערבל קינטי שנפתר בזמן, הכנס נימי זכוכית סיליקה התמזגו בגודל 40 ס"מ לתוך נימי פלדה ומתכת בגודל 28 של כ-15 סנטימטרים. לאחר מכן, הפק חריץ של שני מילימטרים, תוך שימוש בהגדרות חרט לייזר בהספק נמוך בקצה אחד של נימי הזכוכית הפנימיים ואטום קצה זה של נימי הזכוכית הפנימיים.

זהו שלב קריטי המבטיח ערבוב אורתוגונלי ויעיל של החלבון, היוצא דרך החריץ שעל התדרדרה משותפת. המרווח הבין-נימי של שני מילימטר בין החריץ לקצה הנימים הוא התערובת והנפח. חבר אביזרי גודל מתאים ושרוולי צינורות ושלב מחבר T, שישמש לאספקת דטריום.

לאחר מכן, יישר את נימי הזכוכית הפנימיים עם קצה נימי המתכת שניתן להקל על ידי צפייה במיקרוסקופ אור. סמן זאת כמיקום אפס מילימטר. חבר את המיקסר הקינטי הזה לקצה אחד של הערבוב T.לאחר מכן חבר נימי זכוכית סיליקה התמזגה של 40 סנטימטר לקצה הנגדי של המיקסר הקינטי על הערבוב T.להפעלת פפסין, השעו 20 מיליגרם פפסין מרירית הגז של פורסנה במיליליטר אחד של מאגר צימוד.

הוסף 50 מיליגרם של מהירויות אגרו מופעלות של NHS לפרוטינים התלויים וסובב בעדינות במהלך הלילה, בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, סובבו את התערובת באלף פעמים G למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את השרף. לאחר מכן שאפו את הפרוטיות הלא קשורות.

לאחר מכן, דגרו את האגרוס במיליליטר אחד של חיץ חוסם וסובבו בעדינות בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר איסוף השרף ושאיבת המאגר החוסם, דגרו על הפפסין אגורו עם מיליליטר אחד של חמישה אחוז חומצה אצדית למשך חמש דקות. סובבו את התערובת ב -1, 000 פעמים גרם, למשך שתי דקות בטמפרטורת החדר, כדי לאסוף את השרף, ואז שאפו את הסופר נטנט.

לאחר חזרה על השלבים הקודמים, בסך הכל שלוש כביסות, אחסן את החרוזים במיליליטר אחד של חומצה אצדית בארבע מעלות צלזיוס לשימוש ארוך טווח. כדי להרכיב את המכשיר, מלאו תא פרוטיאליזה בתרחיץ של חרוזי פפסין אגורוס מופעלים בחומצה אצדית של חמישה אחוזים באמצעות מרית סטרילית. הנח את פלטפורמת המיקרו פאליטיק PMMA בין שני בלוקים ריקים של PMMA ככיסוי לאיטום המכשיר, מרופד בגומי סיליקון ליצירת אטימה הדוקה לנוזל.

השתמש במתכת clampלוחות כדי לאטום את המכשיר בלחץ. לאחר מכן חבר את ה- T הערבוב לכניסת המכשיר באמצעות אביזרים מתאימים. עכשיו זורם חמישה אחוז חומצה אצדית חשב קו החומצה בקצב של עשרה מיקרוליטר לדקה.

לאחר מכן זרמו 50 מילימטר חומצת אמוניה דרך קו החלבון בקצב של מיקרוליטר אחד לדקה. חבר את המכשיר לקצה הקדמי של זמן טיסה מרובע שונה, או ספקטרומטר מסה Qtof, באמצעות שלב מבודד מתכוונן כדי להשיג תנאי ריסוס אלקטרו אופטימליים. לאחר קביעת תנאי ESI-MS, רכוש ספקטרום פפסין בלבד.

לאחר מכן, הכניסו 50 עד 100 מיקרומולר של טאו, או חלבון פוספו-טאו בקצב של מיקרוליטר אחד לדקה, היכן שקודם לכן זרם חוצץ אמוניום אציטט של 50 מילימטר. לאחר מתן אפשרות למערכת לשיווי משקל למשך 10 דקות לפחות, לפני הרכישה, רכשו ספקטרום חלבון בלבד. בזמן שהטאו, או חלבון הטאו הפוספו, הכניסו דוטריום-אוקסיד בקצב של שלושה מיקרוליטר לדקה, דרך מחבר ה-T, ואפשרו להגיב במיקסר הקינטי.

על מנת להגדיל את זמן התיוג, משוך ידנית לאחור את מיקום נימי הזכוכית הפנימיים כדי להשיג זמני ערבוב של 42 אלפיות השנייה עד שמונה שניות, מה שמאפשר למערכת לאזן לפחות 10 שניות בין כל משיכה לאחור. אנימציה זו מתארת את תהליך העבודה של ניסוי טיפוסי. החלבון יוצא דרך החריץ ומתערבב עם הדוטריום המתקרב.

מימן M8 של עמוד השדרה מוחלף במהלך זמן התגובה המוקצב, אותו ניתן לשנות על ידי משיכת נימי החלבון לאחור. לאחר מכן מרווה את התגובה ולאחר מכן מתעכלת על פלטפורמה מיקרו-נוזלית המכילה מחט ESI מוצאת. הספקטרום המתקבל מכיל חלבון מעוכל.

אחוז ספיגת הדאוטריום מחושב עבור פפטידים בודדים ולאחר מכן ממופה על מבנה החלבון התלת-ממדי. פרופילי העיכול של טבעי ופוספו-טאו היו דומים, והניבו כיסוי רצף של 77.1 ו-71.7 אחוזים, בהתאמה, ההתפלגות האיזוטופית המתאימה ביותר וערכי ספיגת הדאוטריום הקשורים לארבעה פפטידים פשוטים מוצגים כאן. תרשים קינטי שנצפה של אחוז לספיגת דאוטריום, לעומת זמן, עבור כל פפטיד משמש למיצוי קצב הניסוי שנצפה.

פרופילי הquale האקראיים המחושבים מוצגים להשוואה ומשמשים לחילוץ הציון הפנימי התיאורטי. כצפוי, לא נצפו גורמי הגנה בטווח, הקשורים בדרך כלל ליסודות מבנה משניים, המאשרים כי טאו מקומי מציג קשרי מימן פנימיים חלשים. הגנה משמעותית נצפית בטרמיני N ו-C, התחום המרכזי ואזורי הצבירה.

בטאו הקשור להיפר פוספו, נצפתה עלייה כללית בספיגת דאוטריום על פני החלבון. ישנן עליות משמעותיות בטרמיני N ו-C ובאזור ה-hexapeptide two. דרגת גורמי ההגנה צבועים כערכת קשת בענן, כפי שמוצג כאן.

לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך מספר שעות, אם היא מבוצעת כראוי. בעת ניסיון הליך זה, חשוב להשתמש באזורים בדרגת HPC, ומעלה, כדי למזער מזהמים מכיוון שהם עלולים להפריע לניתוח. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון תיוג קוולנטי, קישור צולב כימי, מודלים חישוביים ומחקרי דוקו.

לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה המבנית, לחקור חלבונים ותחומים מופרעים באופן מהותי, הנפוצים ביותר במחלות ניווניות. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש ביינון אלקטרו ריסוס שנפתר בזמן, חילופי מימן דאוטריום, ספקטומטריית מסה, לחקר מבנה החלבון והדינמיקה.