ניצול רצפטורים-tagged pHluorin לפקח subcellular לוקליזציה וסחר

תיוג תחום תאי של חלבון הממברנה עם fluorophore pH רגיש, superecliptic pHluorin (ספטמבר), מאפשר לוקליזציה, ביטוי subcellular, וסחר שייקבע. הדמיה ספטמבר- שכותרתו חלבונים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימית מוחלטת (TIRFM) מאפשרת כימות של רמות חלבון בקרום ER ו פלזמה הפריפריה.

המטרה הכוללת של שיטת הדמיה פלואורסצנטית זו היא לנטר שינויים בסחר בחלבון הממברנה ובהפצה התוך תאית. שיטה זו מספקת תובנה לגבי שינויים בסחר בחלבונים, כגון ההשפעה של מוטציות גנטיות או גורמים פרמקולוגיים על קצב העברת השלפוחית וביטוי החלבון על פני התא. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע מדידות במהירות, ברזולוציה גבוהה, בזמן אמת, מבלי להרוס את הדגימה.

48 שעות לפני ההדמיה, תאי נוירובלסטומה 2A של עכבר עוברים טרנספטציה עם מבנה פלסמיד המכיל SEP, פלואורופור רגיש ל-pH המשולב באזור החוץ-תאי של החלבון המבוקש. כאשר התאים המועברים מוכנים להדמיה, עם פלואורסצנטיות השתקפות פנימית מלאה או מיקרוסקופ TIRF, הוסף שני מיליליטר של תמיסה חוץ-תאית pH 7.4 או ECS לתאים. הניחו צלחת תאים על שלב התרגום והשתמשו בתושבות שלב כדי לאבטח את המנה במקומה.

במצב אפיפלואורסצנטי, מקד את המיקרוסקופ ואתר את התאים הפלואורסצנטיים. התאים יישארו ממוקדים בכמה מישורי מיקוד. אתר תאים בודדים ומבודדים כדי להמשיך עם TIRF.

בתוכנית ההדמיה, הגדר את זמן החשיפה ל-200 אלפיות השנייה וייעל את עוצמת הקרינה על ידי הגדרת רווח EM. העבר את קרן הלייזר ל-TIRF באמצעות מנוע הצעד כדי לתרגם את הקרן על פני המטרה בצורה מדורגת. ככל שהזווית הקריטית מתקרבת, הקרן תתורגם באופן גלוי על פני קצה המנה עד שהיא מתכנסת בנקודת ההשתקפות הפנימית הכוללת במישור הדגימה, ובשלב זה הקרן כבר לא נראית לאורך קצה הצלחת.

ודא שהתאים נמצאים במצב TIRF על-ידי כוונון כפתור המיקוד. ב-TIRF, ניתן למקד רק מישור אחד של תאים, ולייצר תמונה מוגדרת מאוד עם רזולוציה גבוהה של קרום הפלזמה. כדי להתחיל בהליך זה, אתר תאים בודדים בריאים שעברו טרנספטציה במישור ההדמיה.

לרכוש תמונה ממוקדת של תאים ב-pH 7.4. קולטנים המסומנים ב-SEP על קרום הפלזמה והרטיקולום האנדופלזמי צריכים להיות גלויים. חסום במהירות את קרן הלייזר מלהגיע לדגימה כדי למנוע הלבנת תמונות.

השתמש בתוכנת הדמיית מיקרוסקופ המסוגלת להקליט מיקומי XY מרובים כדי להקליט את מיקומי הבמה המתאימים לכל תא. בדרך זו, צלם תמונות של 20 עד 30 תאים למנה תוך שימוש בתוכנה כדי להקליט את המיקום של כל תא. לאחר איסוף כל תמונות התאים ב-pH 7.4, הסר ידנית את ה-pH 7.4 ECS על ידי פיפטינג מבלי לגעת במנה.

מוסיפים בזהירות שני מיליליטר pH 5.4 ECS לתבשיל ומחכים 10 דקות. במהלך תקופה זו, שמור תמונות שנרכשו בעבר. תחת מערך התנאים הזהה המשמש לאיסוף תמונות ב-pH 7.4, העבר את השלב לכל מיקום שמור ורכוש תמונה של אותו תא ב-pH 5.4.

התאים צריכים להיראות פחות מוגדרים מכיוון שכל הקרינה שזוהתה מקורה בקולטני SEP מוגבלים ברטיקולום אנדופלזמי. שמור את תמונות תאי ה-pH 5.4. כדי לדמות החדרת שלפוחית בודדת, החלף תחילה את מצע הגידול של תאים שעברו טרנספטציה בשני מיליליטר של pH 7.4 ECS.

לאחר מכן, הניחו את צלחת התאים שעברו טרנספטציה על במת המיקרוסקופ והשתמשו בתושבות במה כדי לאבטח את המנה במקומה. מקד תא בודד ב-TIRF כפי שהודגם קודם לכן. אם מותקן, הגדר את המיקוד האוטומטי כך שהפוקוס לא ייסחף לאורך תקופת ההדמיה.

הקלט סדרה של 1,000 פריימים תוך לכידת תמונות ברציפות בקצב פריימים של 200 אלפיות השנייה. התפרצויות של פלואורסצנטיות יהיו גלויות במהלך תקופה זו, המתאימות לשלפוחיות סחר ב-pH נמוך המתמזגות עם קרום הפלזמה, וחושפות את ה-SEP ל-pH החוץ-תאי 7.4. כדי להתחיל בניתוח הקרינה של SEP כדי לקבוע לוקליזציה תת-תאית, פתח את תמונות התא באמצעות תוכנת ניתוח תמונות כגון ImageJ.

הפחיתו את הרקע מתמונות pH 5.4 ו-pH 7.4 באמצעות הגדרת הכדור המתגלגל. שימוש בסף מבוסס עוצמה כדי לכמת פלואורסצנטיות מתא בודד ב-pH 7.4, בחר תחילה תמונה, כוונן וסף. לאחר מכן בחר באופן ידני אזור עניין סביב התא.

באמצעות פונקציית המדידה המובנית תחת לשונית הניתוח, מדוד את שטח התא, עוצמה ממוצעת וצפיפות משולבת. חזור על מדידות אלה עבור אותו תא ב-pH 5.4. לאחר קבלת הצפיפות המשולבת עבור תמונות תאים הן ב-pH 7.4 והן ב-5.4, חשב את הצפיפות המשולבת של קרום הפלזמה על ידי הפחתת ערך ה-pH 5.4 מערך ה-pH 7.4.

ההבדל תואם את המספר היחסי של קולטנים על קרום הפלזמה באזור עירור ה-TIRF. כמדד לסחר, חשב את האחוז היחסי של הקולטנים המסומנים ב-SEP הממוקמים על קרום הפלזמה בהשוואה לקולטנים הנותרים הנראים בנפח העירור TIRF על ידי חלוקת הצפיפות המשולבת של קרום הפלזמה בצפיפות המשולבת הכוללת ב-pH 7.4, כפול 100. כדי לנתח אירועי הכנסת שלפוחית בודדת, פתח את הסדרה של 1,000 תמונות TIFF באמצעות תוכנת ניתוח תמונה.

הפחיתו את הרקע מכל המסגרות באמצעות הגדרת הכדור המתגלגל. התאם את איזון הצבע של ההקלטה כדי להגדיל את האזורים העוצמתיים המתאימים לאירועי הכנסת השלפוחית. ספור ידנית את פרצי הקרינה הנמשכים יותר משלוש פריימים או 600 אלפיות השנייה.

דוגמה זו של תמונת תא ב-pH 7.4 מציגה קולטנים הממוקמים על קרום הפלזמה והרטיקולום האנדופלזמי. ב-pH 5.4, קולטנים על קרום הפלזמה אינם זוהרים, כך שרק הקולטנים השוכנים ברטיקולום האנדופלזמי נראים לעין. ההבדל בין צפיפות משולבת של הקרינה ב-pH 7.4 ל-pH 5.4 תואם לקולטנים הממוקמים בקרום הפלזמה.

אירועי החדרת שלפוחית בודדת מוצגים ב-pH 7.4 כפרץ של פלואורסצנטיות בקרום הפלזמה, הנמשך לפחות 600 אלפיות השנייה. מיד לפני ההחדרה, לא קיים פרץ ניכר. עלייה בעוצמת הקרינה נראית כאשר שלפוחית הובלה הנושאת SEP מגיעה.

הקולטנים המסומנים ב-SEP מתפזרים על פני קרום הפלזמה עד שלא ניתן להבחין בינם לבין קולטנים שהוכנסו בעבר. לאחר שליטה, ניתן לבצע טכניקה זו תוך 45 דקות למנה, אם מבוצעת כראוי. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לעקוב אחר שינויים בחלוקת החלבון בין ה-ER ההיקפי לקרום הפלזמה.