יצירת פרופיל ביטוי עם מיקרו-עריות
מיקרו-אריות הן כלים חשובים ליצירת פרופיל ביטוי גנים, ומבוססות על כריכה משלימה בין בדיקות המחוברות לשבבי זכוכית וחומצות גרעין שמקורן בדגימות. באמצעות מ…
מיקרואוריות DNA הן כלים בשימוש נרחב כדי למדוד בו זמנית את הביטוי של גנים רבים ושונים. הם מורכבים מאלפי בדיקות – שכל אחת מהן מייצגת גן אחר – משותקות על "שבבים" או שקופיות, ונחשות על הכלאה משלימה כדי להעריך ביטוי גנים בתנאים ביולוגיים שונים.
וידאו זה יכסה את העקרונות הבסיסיים של טכנולוגיית microarray, פרוטוקול ליצירת פרופיל ביטוי גנים באמצעות microarrays, וכמה יישומים נוכחיים.
בואו נתחיל בדיון בעקרונות של פרופיל ביטוי גנים וטכנולוגיית מיקרו-ערה.
אחת השיטות המוקדמות ביותר שפותחו להערכת ביטוי גנים בדגימות ביולוגיות היא סופג צפוני, הכולל "בדיקה" עבור מולקולות RNA ספציפיות משותקות על ממברנות. בדיקות "צפות חופשיות" מזהות רצפי RNA משלימים במדגם, ומסומנות בדרך כלל במולקולות רדיואקטיביות או פלואורסצנטיות, כך שניתן לדמיין אותם.
ההתקדמות במיקרו-פיבריות, ריצוף הגנום וטכנולוגיות אחרות הובילה לפיתוח הביו-שבב המיקרו-עראי. בדומה לכתמים צפוניים, מיקרו-עראיות מבוססות על העיקרון של כריכה משלימה בין רצפי חומצות גרעין מדגמיות. בניגוד לצפוניים, עם זאת, במיקרו-אריות, הגשושיות של אוליגונוקלאוטיד הן שמשותקות על מגלשת זכוכית או שבב. הדגימות "הצפות חופשיות" נוצרות מרנ"א מבודדות מתאים או אורגניזמים בעלי עניין, שהוא הפוך מתומלל ל- משלים או "c"-DNA. זה יכול להיות מתויג ישירות עם מולקולות פלואורסצנטיות, או הכמויות שלהם עשוי להיות מוגבר עוד יותר על ידי תמלול במבחנה לתוך cRNA. לאחר מכן המדגם הוא היברידי לשבב. מכיוון שבדיקות על מיקרו-עראיות המיועדות ליישומים שונים עשויות להיות "היגיון", מה שאומר שהרצפים שלהם באותו כיוון כמו הרנ"א המבוטא של אורגניזם, או "אנטיסנס", החוקרים חייבים לוודא שהכיוון של הגדיל של המדגם משלים לזה של הבדיקות.
לאחר מכן ניתן לכמת ולעבד את נתוני עוצמת הפלואורסצנטיות "הגולמיים" עבור כל נקודה ספציפית לגן בשבב. הנתונים יכולים להיות כפופים למבחנים סטטיסטיים נוספים, כמו מבחן t של התלמיד, כדי לקבוע אם אותות הפלואורסצנטיות - ולכן רמות הביטוי - עבור גן מעניין שונות באופן משמעותי בין שני סוגי תאים או תנאי ניסוי.
חוקרים יכולים גם להשתמש בנתונים אלה כדי "אשכול" או לקבץ גנים המבוססים על דפוסי ביטוי דומים. לדוגמה, בעת השוואת דפוסי ביטוי בין שתי אוכלוסיות תאים, ניתן למצוא גנים מסוימים כדי להדגים שינויי ביטוי בכמויות שוות בערך באותו כיוון, וכך יקובצו יחד. חוקרים יכולים לתאר קשרים אלה בסוג של דיאגרמת עץ או "דנדרוגרמה" שבהם גבהים וסידורים של "ענפים" מציינים עד כמה דומים – או שונים – דפוסי ביטוי גנים. סוג זה של ניתוח יכול לספק תובנה על רשתות גנים, כמו גנים "מקובצים באשכולות" עשויים להשתתף באותם מסלולים ביולוגיים.
עכשיו כשדיברנו על העקרונות של מתודולוגיית המיקרו-אריה, בואו נסתכל על ניסוי מיקרו-ארי טיפוסי.
כדי להבטיח את איכות הרנ"א המבודד, יש לטפל בסביבות עבודה ובציוד בכימיקלים המנטרלים RNases – אנזימים שאחרת היו הורסים את הרנ"א. לאחר מכן ה- RNA מבודד מדגימות של עניין ומטוהר, והריכוז והשלמות שלו נקבעים באמצעות ספקטרופוטומטריה.
RNA מדגם זה מומר ל- cDNA ולאחר מכן cRNA. לאחר מכן, המדגם מסומן עם מולקולות פלואורסצנטיות מקוטעות, ואת איכותו וכמותו ניתן לבדוק שוב, ואז ניתן גם להעריך את היקף תיוג הפלואורסצנטי.
לאחר מכן, ה-cRNA המסומן מעורבב עם "פתרון הכלאה" לפני הטעינה למיקרו-array. כדי להקל על הכלאה מוצלחת, "מערבל" ממוקם על השבב כדי ליצור "תאי הכלאה". תמהיל ההיברידיות מתווסף לאט למערך. יש להקפיד להימנע מבועות אוויר, שכן אלה יכולים להפריע לקשירת המדגם לאזורים ספציפיים במיקרו-array, ולהוריד אות שלילי כוזב. לאחר הוספת המדגם, שבבים הם דגירה בטמפרטורה המתאימה עד 24 שעות.
לאחר ההיברידיות, המיקסר מוסר מהשבב, דגימה לא מאוגדת נשטפת, והמערך מיובש ביסודיות על ידי צנטריפוגה בצנטריפוגה מיוחדת, מחזיקת שקופיות. השבב המיובש מוחדר לסורק microarray, והמכונה מותאמת כך שהאותות הבהירים ביותר שנצפו בשבב אינם רוויים יתר על המידה. לאחר מכן נסרק המיקרו-אריה, ותמונה של השבב כולו מיוצרת.
לאחר שהשבב נסרק, קובץ התמונה נטען לתוכנת חילוץ נתונים ומוערך עבור אי סדרים באות. נתונים המופקים מתמונת המיקרו-array נתונים למספר מניפולציות סטטיסטיות, כולל טרנספורמציהשל יומן 2, המאפשרת לחוקרים לתאר נתונים באופן מספרי במונחים של קיפול או ירידות בביטוי הגנים; כמו גם נורמליזציה, אשר מהווה הבדלי אות בין שבבי microarray. לאחר מכן ניתן לנתח נתונים מעובדים אלה.
כעת, לאחר שהדגמנו כיצד מתבצע פרופיל ביטוי עם מיקרו-arrays, בואו נבחן כיצד ניתן להשתמש במיקרו-arrays בניסויים ספציפיים.
חוקרים משתמשים לעתים קרובות microarrays כדי להעריך כיצד ביטוי גנים משתנה לאורך תהליך ביולוגי, כגון הבחנה תאית. כאן, מדענים העריכו את רמות המיקרו-רנ"א, שהן RNAs קטנות של 22 נוקלאוטידים המעורבות בביטוי גנים לכוונון עדין, בשלושה סוגי תאים אנושיים המייצגים שלבים שונים של התפתחות רשתית. על ידי השוואת ביטוי מיקרו-רנ"א בין תאים אלה, החוקרים הצליחו לזהות גנים שעשויים להיות מעורבים בהבחנה ובהתפתחות של רקמת הרשתית.
Microarrays יכול לשמש גם כדי להעריך הבדלי ביטוי בין תאים שונים או סוגי רקמות. בניסוי זה, מודל מכרסמים של הפרעת דחק פוסט טראומטית, או PTSD, הוקם על ידי חשיפת חולדות לזעזועים חשמליים. נוירונים נאספו מאזורי מוח שונים ורנ"א היה מבודד. מיקרו-אריות שימשו אז לזיהוי ביטוי דיפרנציאלי של גנים הקשורים למיטוכונדריה בתאי עצב אלה, ומספקים תובנה על המנגנונים המולקולריים המורכבים שמאחורי PTSD.
לבסוף, החוקרים מיישמים גם מיקרו-אריות על מחקרי סרטן, בתקווה שניתן יהיה לזהות סמנים ביולוגיים חדשים של מחלות. כתוצאה מזיהומים על ידי וירוסים לאורך האבולוציה שלנו, הגנום האנושי מכיל רצפים גנטיים ויראליים המכונים "רטרווירוסים אנדוגניים" או ERVs, שחלקם עדיין באים לידי ביטוי באופן פעיל. כאן, הביטוי של ERVs ברקמות הערמונית הסרטניות והנורמליות הושווה באמצעות microarrays. שיטה זו אפשרה לחוקרים לאתר מספר ERVs שהיו upregulated בסרטן הערמונית, מה שהופך אותם סמנים ביולוגיים פוטנציאליים שניתן להשתמש בהם כדי לאבחן מחלות.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על פרופיל ביטוי גנים באמצעות מיקרו-עראים. וידאו זה כיסה את העקרונות הבסיסיים של טכנולוגיית microarray, פרוטוקול ליצירת פרופיל ביטוי ויישומים של טכניקה זו. כמו תמיד, תודה שצפית!
מיקרואוריות DNA הן כלים בשימוש נרחב כדי למדוד בו זמנית את הביטוי של גנים רבים ושונים. הם מורכבים מאלפי בדיקות – שכל אחת מהן מייצגת גן אחר – משותקות על "שבבים" או שקופיות, ונחשות על הכלאה משלימה כדי להעריך ביטוי גנים בתנאים ביולוגיים שונים.
וידאו זה יכסה את העקרונות הבסיסיים של טכנולוגיית microarray, פרוטוקול ליצירת פרופיל ביטוי גנים באמצעות microarrays, וכמה יישומים נוכחיים.
בואו נתחיל בדיון בעקרונות של פרופיל ביטוי גנים וטכנולוגיית מיקרו-ערה.
אחת השיטות המוקדמות ביותר שפותחו להערכת ביטוי גנים בדגימות ביולוגיות היא סופג צפוני, הכולל "בדיקה" עבור מולקולות RNA ספציפיות משותקות על ממברנות. בדיקות "צפות חופשיות" מזהות רצפי RNA משלימים במדגם, ומסומנות בדרך כלל במולקולות רדיואקטיביות או פלואורסצנטיות, כך שניתן לדמיין אותם.
ההתקדמות במיקרו-פיבריות, ריצוף הגנום וטכנולוגיות אחרות הובילה לפיתוח הביו-שבב המיקרו-עראי. בדומה לכתמים צפוניים, מיקרו-עראיות מבוססות על העיקרון של כריכה משלימה בין רצפי חומצות גרעין מדגמיות. בניגוד לצפוניים, עם זאת, במיקרו-אריות, הגשושיות של אוליגונוקלאוטיד הן שמשותקות על מגלשת זכוכית או שבב. הדגימות "הצפות חופשיות" נוצרות מרנ"א מבודדות מתאים או אורגניזמים בעלי עניין, שהוא הפוך מתומלל ל- משלים או "c"-DNA. זה יכול להיות מתויג ישירות עם מולקולות פלואורסצנטיות, או הכמויות שלהם עשוי להיות מוגבר עוד יותר על ידי תמלול במבחנה לתוך cRNA. לאחר מכן המדגם הוא היברידי לשבב. מכיוון שבדיקות על מיקרו-עראיות המיועדות ליישומים שונים עשויות להיות "היגיון", מה שאומר שהרצפים שלהם באותו כיוון כמו הרנ"א המבוטא של אורגניזם, או "אנטיסנס", החוקרים חייבים לוודא שהכיוון של הגדיל של המדגם משלים לזה של הבדיקות.
לאחר מכן ניתן לכמת ולעבד את נתוני עוצמת הפלואורסצנטיות "הגולמיים" עבור כל נקודה ספציפית לגן בשבב. הנתונים יכולים להיות כפופים למבחנים סטטיסטיים נוספים, כמו מבחן t של התלמיד, כדי לקבוע אם אותות הפלואורסצנטיות - ולכן רמות הביטוי - עבור גן מעניין שונות באופן משמעותי בין שני סוגי תאים או תנאי ניסוי.
חוקרים יכולים גם להשתמש בנתונים אלה כדי "אשכול" או לקבץ גנים המבוססים על דפוסי ביטוי דומים. לדוגמה, בעת השוואת דפוסי ביטוי בין שתי אוכלוסיות תאים, ניתן למצוא גנים מסוימים כדי להדגים שינויי ביטוי בכמויות שוות בערך באותו כיוון, וכך יקובצו יחד. חוקרים יכולים לתאר קשרים אלה בסוג של דיאגרמת עץ או "דנדרוגרמה" שבהם גבהים וסידורים של "ענפים" מציינים עד כמה דומים – או שונים – דפוסי ביטוי גנים. סוג זה של ניתוח יכול לספק תובנה על רשתות גנים, כמו גנים "מקובצים באשכולות" עשויים להשתתף באותם מסלולים ביולוגיים.
עכשיו כשדיברנו על העקרונות של מתודולוגיית המיקרו-אריה, בואו נסתכל על ניסוי מיקרו-ארי טיפוסי.
כדי להבטיח את איכות הרנ"א המבודד, יש לטפל בסביבות עבודה ובציוד בכימיקלים המנטרלים RNases – אנזימים שאחרת היו הורסים את הרנ"א. לאחר מכן ה- RNA מבודד מדגימות של עניין ומטוהר, והריכוז והשלמות שלו נקבעים באמצעות ספקטרופוטומטריה.
RNA מדגם זה מומר ל- cDNA ולאחר מכן cRNA. לאחר מכן, המדגם מסומן עם מולקולות פלואורסצנטיות מקוטעות, ואת איכותו וכמותו ניתן לבדוק שוב, ואז ניתן גם להעריך את היקף תיוג הפלואורסצנטי.
לאחר מכן, ה-cRNA המסומן מעורבב עם "פתרון הכלאה" לפני הטעינה למיקרו-array. כדי להקל על הכלאה מוצלחת, "מערבל" ממוקם על השבב כדי ליצור "תאי הכלאה". תמהיל ההיברידיות מתווסף לאט למערך. יש להקפיד להימנע מבועות אוויר, שכן אלה יכולים להפריע לקשירת המדגם לאזורים ספציפיים במיקרו-array, ולהוריד אות שלילי כוזב. לאחר הוספת המדגם, שבבים הם דגירה בטמפרטורה המתאימה עד 24 שעות.
לאחר ההיברידיות, המיקסר מוסר מהשבב, דגימה לא מאוגדת נשטפת, והמערך מיובש ביסודיות על ידי צנטריפוגה בצנטריפוגה מיוחדת, מחזיקת שקופיות. השבב המיובש מוחדר לסורק microarray, והמכונה מותאמת כך שהאותות הבהירים ביותר שנצפו בשבב אינם רוויים יתר על המידה. לאחר מכן נסרק המיקרו-אריה, ותמונה של השבב כולו מיוצרת.
לאחר שהשבב נסרק, קובץ התמונה נטען לתוכנת חילוץ נתונים ומוערך עבור אי סדרים באות. נתונים המופקים מתמונת המיקרו-array נתונים למספר מניפולציות סטטיסטיות, כולל טרנספורמציהשל יומן 2, המאפשרת לחוקרים לתאר נתונים באופן מספרי במונחים של קיפול או ירידות בביטוי הגנים; כמו גם נורמליזציה, אשר מהווה הבדלי אות בין שבבי microarray. לאחר מכן ניתן לנתח נתונים מעובדים אלה.
כעת, לאחר שהדגמנו כיצד מתבצע פרופיל ביטוי עם מיקרו-arrays, בואו נבחן כיצד ניתן להשתמש במיקרו-arrays בניסויים ספציפיים.
חוקרים משתמשים לעתים קרובות microarrays כדי להעריך כיצד ביטוי גנים משתנה לאורך תהליך ביולוגי, כגון הבחנה תאית. כאן, מדענים העריכו את רמות המיקרו-רנ"א, שהן RNAs קטנות של 22 נוקלאוטידים המעורבות בביטוי גנים לכוונון עדין, בשלושה סוגי תאים אנושיים המייצגים שלבים שונים של התפתחות רשתית. על ידי השוואת ביטוי מיקרו-רנ"א בין תאים אלה, החוקרים הצליחו לזהות גנים שעשויים להיות מעורבים בהבחנה ובהתפתחות של רקמת הרשתית.
Microarrays יכול לשמש גם כדי להעריך הבדלי ביטוי בין תאים שונים או סוגי רקמות. בניסוי זה, מודל מכרסמים של הפרעת דחק פוסט טראומטית, או PTSD, הוקם על ידי חשיפת חולדות לזעזועים חשמליים. נוירונים נאספו מאזורי מוח שונים ורנ"א היה מבודד. מיקרו-אריות שימשו אז לזיהוי ביטוי דיפרנציאלי של גנים הקשורים למיטוכונדריה בתאי עצב אלה, ומספקים תובנה על המנגנונים המולקולריים המורכבים שמאחורי PTSD.
לבסוף, החוקרים מיישמים גם מיקרו-אריות על מחקרי סרטן, בתקווה שניתן יהיה לזהות סמנים ביולוגיים חדשים של מחלות. כתוצאה מזיהומים על ידי וירוסים לאורך האבולוציה שלנו, הגנום האנושי מכיל רצפים גנטיים ויראליים המכונים "רטרווירוסים אנדוגניים" או ERVs, שחלקם עדיין באים לידי ביטוי באופן פעיל. כאן, הביטוי של ERVs ברקמות הערמונית הסרטניות והנורמליות הושווה באמצעות microarrays. שיטה זו אפשרה לחוקרים לאתר מספר ERVs שהיו upregulated בסרטן הערמונית, מה שהופך אותם סמנים ביולוגיים פוטנציאליים שניתן להשתמש בהם כדי לאבחן מחלות.
הרגע צפית בסרטון של ג'וב על פרופיל ביטוי גנים באמצעות מיקרו-עראים. וידאו זה כיסה את העקרונות הבסיסיים של טכנולוגיית microarray, פרוטוקול ליצירת פרופיל ביטוי ויישומים של טכניקה זו. כמו תמיד, תודה שצפית!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: How do microarrays measure gene expression?
Microarrays measure gene expression through complementary hybridization between immobilized probes on glass chips and labeled sample nucleic acids. RNA from cells is reverse transcribed to cDNA, then converted to cRNA and labeled with fluorescent molecules. When the labeled sample hybridizes to matching probes on the chip, fluorescence intensity at each spot indicates expression levels for thousands of genes simultaneously.
Q2: What is the difference between microarrays and Northern blotting?
Northern blotting uses free-floating probes to detect RNA immobilized on membranes, while microarrays reverse this arrangement. In microarrays, oligonucleotide probes are immobilized on glass slides, and free-floating labeled cDNA or cRNA samples hybridize to them. This allows microarrays to simultaneously evaluate thousands of genes, whereas Northern blots typically assess one or a few genes at a time.
Q3: Why is RNA quality important before microarray analysis?
RNA quality is critical because RNases—enzymes that degrade RNA—can destroy samples during isolation and preparation. Workspaces and equipment are treated with RNase-inactivating chemicals to protect RNA integrity. Researchers verify RNA quality and concentration through spectrophotometry before converting it to cDNA, ensuring reliable downstream hybridization and accurate gene expression measurements.
Q4: How does microarray data analysis reveal gene relationships?
Microarray data undergoes statistical processing including log2 transformation and normalization to account for signal differences between chips. Researchers then cluster genes based on similar expression patterns across conditions. Dendrograms depict these relationships, showing how closely gene expression patterns match. Clustered genes often participate in the same biological pathways, providing insight into gene networks and functional associations.
Q5: What role do hybridization chambers play in microarray experiments?
Hybridization chambers are formed by placing a mixer onto the microarray chip to create isolated compartments for the hybridization mix. These chambers facilitate controlled binding between labeled sample and immobilized probes. Care must be taken to avoid air bubbles during sample loading, as they interfere with binding and produce false negative signals. Chips are then incubated at appropriate temperatures for up to 24 hours.
Q6: How are microarrays applied to cancer research?
Researchers use microarrays to compare gene expression between cancerous and normal tissues to identify disease biomarkers. For example, scientists compared endogenous retroviruses (ERVs)—viral sequences in human genomes—between prostate cancer and normal tissues. This identified ERVs upregulated in cancer, which can serve as diagnostic biomarkers. Microarrays enable simultaneous evaluation of thousands of genes to pinpoint expression differences associated with disease.
Q7: What does microarray scanning and image processing reveal?
After hybridization, the dried microarray is scanned to produce a digital image showing fluorescence intensity at each probe location. The scanner is adjusted to prevent signal over-saturation. Data-extraction software then analyzes the image for signal irregularities and processes the data through log2 transformation and normalization. This processed data quantifies fold changes in gene expression between experimental conditions.