Question 1

כיצד מודדים מערכי מיקרו-מערכים (microarrays) ביטוי גנים?

Accepted Answer

מערכי מיקרו-מערכים (Microarrays) מודדים ביטוי גנים באמצעות היברידיזציה משלימה בין גששים (probes) מקובעים על שבבי זכוכית לבין חומצות גרעין מסומנות המופקות מדגימות. RNA מתאים מתאים לתהליך של שעתוק הפוך ל-cDNA, ולאחר מכן מומר ל-cRNA ומסומן במולקולות פלואורסצנטיות. כאשר הדגימה המסומנת עוברת היברידיזציה עם גששים תואמים על השבב, עוצמת הפלואורסצנציה בכל נקודה מעידה על רמות הביטוי של אלפי גנים בו-זמנית.

Question 2

מהו ההבדל בין מערכים זעירים (microarrays) לבין נורת'רן בלוט (Northern blotting)?

Accepted Answer

בבדיקת Northern blotting נעשה שימוש בגששים חופשיים כדי לזהות RNA המקובע על ממברנות, בעוד שבמערכי מיקרו-מערכים (microarrays) הסידור הוא הפוך. במיקרו-מערכים, גששני אוליגונוקלאוטידים מקובעים על שקופיות זכוכית, ודגימות מסומנות של cDNA או cRNA חופשיים נקשרים אליהם (hybridize). דבר זה מאפשר למיקרו-מערכים להעריך אלפי גנים בו-זמנית, בעוד שבדיקות Northern blot מעריכות בדרך כלל גן אחד או מספר גנים בכל פעם.

Question 3

מדוע איכות ה-RNA חשובה לפני ניתוח במערכים זעירים (microarray)?

Accepted Answer

איכות ה-RNA היא קריטית מכיוון ש-RNases‏—אנזימים המפרקים RNA—עלולים להשמיד דגימות במהלך הבידוד וההכנה. מרחבי עבודה וציוד מטופלים בחומרים כימיים המנטרלים RNase כדי להגן על שלמות ה-RNA. חוקרים מאמתים את איכות ה-RNA ואת ריכוזו באמצעות ספקטרופוטומטריה לפני המרתו ל-cDNA, ובכך מבטיחים היברידיזציה אמינה בשלבים הבאים ומדידות מדויקות של ביטוי גנים.

Question 4

כיצד ניתוח נתוני מיקרומערכים (microarrays) חושף קשרי גנים?

Accepted Answer

נתוני מיקרומערכים עוברים עיבוד סטטיסטי הכולל טרנספורמציית log2 ונורמליזציה, כדי להתחשב בהבדלי אות בין השבבים. לאחר מכן, חוקרים מקבצים (cluster) גנים על סמך דפוסי ביטוי דומים לאורך תנאים שונים. דנדרוגרמות (Dendrograms) מתארות קשרים אלו ומראות עד כמה דפוסי ביטוי הגנים תואים. גנים המקובצים יחד משתתפים לרוב באותם מסלולים ביולוגיים, דבר המספק תובנות לגבי רשתות גנים וקשרים תפקודיים.

Question 5

מהו התפקיד של תאי היברידיזציה בניסויי מיקרומערכים?

Accepted Answer

תאי היברידיזציה נוצרים על ידי הנחת מערבב (mixer) על שבב המיקרו-מערך (microarray chip) כדי ליצור מדורים מבודדים עבור תערובת ההיברידיזציה. תאים אלה מאפשרים קישור מבוקר בין הדגימה המסומנת לבין הגששים (probes) המקובעים. יש להקפיד על מניעת בועות אוויר במהלך טעינת הדגימה, שכן הן מפריעות לקישור וגורמות לאותים שליליים שגויים (false negative signals). לאחר מכן, השבבים מדגגרים בטמפרטורות מתאימות למשך עד 24 שעות.

Question 6

כיצד מיישמים מערכי מיקרו-מערכים (microarrays) במחקר הסרטן?

Accepted Answer

חוקרים משתמשים במערכי מיקרו-מערכים (microarrays) כדי להשוות בין ביטוי גנים ברקמות סרטניות לרקמות נורמליות במטרה לזהות סמנים ביולוגיים (biomarkers) למחלה. לדוגמה, מדענים השוו רטרו-וירוסים אנדוגניים (ERVs) – רצפים ויראליים בגנום האנושי – בין רקמות של סרטן הערמונית לרקמות נורמליות. השוואה זו זיהתה ERVs בעלי ביטוי מוגבר בסרטן, אשר יכולים לשמש כסמנים ביולוגיים לאבחון. מיקרו-מערכים מאפשרים הערכה סימולטנית של אלפי גנים כדי לאתר הבדלי ביטוי הקשורים למחלה.

Question 7

מה חושפים סריקת מיקרו-מערך ועיבוד תמונה?

Accepted Answer

לאחר ההיברידיזציה, סורקים את המיקרו-מערך המיובש כדי להפיק תמונה דיגיטלית המציגה את עוצמת הפלואורסצנציה בכל מיקום של פרובה. את הסורק מכיילים כדי למנוע רוויה יתר (over-saturation) של האות. לאחר מכן, תוכנה לחילוץ נתונים מנתחת את התמונה לאיתור אי-סדירויות באות ומעבדת את הנתונים באמצעות טרנספורמציית log2 ונורמליזציה. נתונים מעובדים אלו מכמתים את שינויי הקיפול (fold changes) בביטוי הגנים בין התנאים הניסיוניים.

יצירת פרופיל ביטוי עם מיקרו-עריות - חידון הערכה