ניתוח קוד פתוח Single-חלקיק למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם VirusMapper
9 באפריל 2017
כתב יד זה משתמש VirusMapper חבילת תוכנות הקוד הפתוח המבוססת פיג'י ליישם ניתוח חד חלקיקים לתמונות מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה כדי ליצור מודלים מדויקים של מבנה הננומטרי.
המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר מודלים מולקולריים ברמת דיוק גבוהה של נגיפים או קומפלקסים מקרו-מולקולריים על ידי יישום ניתוח חלקיק בודד על תמונות ברזולוציה גבוהה של מבנים עם רכיבים מסומנים פלואורסצנטית. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הווירולוגיה, כולל ארכיטקטורת החלבונים של נגיפים מורכבים, וכיצד זה משתנה במהלך ההדבקה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שעל ידי איסוף תמונות מרובות של אותו מבנה ניתן ליצור מפה ברמת דיוק גבוהה של מרכיביו.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מבנה הנגיפים, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון פתוגנים אחרים וקומפלקסים מקרומולקולריים בתוך תאי יונקים. ראשית, צלם את הדגימה במיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה. רכוש תמונות של מספר שדות ראייה המכילים מאות עד אלפי חלקיקים מופרדים היטב ללא מבנים פלואורסצנטיים לא רצויים.
לאחר קבלת התמונות ועיבודן, ייבא ושרשר את התמונות לערימה עם ערוצים משולבים. במידת הצורך, המירו את התמונה המשורשרת מהיפר-אוסף לאוסף. לאחר מכן, בחר חלץ מבנים ויראליים" בתפריט המשנה VirusMapper והגדר את נתיב הקובץ עבור החלקיקים שחולצו.
מלא את מספר ערוצי הקרינה שצולמו. הגדר את ערוץ הייחוס לערוץ הקרינה שבו לחלקיקים יש את המראה העקבי ביותר. אם לחלקיקים אלה חסר מקסימום מרכזי, יש להחיל טשטוש גאוס לפני הגילוי כדי לגרום להופעת אחד.
לאחר מכן, העריכו את הקוטר בפיקסלים של החלקיקים הגדולים ביותר. הגדר את רדיוס ההחזר על ההשקעה למעט יותר ממחצית ערך זה. הערך את מספר ההחזר על ההשקעה הדרוש לכל מסגרת.
השתמש בלא יותר ממאה החזר ROI בתחילה. הגדר את חפיפת ההחזר המקסימלית על ההשקעה בהתבסס על הפרדת החלקיקים. הצג תצוגה מקדימה של החזר ה-ROI עבור מסגרת זו.
התאם את הרדיוס, מספר ההחזר על ההשקעה והחפיפה המקסימלית כך שכל חלקיק במסגרת יהיה סגור בהחזר ROI יחיד. ודא שהחזר ה-ROI רחב לפחות בכמה פיקסלים מהחלקיקים הגדולים ביותר. לאחר מכן, לחץ על אישור "כדי להפעיל את הפילוח.
סגור את התמונה לדוגמה במנהל החזר ה-ROI לאחר החילוץ. אל תשנה את שמות ערכות החלקיקים שחולצו. בחר צור זרעים"ופתח את התיקיה המכילה את נתוני החלקיקים שחולצו.
הגדר את ערוץ ההתייחסות ובחר את כל הערוצים שעבורם יש ליצור זרע. במידת הצורך כדי להתאים לדגמים קודמים, סובב את הזרעים בתשעים מעלות. עבור ערוצים שבהם החלקיקים חסרים מקסימום מרכזי, הגדל את ערך הטשטוש הגאוסי לפני היישור כמו קודם.
אם הערוצים אינם מיושרים היטב, הפעילו תיקון הזזה לערוצים שאינם ייחוס. חפש ברצף החלקיקים מבנה המופיע באופן עקבי. זהה חלקיק מייצג והזן את מספר המסגרת המתאים בשדה מסגרות לשימוש.
סקור את הזרעים שנוצרו. בחירת זרעים היא שלב קריטי בהליך זה. הצג את הנתונים הגולמיים בקפידה כדי לזהות מבנה אחד או יותר שיש לדגמן.
איכות הדגם תלויה מאוד בבחירת זרעים המשקפים במדויק את המבנים הללו. התאימו את ערוץ הייחוס, את רדיוס הטשטוש הגאוסי ואת תיקון ההזזה לפי הצורך כדי למטב את הזיהוי של מסגרות נוספות עם זרעים דומים. המשך להוסיף מסגרות ולהתאים את פרמטרי היצירה עד שהמבנה הממוצע מייצג בצורה הטובה ביותר מבנה שנצפה בנתונים.
הזן את שם התיקייה ואת קידומת הקובץ עבור הזרעים. לחץ על אישור "כדי לשמור את תמונות הזרע למידול מאוחר יותר. בחר צור מודלים המבוססים על זרעים"ופתח את תיקיית החלקיקים שחולצו.
טען את ממוצעי הזרעים עבור כל ערוץ. אם אתה מבצע גילוי מבנה מבוסס הפניה, בחר ערוץ התייחסות ליישור. מבנה חלקיקים ידוע בערוץ אחד יכול לשמש כהתייחסות ליישור ערוץ שני לא ידוע.
זה מאפשר מיפוי בלתי מוטה של המבנה הלא ידוע. זכור כי יש לתקן את השינוי הכרומטי בין הערוצים מראש. אם הניתוח מחפש הבדלים קטנים או תכונות עדינות במודל, בחר עוצמת תמונה מרובעת במהלך התאמת התבנית.
הגדר את הדמיון המינימלי בין שישים לשמונים אחוז, ואת מספר החזרות לאחד. בחר מודלים וחלקיקים שיוצגו במהלך החישוב, וצור את מודלי התצוגה המקדימה. בדוק את דגמי התצוגה המקדימה.
הגדל את הדמיון המינימלי כך שיכלול רק חלקיקים עם המורפולוגיה הרצויה. בצע אופטימיזציה של פרמטרים אחרים של חישוב המודל לפי הצורך ובחר רכיבים נוספים בתהליך יצירת המודל שיוצגו במידת הצורך. לאחר שדגמי התצוגה המקדימה משביעי רצון, הגדל את מספר האיטרציות לעשר.
קבעו את שם התיקייה ואת קידומת הקובץ. לחץ על אישור "כדי לשמור את ערימות האבולוציה של המודל המכילות את כל האיטרציות של המודל הסופי. נגיף Vaccinia רקומביננטי עם שני חלבונים המתויגים בחלבונים פלואורסצנטיים ירוקים ואדומים צולם על ידי מיקרוסקופ תאורה מובנה ועוצב עם תוסף VirusMapper.
זרעים נוצרו בנפרד עבור האוריינטציה הקדמית והסגיטלית, כל אחד מהם היה בממוצע מחמישה חלקיקים מייצגים. בהתאם לכיוון הנגיף, ניתן להבחין בגוף רוחבי אחד או שניים. לכן, ניתן ליצור מודלים נפרדים לשני הכיוונים.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שאיכות המודלים תלויה במידה רבה באיכות הנתונים הגולמיים שנרכשו. בעוד שניתוח חלקיק בודד יכול להגביר את הדיוק, הוא אינו יכול לפצות על תמונות באיכות נמוכה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע כימות נוסף או התאמת מודל במודלים אלה.
זה יכול לעזור לענות על שאלות נוספות ספציפיות סביב למשל שינויים בקנה מידה ננומטרי בארכיטקטורה הנגיפית במהלך הזיהום. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בתוכנת ניתוח חלקיקים בודדים VirusMapper כדי ליצור מודלים של ארכיטקטורה מולקולרית מתמונות ברזולוציה גבוהה.
סקירה כללית
כתב יד זה מציג שיטה ליצירת מודלים מולקולריים ברמת דיוק גבוהה של נגיפים, באמצעות ניתוח של חלקיקים בודדים על גבי תמונות מיקרוסקופיה ברזולוציית-על. הטכניקה עושה שימוש בתוכנת VirusMapper כדי להעמיק את הבנתנו את הארכיטקטורה הנגיפית והשינויים החלים בה במהלך ההדבקה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- וירולוגיה
- מיקרוסקופיה
- ביולוגיה מבנית
רקע
- ניתוח חלקיקים בודדים מאפשר מידול מפורט של מבנים בננו-קנה מידה.
- מיקרוסקופיית רזולוציה-על (Super-resolution microscopy) מספקת תמונות ברזולוציה גבוהה של רכיבים המסומנים פלואורסצנטית.
- ניתן להחיל את השיטה על מערכות ביולוגיות שונות מעבר לווירוסים.
- הבנת המבנה הוויראלי חיונית להשגת תובנות לגבי מנגנוני ההדבקה.
מטרת המחקר
- ליצירת מודלים מולקולריים מדויקים של נגיפים ושל קומפלקסים מקרו-מולקולריים.
- לחקר הארכיטקטורה החלבונית של נגיפים מורכבים.
- לבחינת שינויים מבניים במהלך ההדבקה הנגיפית.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- רכישת תמונה באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה ברזולוציה גבוהה (super-resolution).
- עיבוד ושרשור תמונות למחבֶר (stack) לצורך ניתוח.
- שימוש ב-VirusMapper לחילוץ מבנים ויראליים ויצירת זרעים (seeds).
- יצירת מודל המבוסס על זרעים נבחרים וזיקוק איטרטיבי.
תוצאות עיקריות
- נוצרו בהצלחה מודלים בעלי דיוק גבוה של מבנים ויראליים.
- אוריינטציות שונות של הנגיף מודלו בנפרד.
- איכות המודלים הייתה תלויה באיכות נתוני הדימוי הגולמיים.
- התקבלו תובנות לגבי שינויים בקנה מידה ננומטרי בארכיטקטורה הויראלית.
מסקנות
- ניתוח של חלקיק בודד משפר את הדיוק של מודלים מבניים.
- VirusMapper הוא כלי בעל ערך לחקר הארכיטקטורה הוויראלית.
- כימות נוסף עשוי לספק תובנות עמוקות יותר לגבי הדינמיקה הוויראלית.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
VirusMapper מאפשר מידול מבני בדיוק גבוה של רכיבים ויראליים מנתוני מיקרוסקופיה ברזולוציית-על, ובכך תומך בתיקוף יעדים בתהליך גילוי תרופות אנטי-ויראליות. באמצעות כימות של ארכיטקטורה בננו-קנה מידה ושינויים קונפורמציוניים, הכלי מספק הפחתת סיכונים מכניסטית לתוכניות וירוסים בשלבים מוקדמים. התוסף בקוד פתוח בעל התפוקה הגבוהה מאפשר יישום בר-הרחבה בקרב צוותי גילוי החוקרים חדירה ויראלית, הרכבה או אינטראקציות בין מאחס לפתוגן.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של ארכיטקטורת חלבונים ויראליים ודינמיקה מבנית במהלך מחזורי זיהום.
- ערך תפעולי: תומך בבחירת מטרות מונחית-היפותזה באמצעות ויזואליזציה ישירה של קומפלקסים מקרו-מולקולריים.
- ערך ניבוי: מייצר מפות מבניות המספקות מידע על נגישות אפיטופים וזיהוי אתרים פוטנציאליים לקישור תרופתי.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- ערך מדעי: מייצר פלטים מבניים כמותיים הניתנים לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- ערך תפעולי: מאפשר הכנה של מודלים ביולוגיים שעברו תיקוף לסריקות תרכובות בהמשך התהליך.
- ערך הפלטפורמה: מקל על שימוש חוזר בתהליכי עבודה של דימיון (imaging) עבור מספר מטרות נגיפיות או מוטציות.
מחקר תרגומי ו-Preclinical
- ערך מדעי: מקשר בין שינויים מבניים בקנה מידה ננומטרי לבין פנוטיפים ויראליים תפקודיים.
- ערך תפעולי: תומך ברצף מהשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות קריאות מבניות עקביות.
- הפחתת סיכונים: מאפשר קבלת החלטות מבוססת נתונים להמשך או הפסקת התהליך (go/no-go), על בסיס יציבות ארכיטקטונית בין זנים או תנאים שונים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
VirusMapper משתלב ברצף הגילוי, החל מזיהוי המטרה ועד לאופטימיזציה של המולקולה המובילה (lead optimization), ומספק תובנות מבניות המכוונות את התכנון של תרופות אנטי-ויראליות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות של מנגנוני הרכבה ויראלית ואינטראקציות עם גורמי מאכסן.
- סריקה: מספקת מודלים מבניים מוכנים לבדיקה עם רזולוציה מרחבית כמותית למחקרי קישור של תרכובות.
- אנליטיקה: מייצרת עידונים חוזרים של המודלים ומדדי דמיון המאפשרים השוואה בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין תצפיות מבניות ליעילות פרה-קלינית באמצעות קורלציה בין ארכיטקטורה לתפקוד.
- שימוש חוזר ארגוני: מספקת פלטפורמה סטנדרטית ובקוד פתוח לוירולוגיה מבנית עבור פרויקטים מרובים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הוודאות לגבי המטרה באמצעות ויזואליזציה ישירה ברזולוציה גבוהה של רכיבים ויראליים.
- ערך תפעולי: מבטיח שחזוריות ויכולת הרחבה באמצעות מיצוי חלקיקים אוטומטי ומודלים איטרטיביים.
- ערך אסטרטגי: מפחית סיכון ביולוגי בבחירת מועמדים מובילים על ידי תיקוף מוקדם של הנחות מבניות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מועמדים anitviral בהתאם לסיכון, בהתבסס על שימור מבני או פגיעות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה ברזולוציה-על (super-resolution microscopy) ובזרימות עבודה של ניתוח תמונות.
- תלוי בגישה לפלטפורמות של תאורה מובנית (structured illumination) או פלטפורמות רזולוציה-על דומות.
- מחייב פרוטוקולים סטנדרטיים לרכישת תמונות לצורך הפרדה עקבית של חלקיקים ואיכות אות.
- כולל תיאום בין צוותים בנוגע לבחירת ערוץ ייחוס ופרמטרים ליצירת גרעינים (seed generation).
- מוגבל על ידי איכות נתוני ההדמיה הגולמיים; לא יכול לפצות על סימון לקוי או רקע גבוה.
