ניתוח קוד פתוח Single-חלקיק למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם VirusMapper

המטרה הכוללת של הליך זה היא לייצר מודלים מולקולריים ברמת דיוק גבוהה של נגיפים או קומפלקסים מקרו-מולקולריים על ידי יישום ניתוח חלקיק בודד על תמונות ברזולוציה גבוהה של מבנים עם רכיבים מסומנים פלואורסצנטית. שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח בתחום הווירולוגיה, כולל ארכיטקטורת החלבונים של נגיפים מורכבים, וכיצד זה משתנה במהלך ההדבקה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שעל ידי איסוף תמונות מרובות של אותו מבנה ניתן ליצור מפה ברמת דיוק גבוהה של מרכיביו.

למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מבנה הנגיפים, ניתן ליישם אותה גם על מערכות אחרות כגון פתוגנים אחרים וקומפלקסים מקרומולקולריים בתוך תאי יונקים. ראשית, צלם את הדגימה במיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה. רכוש תמונות של מספר שדות ראייה המכילים מאות עד אלפי חלקיקים מופרדים היטב ללא מבנים פלואורסצנטיים לא רצויים.

לאחר קבלת התמונות ועיבודן, ייבא ושרשר את התמונות לערימה עם ערוצים משולבים. במידת הצורך, המירו את התמונה המשורשרת מהיפר-אוסף לאוסף. לאחר מכן, בחר חלץ מבנים ויראליים" בתפריט המשנה VirusMapper והגדר את נתיב הקובץ עבור החלקיקים שחולצו.

מלא את מספר ערוצי הקרינה שצולמו. הגדר את ערוץ הייחוס לערוץ הקרינה שבו לחלקיקים יש את המראה העקבי ביותר. אם לחלקיקים אלה חסר מקסימום מרכזי, יש להחיל טשטוש גאוס לפני הגילוי כדי לגרום להופעת אחד.

לאחר מכן, העריכו את הקוטר בפיקסלים של החלקיקים הגדולים ביותר. הגדר את רדיוס ההחזר על ההשקעה למעט יותר ממחצית ערך זה. הערך את מספר ההחזר על ההשקעה הדרוש לכל מסגרת.

השתמש בלא יותר ממאה החזר ROI בתחילה. הגדר את חפיפת ההחזר המקסימלית על ההשקעה בהתבסס על הפרדת החלקיקים. הצג תצוגה מקדימה של החזר ה-ROI עבור מסגרת זו.

התאם את הרדיוס, מספר ההחזר על ההשקעה והחפיפה המקסימלית כך שכל חלקיק במסגרת יהיה סגור בהחזר ROI יחיד. ודא שהחזר ה-ROI רחב לפחות בכמה פיקסלים מהחלקיקים הגדולים ביותר. לאחר מכן, לחץ על אישור "כדי להפעיל את הפילוח.

סגור את התמונה לדוגמה במנהל החזר ה-ROI לאחר החילוץ. אל תשנה את שמות ערכות החלקיקים שחולצו. בחר צור זרעים"ופתח את התיקיה המכילה את נתוני החלקיקים שחולצו.

הגדר את ערוץ ההתייחסות ובחר את כל הערוצים שעבורם יש ליצור זרע. במידת הצורך כדי להתאים לדגמים קודמים, סובב את הזרעים בתשעים מעלות. עבור ערוצים שבהם החלקיקים חסרים מקסימום מרכזי, הגדל את ערך הטשטוש הגאוסי לפני היישור כמו קודם.

אם הערוצים אינם מיושרים היטב, הפעילו תיקון הזזה לערוצים שאינם ייחוס. חפש ברצף החלקיקים מבנה המופיע באופן עקבי. זהה חלקיק מייצג והזן את מספר המסגרת המתאים בשדה מסגרות לשימוש.

סקור את הזרעים שנוצרו. בחירת זרעים היא שלב קריטי בהליך זה. הצג את הנתונים הגולמיים בקפידה כדי לזהות מבנה אחד או יותר שיש לדגמן.

איכות הדגם תלויה מאוד בבחירת זרעים המשקפים במדויק את המבנים הללו. התאימו את ערוץ הייחוס, את רדיוס הטשטוש הגאוסי ואת תיקון ההזזה לפי הצורך כדי למטב את הזיהוי של מסגרות נוספות עם זרעים דומים. המשך להוסיף מסגרות ולהתאים את פרמטרי היצירה עד שהמבנה הממוצע מייצג בצורה הטובה ביותר מבנה שנצפה בנתונים.

הזן את שם התיקייה ואת קידומת הקובץ עבור הזרעים. לחץ על אישור "כדי לשמור את תמונות הזרע למידול מאוחר יותר. בחר צור מודלים המבוססים על זרעים"ופתח את תיקיית החלקיקים שחולצו.

טען את ממוצעי הזרעים עבור כל ערוץ. אם אתה מבצע גילוי מבנה מבוסס הפניה, בחר ערוץ התייחסות ליישור. מבנה חלקיקים ידוע בערוץ אחד יכול לשמש כהתייחסות ליישור ערוץ שני לא ידוע.

זה מאפשר מיפוי בלתי מוטה של המבנה הלא ידוע. זכור כי יש לתקן את השינוי הכרומטי בין הערוצים מראש. אם הניתוח מחפש הבדלים קטנים או תכונות עדינות במודל, בחר עוצמת תמונה מרובעת במהלך התאמת התבנית.

הגדר את הדמיון המינימלי בין שישים לשמונים אחוז, ואת מספר החזרות לאחד. בחר מודלים וחלקיקים שיוצגו במהלך החישוב, וצור את מודלי התצוגה המקדימה. בדוק את דגמי התצוגה המקדימה.

הגדל את הדמיון המינימלי כך שיכלול רק חלקיקים עם המורפולוגיה הרצויה. בצע אופטימיזציה של פרמטרים אחרים של חישוב המודל לפי הצורך ובחר רכיבים נוספים בתהליך יצירת המודל שיוצגו במידת הצורך. לאחר שדגמי התצוגה המקדימה משביעי רצון, הגדל את מספר האיטרציות לעשר.

קבעו את שם התיקייה ואת קידומת הקובץ. לחץ על אישור "כדי לשמור את ערימות האבולוציה של המודל המכילות את כל האיטרציות של המודל הסופי. נגיף Vaccinia רקומביננטי עם שני חלבונים המתויגים בחלבונים פלואורסצנטיים ירוקים ואדומים צולם על ידי מיקרוסקופ תאורה מובנה ועוצב עם תוסף VirusMapper.

זרעים נוצרו בנפרד עבור האוריינטציה הקדמית והסגיטלית, כל אחד מהם היה בממוצע מחמישה חלקיקים מייצגים. בהתאם לכיוון הנגיף, ניתן להבחין בגוף רוחבי אחד או שניים. לכן, ניתן ליצור מודלים נפרדים לשני הכיוונים.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור שאיכות המודלים תלויה במידה רבה באיכות הנתונים הגולמיים שנרכשו. בעוד שניתוח חלקיק בודד יכול להגביר את הדיוק, הוא אינו יכול לפצות על תמונות באיכות נמוכה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע כימות נוסף או התאמת מודל במודלים אלה.

זה יכול לעזור לענות על שאלות נוספות ספציפיות סביב למשל שינויים בקנה מידה ננומטרי בארכיטקטורה הנגיפית במהלך הזיהום. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בתוכנת ניתוח חלקיקים בודדים VirusMapper כדי ליצור מודלים של ארכיטקטורה מולקולרית מתמונות ברזולוציה גבוהה.