יישום של תחמוצת החנקן פלורסנט מקודדים גנטית (NO •) בדיקות, את geNOps, הדמיה בזמן אמת של אותות NO • ב תאים בודדים
16 במרץ 2017
כתב יד זה מציג פרוטוקולים ליישום בדיקות תחמוצת החנקן (NO•) המקודדות גנטית (geNOps) לניטור תנודות NO• של תא בודד בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. היווצרות NO• המופעלת על ידי Ca2+ ברמה של תאי אנדותל בודדים הודגמה על ידי שילוב של geNOps עם חיישן Ca2+ כימי.
המטרה הכוללת של גישת הדמיה זו היא לנטר את אותות תחמוצת החנקן בזמן אמת ברמת התאים הבודדים באמצעות מחלקה חדשה של בדיקות תחמוצת חנקן פלואורסצנטיות מקודדות גנטית, ה-geNOps. בהתחשב בחשיבותה של תחמוצת החנקן בביולוגיה ובפיזיולוגיה, רצויה הדמיה של מולקולה זו ברמה התאית או אפילו התת-תאית מאז שהתגלתה. אנו מדמיינים את אותות תחמוצת החנקן עם בדיקות חדשניות, פשוטות למדי, מבוססות חלבון פלואורסצנטי, ה-geNOps.
ה-geNOps מגיבים ישירות ובאופן מיידי לתחמוצת החנקן על ידי כיבוי פלואורסצנטי. המשמעות היא שאתה יכול לעקוב אחר הקינטיקה בזמן אמת של ייצור, דיפוזיה ופירוק של תחמוצת החנקן בתאים בודדים. היתרון העיקרי של geNOps הוא שאתה למעשה יכול להסתכל על אותות תחמוצת החנקן ברזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונאלי.
התחל הליך זה על ידי החלפת מאגר האחסון של קו תאי האנדותל או תאי HEK293 במיליליטר אחד לבאר של תמיסת מאיץ הברזל (II) בטמפרטורת החדר. דגרו על התאים למשך 20 דקות בדיוק בחושך. הליך העמסת הברזל חיוני כדי לקבל היענות מלאה של הבדיקות ועשוי להיות מותאם לסוגי תאים ויישומים שונים.
לאחר מכן, שטפו את התאים פעם אחת עם מאגר אחסון, ודגרו על כל באר עם שני מיליליטר של מאגר אחסון למשך שעתיים לפחות בטמפרטורת החדר על מנת לאפשר לתאים להתאזן. לאחר מכן, החלף את מאגר האחסון ב-3.3 מיקרו-מולרי Fura-2AM במיליליטר אחד של מאגר אחסון. הגן על התאים מפני אור, ודגר אותם למשך 45 דקות.
לאחר 45 דקות יש לשטוף את התאים פעמיים עם מאגר אחסון, ושוב לדגור אותם למשך 30 דקות לפחות על מנת לאפשר לתאים להתאזן. כדי להתחיל בהליך, יש לתקן תחילה כיסוי בגודל 30 מילימטר המצופה בקו תאי האנדותל או בתאי HEK293 בתא זלוף מתכת. הפעל את מערכת ההדמיה, ולאחר מכן הנח את תא הזלוף המתכתי על המיקרוסקופ.
חבר את צינור הזרם למאגרי החיץ ואז הפעל את מערכת הזילוף. כעת חבר את השטף למשאבת ואקום, הבטיח זרימה עקבית והימנע מניקוז הכיסוי. התחל את הזלוף המונע על ידי כוח הכבידה עם מאגר סידן פיזיולוגי באמצעות מערכת זלוף חצי אוטומטית.
לאחר מכן, הגדר את הגדרות ההדמיה באמצעות התוכנה המתאימה. בחר את אורכי גל העירור 340 ננומטר ו-380 ננומטר עבור הדמיית Fura-2 ו-480 ננומטר עבור G-geNOp מרגש. לאחר מכן, בחרו את אזור ההדמיה על ידי הזזת טבלת ה-xyz של המיקרוסקופ עד שכמה תאים פלואורסצנטיים יהיו ממוקדים.
לאחר מכן, הגדירו את אזורי העניין. צייר את האזורים המכסים מספר תאים פלואורסצנטיים בודדים שלמים עבור כל שדה הדמיה. לאחר מכן, הגדר אזור רקע בגודל דומה.
התחל לאסוף נתונים במיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך ומתקדם עם שלב דגימה ממונע ומקור אור מונוכרומטי. לחלופין, עוררו את התאים ב-340 ננומטר ו-380 ננומטר עבור Fura-2AM ו-480 ננומטר עבור G-geNOp, בהתאמה. הגדר את זמני החשיפה המתאימים כך שניתן יהיה לזהות אות פלואורסצנטי ברור לאורך זמן עבור כל הערוצים.
אסוף את האור הנפלט ב-510 ננומטר עבור Fura-2AM, 520 ננומטר עבור G-geNOp באמצעות מצלמת CCD עם סט מסננים מתאים המורכב ממעורר 500 ננומטר, דיכרואיק של 495 ננומטר ופולט 510-520 ננומטר. לאחר מכן, הקלט פריים אחד כולל כל שלוש שניות. רשום את שלוש הדקות הראשונות במאגר סידן פיזיולוגי כדי לקבל את קו הבסיס של אותות הקרינה המתאימים.
לאחר שנצפתה פלואורסצנטיות בסיסית יציבה, עבור להיסטמין של 100 מיקרו-מולרי או ATP המכיל מאגר סידן פיזיולוגי כדי לעורר את התאים למשך שלוש דקות. לאחר מכן, חזרו למאגר הסידן הפיזיולוגי ללא היסטמין או ATP ו-L-NNA למשך חמש דקות כדי להסיר את התרכובות מהתאים. לאחר מכן, יש לתת NOC-7 של 10 מיקרו-מולרי במאגר הסידן הפיזיולוגי למשך שתי דקות באמצעות מערכת הזילוף.
תורם תחמוצת החנקן משפיע מאוד על הקרינה של G-geNOp, ובדרך כלל הוא מקטין את התאים ביותר מ-20% בתגובה ל-NOC-7 של 10 מיקרו-מולאר. בתאי EA.hy926, אפקט ה-NOC-7 חזק יותר בהשוואה למרווה הקרינה G-geNOp המושרה על ידי אגוניסט. לאחר מכן, שטפו את התרכובת המשחררת תחמוצת החנקן למשך כ-10 דקות עם מאגר הסידן הפיזיולוגי, והפסיקו להקליט לאחר התאוששות הקרינה הבסיסית.
מוצגות כאן תמונות הקרינה המייצגות בשדה רחב של תאי EA.hy926 המבטאים G-geNOp הטעונים ב-Fura-2AM. והנה, מהלך הזמן המייצג של ההקלטות הסימולטניות של אותות Fura-2 ו-G-geNOp בתגובה להיסטמין של 100 מיקרו-מולרי. כאמור, היסטמין הוסר לאחר שלוש דקות באמצעות מערכת זילוף.
עקומות אלה מייצגות את ההקלטות בו-זמנית של אותות סידן ציטוזולי ותחמוצת החנקן של תא אנדותל יחיד טעון Fura-2AM המבטא באופן זמני G-geNOp. התאים עוררו עם היסטמין של 100 מיקרו-מולרי למשך שלוש דקות במאגר המכיל סידן. ומוצגים כאן, הם אותות הסידן ותחמוצת החנקן שהוקלטו בו זמנית לאורך זמן של תא EA.hy926 שטופל מראש ב-500 מיקרו-מולרי L-NNA לפני המדידה.
התאים טופלו בהיסטמין 100 מיקרו-מולרי בנוכחות סידן דו-מילימולר. נתונים אלה מציגים את העקומות הממוצעות המייצגות אותות תחמוצת חנקן ציטוזולית בתגובה ל-ATP מיקרומולרי אחד ואחריו גירוי תא שני עם ATP של 100 מיקרומולרי. לאחר שליטה, טכניקה זו מאפשרת לך לדמיין אותות תחמוצת החנקן בזמן אמת במינימום מאמץ.
אני מאמין שטכניקה זו תסלול את הדרך לחוקרים לחקור ולחקור מחדש אותות תחמוצת החנקן במודלים שונים של תאים. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד להשתמש בטכנולוגיית geNOps להדמיה בזמן אמת של תחמוצת החנקן במערכת המודל שלך.
סקירה כללית
כתב יד זה מציג פרוטוקולים לשימוש בגששים המקודדים גנטית לחנקן חמצני (geNOps) לצורך ניטור תנודות של NO• בתא בודד בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. המחקר מדגים ויזואלית יצירה של NO• המופעלת על ידי Ca2+ בתאי אנדותל בודדים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית
רקע
- חמצן חנקתי ממלא תפקיד מכריע בתהליכים ביולוגיים שונים.
- ויזואליזציה בזמן אמת של NO• ברמה התאית הייתה מטרה רב-שנתית.
- גששים מקודדים גנטית מספקים גישה חדשנית לניטור דינמיקת NO•.
- ניתן להשיג רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונבנציונלית.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקולים לדימוי בזמן אמת של אותות חנקן חמצני בתאים בודדים.
- שימוש ב-geNOps לניטור ייצור, דיפוזיה ופירוק של NO•.
- העמקת ההבנה לגבי תפקידו של החנקן החמצני בשיגנול תאי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של קו תאי אנדותל או תאי HEK293 עם תמיסת בוסטר של iron(II).
- שימוש ב-Fura-2AM לדימוי סידן במקביל ל-geNOps.
- מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ללכידת נתונים בזמן אמת על אותות NO• וסידן.
- גירוי של תאים באמצעות histamine או ATP כדי לצפות בתגובת NO•.
תוצאות עיקריות
- הדמיה מוצלחת של אותות תחמוצת החנקן בזמן אמת.
- הדגמת ההשפעות של היסטמין ו-ATP על ייצור NO•.
- קביעת קו בסיס לאותות פלואורסצנציה לפני ואחרי גרייה.
- הצגת תגובתיות של geNOps לתורקי תחמוצת חנקן.
מסקנות
- טכנולוגיית ה-geNOps מאפשרת דימות יעיל של תחמוצת החנקן בזמן אמת.
- שיטה זו יכולה להקל על מחקרים נוספים של שסמני תחמוצת החנקן במודלים תאיים שונים.
- מחקרים עתידיים עשויים לבחון את ההשלכות של NO• בהקשרים פיזיולוגיים שונים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימוי בזמן אמת של דינמיקת תחמוצת החנקן (NO•) ברמה של תא בודד נותן מענה לפער קריטי בהבנת אירועי איתות מהירים הרלוונטיים לביולוגיה של מחלות ולגילוי תרופות. פלטפורמת geNOps מאפשרת כימות ברזולוציה גבוהה של ייצור ופירוק של NO•, ובכך תומכת בהורדת סיכונים מכניסטיים ובתיקוף מטרות בשלבי הגילוי המוקדמים. יכולת זו מגבירה את הביטחון החזוי עבור מיון פורטפוליו והמשכיות של מחקרים תרגומיים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר ויזואליזציה ישירה של קינטיקת איתות של NO• בתאים חיים לצורך בחינת מטרות תפקודיות.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים באמצעות כימות תגובות NO• תלויות-גירוי ברמת התא הבודד.
- מסייע בהבהרת מסלולים על ידי קרילציה בין תנודות ב-NO• לבין טריגרים מרחוק, כגון זרימה פנימה של Ca2+.
- משפר את הביטחון החזוי בקידום מטרות המווסתות NO•.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכת גששים מקודדת גנטית ומאומתת לזיהוי הדיר של NO• במודלים תאיים מגוונים.
- מאפשר קריאות כמותיות בזמן אמת המתאימות לסטנדרטיזציה של בדיקות ולתהליכי סינון המשך.
- תומך בדימות של שני פרמטרים במקביל (למשל, NO• ו-Ca2+) לפיתוח בדיקות מולטיפלקס.
- מקל על הערכה מהימנה של תרכובות תורמות NO• ומודולטורים של מסלולי אות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מערכות רלוונטיות למחלה על ידי מתן אפשרות לניטור NO• בסוגי תאים רלוונטיים פיזיולוגית.
- תומך בפיתוח ביומרקרים טרנסלציונליים על ידי קישור הדינמיקה של NO• לתוצאות תאיות תפקודיות.
- מספק רצף משלב הגילוי ועד לאימות פרה-קליני עבור מנגנונים הקשורים ל-NO•.
- מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם סיכונים בהסתמך על נתונים כמותיים של איתות NO•.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
טכנולוגיית ה-geNOps משתלבת ברצף הגילוי, החל ממחקרי מנגנון מוקדמים, דרך פיתוח בדיקות ועד למחקר תרגומי.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בבדיקת היפותזות ובמיפוי מסלולים על ידי אפשור כימות של אות NO• בזמן אמת.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך הערכת תרכובות ובדיקת מוכנות של המערך.
- אנליזה: מספקת נתונים זמניים ומרחביים ברזולוציה גבוהה לצורך ניתוח השוואתי של תגובות NO•.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין שלב הגילוי לשלבים הפרה-קליניים על ידי אפשור ניטור NO• במודלים רלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה מודולרית, מקודדת גנטית, הניתנת להתאמה לסוגי תאים ולהגדרות ניסיוניות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במסלולים הקשורים ל-NO•.
- ערך תפעולי: מסנכרן את גילוי ה-NO• באמצעות פרוטוקולים ניתנים לשחזור ובנייה (scalable) עבור צוותי מו"פ מגוונים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ומשפר את יעילות ההון על ידי אספקת מדדים תפקודיים חסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות ותרכובות מווסתות NO• בהתאם לסיכון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ובדימות תאים חיים.
- נדרשת גישה למערכות דימות מתקדמות עם סטים מתאימים של מסננים ותוכנה.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי טעינת הגשושית והדימות.
- ייתכן שיהיה צורך בהתאמה עבור סוגי תאים שונים או תנאים ניסיוניים שונים.
- התגובתיות של הגשושית תלויה בטעינת ברזל ובגורמים ספציפיים לתא.
